JPS6185326A - 抗ヒト単鎖ウロキナ−ゼ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ハイブリドーマを用いてのヒト単鎖ウロキナ
ーゼに対するモノクローナル抗体に関するものである。

ウロキナーゼはヒト尿あるいはヒト由来細胞培養液に含
まれる繊維素溶解酵素であり、その製剤は、血栓症や心
筋梗塞の治療薬として広く使用されている。従来、ウロ
キナーゼについては高分子型ウロキナーゼ（ＥＣ：　３
．４．９９．２６）、およびその分解産物の低分子型ウ
ロキナーゼ（ＥＣ：　３．４．９９．２６　）がよく知
られている。それらの分子構造については高分子ウロキ
ナーゼは２０にダルトンのＡ鎖および糖と２，４２７ダ
ルトンの小はプチドを含有している３１にダルトンのＢ
鎖より構成されており、ＳＨ試薬存在下でＡ鎖と低分子
ウロキナーゼと呼ばれているＢ鎖に解離する（　Ｇｕｎ
ｚｌｅｒら、Ｈｏｐｐｅ　−Ｓｅｙゴｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　３６３．１３３−１４
１．１９８２　）。

更に最近、ＳＨ試薬存在下でＭ離しない単鎖ウロキナー
ゼ（分子量、５３−５６にダルトン）がヒト尿中（Ｈｕ
ｓａｊｎら、Ａｒｃｈ、　ＩＨｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、。

２２０、３１−３８．１９８３　）およびヒト表皮細胞
Ｈｍｐ３の培養液中（Ｗｕｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、、　
Ｃｈｅｍ、＋　２５＋　７２６２−７２６８．１９８２
　）に存在することが報告されており、Ｓａｌ、ｅｒｎ
Ｏら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ
。

ＵＳＡ、　ａｌ、　１１０−１１４．１９ａ４）はこの
単鎖ウロキナーゼを高分子ウロキナーゼの前駆体と推定
している。この単鎖ウロキナーゼの酵累学的諸性質はヒ
ト尿高分子ウロキナーゼのそれぞれと比較して比活性（
約２０．０００　Ｉｕ／Ｑたん白質）は低いが、フィブ
リン結合能および血栓溶解能が高く、シたがって血栓溶
解時間も短かいといわれている。

本発明は、従来の高分子および低分子ウロキナーゼと酵
素学的諸性質の異なる単鎖ウロキナーゼの精製処理にお
いて使用する抗単鎖つ、ロキナーゼモノクローナル抗体
に関するものである。

すなわち本発明により、ハイブリドーマによるＩｇＧク
ラス抗単鎖ウロキナーゼ抗体およびその製造方法が提供
される。さらに詳しく言えば、本発明は、輩ｊ物をヒト
尿単鎖ウロキナーゼで免疫し、該■０１物からの抗ヒト
単鎖ウロキナーゼ抗体産生細胞とミエローマ細胞により
ハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクロー
ン化し、ついで単鎖ウロキナーゼに対し反応性を有する
抗１１’Ｌ鎖ウロキナーゼ抗体を産生ずるクローンを選
択し、培養することからなるＩｇ（）クラス抗ヒト単鎖
ウロキナーーピ抗体の製造法およびこのようにして（ｊ
ｉられた抗体、すなわちヒト単鎖ウロキナーゼに存在す
る神々の抗原決定基のうちのいずれか一つの抗原決定基
のみに免疫交差反応性を有する各単クローン性抗体を提
供するものである。」υ下、実施例により、本発明をさ
らに詳細に説明する。

実施例　１ （ａ）　　抗原−単鎖ウロキナーゼの調製ヒト男性健常
人尿を公開特許公ｔｌ昭５５−５６８１）のアール・ジ
エイコブ・ブラックストンの方法によシ、イオン交換樹
脂を用いて濃縮し、Ａｒｃｈ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、、　２２０　、３１−３８（１９８３）
に記載のＨｕｓａｉｎらの方法を若干改変した方法によ
り精製した。すなわち、濃縮法をフィブリンをコートし
たセライトカラムによるアフィニティークロマトグラフ
ィー、次いでＡＣＡ５４　（ＬＫＢ社）によるゲルろ適
法により精製した。同酵素最終標品をＪ、　Ｖｉｒｏｌ
、　１０．２１１−２１９（１９７２）記載のＢａｕｍ
らの方法に従い、０１Ｍ１Ｍブチオスレイトール下、ド
デシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアソドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で調べたところ、５５にのメイ
ンバンドが検出されたが、その純度は＃Ｊ　６０　％で
あった。捷だ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８２＋　１４
９５−１４９８（１９７７）記載のＭＯｒｊ　ｔａらの
方法［Ｊ：リグルタリルークリシルーＬ−アルギニン−
４−メチルクマリル−７−アミドを基質に、同酵素活性
を螢光測定ｌ−だところ、比活性は１．２ｕ／Ｑであっ
た。

（ｂ）　　抗体産生細胞の調製 ８週令のＩ３ａ　］、ｂ　／　Ｃ雌マウス３匹を１ず完
全フロインドアジュバント中、ヒト単鎖ウロキナーゼで
初回免疫する。マウスにそれぞれ１４５μ７のヒト単鎖
ウロキナーゼを０．５　ｍｌのけん濁液として腹腔内投
与する。さらに、３０日目に生理食塩水に溶解した１４
５μ２のヒト単鎖ウロキナーゼを追加免疫する。最終免
疫として５８日目に静脈内投与（１４５μｆ／１８０μ
を生理食塩水）により補助免疫し、６日後にマウスを殺
して肺臓を取り出し牌細胞を調製する。

（ｃ）　　ミエローマ細胞の調製 使用するミエローマ細胞は特定されない。マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヒトなどの動物の細胞株などはいずれも適
用することができる。使用する細胞ラインは薬剤耐性の
ものであって、使用培地においてミエローマ細胞が生存
せず、ノ＼イブリドーマが生存するものである。最も普
通に用いられる細胞ラインは、８−アザグアニン耐性株
でヒポキサンチンーグアニンホスホリポシルトランスフ
エラーセ（ｎｏｐＲＴ）を欠損し、ヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン（１■ＡＴ）培地に生育し得な
い性質のものである。たとえば、マウスミエローマＭＯ
ＰＣ−２１ライン由来のＰ６−ＮＳ１−１−　Ａｇ４−
１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ、Ｐ６−Ｘ６−３−Ａ
ｇ８−６．、５．、３、ＳＰ２１０−Ａｇ１４、Ｆｏ、
Ｓ　１９４１５ＸＸＯ。

ＢＵ、１を用いることができる。ここではＰ３−ＮＳ１
−１−Ａｇ４−１株を使用したが、融合前細胞数を２×
１０５〜３Ｘ１０５個／ｍ７！り上の濃度に々らないよ
うに注意を払いできるだけ生細胞率を高めた。まり、ミ
エローマ細胞株の中には、Ｈ鎖やＬ鎖を合成するものが
あるが、このような細胞株を使用すると抗体産生細胞の
合成するＨ鎖やＬ鎖と捷しりあったハイブリット抗体分
子ができるのでＨ鎖やＬ鎖を合成しないものが望捷しい
。

（ｄ）細胞融合 り下の材料および方法を用いる。

ＲＰＭＩ　１６４０培地：　ＲＰＭＩ扁１６４０（Ｆ］
ｏｗＴ＋＆１）０１”ａＬＯｌｌ　ｅＯ）に重炭酸すト
リウム（１２ｍＭ）、ピルビン酸すトリウム（１１ｎＭ
　Ｌ　　’ニジリンＯカリウム（５０ｕ／＋ｎｌり、硫
酸ストレゾトマソ／（５０μ９／ｒｙｅ　）、および硫
酸アミカシン（１００μｆ／ｍ／）を加え、１・゛ライ
アイスでｐＨを７２に調製し、０２μｍＴｏｙｏメンブ
レンフィルターで除菌沢過する。

Ｎ５−１培地：上記のＲＰＭＩ　−１６４０培地に除菌
沢過した仔牛脂児血清（Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ）を１５％（ｖ／ｖ）の濃度に加え調製した。

ＴＩＡ’ｌ’培地：」１記のＮ５−１培地にさらにヒボ
キサンチン（１００μＭ）、アミノゾテリン（０４μＭ
）、およびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＨＴ培地：アミノゾテリンを除去した以外は、上記のｌ
＋ＡＴ培地と同一組成のものである。

ＰＦ２Ｇ　４．ＯＯＯ溶液：ＲＰＭ１１６４０培地のポ
リエチレンダリコール４，０００　（ＰＥＧ　４，００
０Ｍｅｒｃｋ）　５Ｑ％（Ｗ／Ｗ）無血清溶液を調製す
る。

８−アザダアニン耐性骨髄腫細胞Ｎ５−ｉ　（Ｐ３−Ｎ
Ｓ１−１−Ａｇ４−１）との融合はＳｅ１．ｅｃｔｅｄ
　Ｍｅｔｈｏｄｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　　（ｅｄ、Ｂ、Ｂ　Ｍｉｅｈｅｌ〕ａｌｌ
ｄ　　Ｓ、Ｍ、　　　Ｓｈｊｉｇｊ）、　　Ｗ、Ｈ，Ｆ
ｒｅｅｍａｎ　　ａｎｄ　　Ｃａｍｐａｎｙ（１９８［
１）、３５１−３７２に記載のＯｊらの方法を若干改変
して行った。２．８５Ｘ１０８個の有核肺臓細胞（生細
胞率９９％）を５．７Ｘ１０７個の骨髄腫細胞Ｎ５−ｉ
株（生細胞率１００％）と融合する。肺臓細胞と骨髄細
胞とを別々に上記のＲＰＭＩ−１６４０培地で洗滌し、
同じ培地を用いてけん濁し、両者を上記の割合で混合す
る。容ｆｔ　ｓ　ｏ　ｍｅの円錐形スチロール樹脂製試
験管（ＣｏｒｎｊｎＢ　ＧｌａｓｓＷｏｒｋｓ　）　ｆ
用い、４０ｍ１のＲＰＭＩ−１６４０培地中４００×２
．１０分間遠心し、上澄液を完全に吸引除去する。沈殿
細胞に３７′Ｃ加湛ＰＩ’：Ｇ　４，０００溶液１．９
　ｍｌを、穏やかに攪拌しながら１分間で滴下し、さら
に１分間攪拌し、細胞を再けん濁、分散させる。次に３
７℃加渇ＲＰＭＩ−１６４０培地１９ｒｎ！、ヲ、１分
間で滴下する。この培地の滴下操作を更に１回繰返した
後、更に同培地１３．３ｍ／を２−６分間で常に攪拌し
ながら滴下し細胞を分散させる。これを４００Ｘｌ、１
０分間遠心分離し、上澄液を完全に吸引除去する。次に
沈殿細胞に、６７℃加淘Ｎ５−１培地１９ｍｅをすみや
かに加え、細胞の大きい塊りを１０ｍｅのビｇツトを用
いて注意深くピペッティングして分散する。更に同培地
３８　ｍｌを加え希釈し、７１？リスチレン製９６穴マ
イクロウエル（Ｃｏｒｎｊｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋ
ｓ）にウェル当り６．０Ｘ１０５個／　０．１　ｍｌの
細胞を捷き込む。

なお、この９６穴マイクロウエルは前処理として０．２
　ｍｅのＮＥＩ−１培地を加え、炭酸ガス培養器中（３
７℃）で−晩保濡し、使用時に培地を吸引除去したもの
を用いる。細胞融合完了したマイクロウェルを、７％炭
酸ガス７９３％空気中で温度３７℃、湿度１００・チ下
にインキュベートする。

（θ）　選択培地によるノ＼イブリドーマの選択的増殖 培養１日日に、パスツールピズットで）ＩＡＴ培地２滴
（約０．１　ｍｌ　）を加える。２．３．５．８．１１
日目に培地の半量（０１ｍ１　）を新しいＨＡＴ培地で
置き換える。１４日目にＨＴ培地に切換えり降ろないし
４日毎に、上記同様に半量の置き換え操作を繰シ返す。

通常２々いし５週間で充分なノ＼イブリドーマの生育が
観察される（融合率１００％）・ ハイブリドーマ生育全ウェルについて次項記載の固相−
抗体結合テスト法により陽性ウェルをチェックする。４
６個１５７６ウエルが陽性として検出された。次にフィ
ーダとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むＩＴ培地１
πｅをポリスチレン製２４穴セルウエル（Ｃｏｒｎｊｎ
ｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ　）に加えたものを用い、
上記で検出された各陽性ハイブリドーマ４６個の全内容
物を移す。これを前記（ｄ）におけると同様に、７％炭
酸ガス存在下、６７℃で約１週間インキュベ−１・する
。その間１〜２回各ウェルの、、Ｊ二’Ｋｔ、　０．５
　ｍｅを、新しいＨＴ培地０．５　ｍｌと交換する。ハ
イブリドーマの充分生育した時点で、固相−抗体結合テ
スト法により陽性をチェックし、その陽性のものについ
て、限界希釈法によりクローニングを行う。なお、クロ
ーニングに使用した後の残液を、ポリスチレン製２５ｍ
２組織培養フラスコ（ＣｏｒｎｉｎｇＧｌａｓｓ　Ｗｏ
ｒｋ日）に移し、凍結保存用試料を調製する。

（ｆ）　　固相−抗体結合テストによる抗単鎖ウロキナ
ーゼ抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａ１．．　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　１０４．２０５−２
１４　（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒａらの方法を
若干改変した方法により、９６穴ミクロタイトレーンヨ
ンプレート（Ｆｌｏｗ　Ｌａ１）ＯｒａｊＯｒｊ［］［
］、　Ｉｎｃ、）を０５μ２の単鎖ウロキナーゼでコー
トし、さらにその他を１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
でブロックする。これにハイブリドーマ生育ウェルの上
澄液の一部を加えて室温で釣１時間インキュベートする
。２次抗体として西洋わさびはルオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウスイムノグロブリン（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、）
を加え、さらに室温で約１時間インキュに一部する。次
に過酸化水素と基質であるＯ−フェニレンジアミンを加
え、生成した褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、
あるいは、ａｎａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１：２６．１５６−１６４　（１９
８２）に記載のＬａｎＺｉ　１１０らの方法に従い、１
．６Ｎ硫酸でズルオキシダーゼ活性を停止させた各ウェ
ルの反応液１５０μを毎を、１ｍｌの蒸留水で希釈し、
島津デジタルダブルビーム分光光度計（ＵＶ−１５０−
０２型）を用いて４９２ｎｍで吸光度を測定した。

伝）　クローニング 前記（ｅ）の各ウェル中には２種り」二のハイブリドー
マが生育している可能性があるので、限界希釈法により
クローニングを行いモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマを取得する。Ｎ５−１培地−当りフィダーとして１
０７個のマウス胸腺細胞を含むクローニング培地を調製
し、９６穴マイクロウエルの３６．６６および２４ウエ
ルにウェル当り５個、１個および０５個のハイブリドー
マをカロえる。５日、１２日日日約０１−のＮＥＩ−１
培地を追加する。クローニング開始後１４ないし１５日
で、充分なハイブリドーマの生育が認められ、コロニー
形成陰性ウェルが５０％ｖ上である群について固相−抗
体結合テストを行う。テストした全ウェルが陽性でない
場合、抗体陽性ウェル中のコロニー数を確認し、ウェル
中に１コロニーのウェルを４〜６個選び、再クローニン
グする。最終的に１８個の単クローンを得た。

（）〕）　　単クり−ン抗体のインビトロ増殖およびイ
ンビボ増殖 単クローン抗体は、得られた単クローンをＭＳ−１培地
などの適当な培養液で培養（インビトロ増殖）シ、その
培養上澄液から得ることができる（単クローン抗体たん
白濃度は１０−１００μ２７　ｍｅ　）。一方、大索に
抗体を得るためには牌細胞とミエローマ細胞の由来動物
と同系の動物（Ｂａ１ｂ／ｃマウス雌）に腫瘍形成促進
剤ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル２ン
タデカン；Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍ
ｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、）　ｆ　？ウスー匹当り０．５　
ｒｎＩ！腹腔内に投与する。１〜３週間後にハイブリド
ーマＩ　Ｘ　１０７個を同じく腹腔内に投与することに
よりインビボ゛で１〜２週間後に、単クローン抗体たん
白質濃度４〜７Ｑ／ｍ／！の腹水を得ることができる。

（コ）　　単クローン抗体の重鎖、軽鎖のアイソタイプ
上記（ｈ）で得られた各々の腹水を先ず単鎖ウロキナー
ゼをコートしたミクロタイトレージョンプレートに加え
、固相−抗体結合テストについて前期（ｆ）で述べたよ
うに結合させる。洗滌後、アイソタイプ特異性ウサギ抗
マウスＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）を加える。洗滌後、西洋わさびはルオキシダーゼ標
識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質とし
て２，２′−アジノージ（３エチルベンゾチアゾリン硫
酸−６）および過酸化水素を用いてアイソタイプを検出
した。その結果をまとめて第１表に示した。調べた抗体
の内１５個は免疫グロブリン鎖γ１／にを、６個が１２
ａ／にを有していた。

実施例　２ 単クローン抗体の精製 前記（ｂ）で得られた腹水中には、単鎖ウロキナーゼと
関連のない宿主動物由来の抗体も含有されているが、エ
ンザイムノアツセイに際して数万倍〜数１０万倍に希釈
して用いる場合には間題にならない場合が多い。しかし
、必要に応じて腹水を硫安分画（４０％飽和）後、ＤＥ
ＡＥ　−５ｅｐｈａｃｅ：＋　（ＰｈａｒｍａＣ’ｌａ
　Ｆｊｎｅ　Ｃｈｅｍｊｃａ］ｓ）　Ｋよるイオン交換
カラムクロマトグラフィー法単独、あるいは５ｅｐｈａ
ｃｒｙｌ　Ｓ−３００Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によるゲル濾
過法の組合わせにより精製することができる。得られた
抗体の内ＩｇＧＩクラスおよびＩｇＧ２ａクラスは、食
塩０．０６Ｍを含む４０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液、ｐＨ８，
０で平衡化したＤＢＡＥ−５ｅｐｈａｃｅｌ　（１，５
Ｘ２５．５ｏ＋＋　）カラムの非吸着画分に得られ、カ
ラムに吸着したマウス由来のたん白質と分離できた（第
１図）。このＩｇ画分をさらに０．４２Ｍ食ｊ語を含む
５０ｍＭＩＪン酸緩衝液、ｐＨ７，４で平衡化した５ｅ
ｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００５ｕｐｅｒｆｉｎｅカラム
（１，５Ｘ９Ｄ、Ｏｍ）でゲル濾過した（第２図）。

このようにして精製したＩｇＧＩクラスおよび■ｇｃ１
２ａクラスの純度をＳＤＳ　−ＰＡＯＫで分析したとこ
ろ分子量！ＬＪ５４　Ｋ　Ｆ　１．１鎖）、および＃２
４Ｋ（Ｔ、鎖）の２つのメインバンドが検出された。

実施例　ろ 単クローン抗体の結合能と特異性 り上のようにして精製した単クローン抗体の力価を、固
相−抗体結合テスト法により１ｌｌｌ＋定した。なお、
酵素標識第２抗体としてＩｇＧクラスのものには西洋ワ
サビにルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス１ｇ（）　（Ｔ
ＡＧＯ，Ｉｎｃ、Ｊを用いた。９６穴ミクロタイトレー
ジヨンプレートの各ウェル中に生成した褐色の反応液を
（ｆ）固相−抗体結合テストの項に記載の方法に従って
分光光度計で４９２ｎｍでの吸光度を測定した。その結
果を第３Ａ図、３Ｂ図および３０図に示した。

得られた１８個の単クローンの内５−１１４４．５−１
７Ｆ６および５−１６Ｄ５が固相化抗原との結合能が強
く、検出限界は、抗体量０．２５−０．５ｎｇであった
が、５−３Ｂ４．５−２ＣＩ２．５−８Ｆ１．５−５１
．５−１２１Ｊ、５−１０Ｔ（５，５−１５Ｆ’１２お
よび５−１８１！’１２においては、測定した抗体量０
．２２５−５ＱＯｎの範囲では、それらの結合能は、前
グループよりも弱く検出限界は、１−５　ｎｇであった
。５−４Ｇ３．５−６Ｆ４．５−７Ｅ９．５−１１Ｄ７
．５−９’に３．５−１３０１１および５−１４７）６
　においては結合能Ｖｉ４ｉｔめで弱かった。

実施例　４ 単クローン抗体による単鎖ウロキナーゼ活性の阻害 精製単クローン抗体の抗ヒト単鎖ウロキナーゼ活性は実
施例１（ａ）抗原−単鎖ウロキナーゼの調製の項に記載
のＭＯｒｉｔａらの方法に従った。すなわち、基質とし
てグルタリル−グリシル−Ｌ−アルギニン−４−メチル
クマリル−７−アミド（はプチド研究所製）を用い、試
験管当り０．１６ｍＵの単鎖ウロキナーゼにモル換算で
１００倍量の各単クローン抗体を加え、３７℃、３０分
間プレインキュベイジョンし、次いで上記基質を加えて
更に３７℃、２０分間インキユズイションし、た。生成
した７−アミノ−４−メチル−クマリン（ＡＩＪＣ）を
、日立螢光光度計２０４型を用い、その螢光強度を測定
した。酵素活性は６７℃、１分間に１μｍｏ１ｆｌｉの
遊離ＡＭＣを１単位とした。なお、比較のため抗ヒト尿
高分子および低分子ウロキナーゼ（ＰＣ：　３．４．９
９．２６．、比活性〉６０．０００１．Ｕ、７ｍｇたん
白質、ミドリ十字社製）活性も測定した（第２表）。調
べた１８種類の単クローン抗体の内クローン５−５Ｅ６
．５−６Ｆ、４．５−１７Ｆ’６および５−１４Ｄ６が
単鎖ウロキナーゼ活性を３０−４０％阻害した。なお、
高分子ウロキナーゼ活性および低分子ウロキナーゼ活性
ね、それぞれクローン５−７Ｆｉ９．５−１７Ｆ６およ
び５−１４Ｄ６らで６０〜５０％阻害された。またクロ
ーン５−１４Ｄ６のみは単鎖ウロキナーゼ、高分子ウロ
キナーゼおよび低分子ウロキナーゼのいずれも約５０％
阻害した。

実施例　５ 単鎖ウロキナーゼ、高分子ウロキナーゼおよび低分子ウ
ロキナーゼの各単クローン抗体との結合能 各単クローン抗体の単鎖ウロキナーゼ、ヒト尿高分子ウ
ロキナーゼ、同低分子ウロキナーゼ（ミドリ十字社製）
との結合能を調べた。

（ｆ）固相−抗体結合テストによる抗単鎖ウロキナーゼ
抗体産生バイブリド゛−マの検索の項に記載の方法を若
干改変した方法を用いた。すなわち９６穴ミクロタイト
レージヨンプレー１・の各６穴を５μ７の各精製単クロ
ーン抗体でコートし、そノｌ、ぞれ０５μ７のｔ）１鎖
ウロキナーセおよびヒト尿高分子ウロキナーゼ、同低分
子つロキナーセヲ７ＪＤ　ｔ　インキユベーンヨンした
。各単りローノ抗体に対するそれぞれのウロキナーゼの
結合状態を第４図に示した。クローン５−１８Ｆ１２．
５−２ｃ１２．５−３Ｂ４．５−９１１：３．５−１．
りＤ５および５−１１Ｄ７は、単鎖ウロキナーゼのみと
結合した。クローン５−ＩＨ４，５−４Ｃ１３，５−５
Ｆ、６．５−６Ｆ、４．５−１５Ｆ’１２．５−８Ｆ’
　１．５−１７Ｆ’６および５−１０Ｈ５は単鎖ウロキ
ナーゼおよび高分子ウロキナーゼの両者と反応したが、
低分子ウロキナーゼピとは反応しなかった。

したがって、これらのクローンはＧ１１Ｈｚｌｅｒらの
報告（ＩＪｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓ
ｊｏ］、　Ｃｈｅｍ、＋６６５１３５−１４１．１９８
２１にあるウロキナー七八鎖の抗１１１１決定基を認識
しているものと思われる。

次にクローン５−７Ｅ９．５−１２Ｅ１および５−１４
Ｄ６は単鎖ウロキナーゼ、高分子ウロキナーゼおよび低
分子ウロキナーゼ全てと反応した。このことはウロキナ
ーゼＢ鎖の抗原決定基を認識するものと思われる。

第　　１　　表 ５−１８Ｆ１２　Ｉｇ（）　　ＩｇＧ１　　γ１／に５
−ＩＨ４ＩｇＧ　　ＩｇＧ２ａ　　ｒ２ａ／ｇ５−４０
ろ　　　　　ＩｇＧ　　　　　ＩｇＱｌ　　　　　　γ
１／に５−２Ｃ１２ＩｇＧ　　ＩｇＧ１　　γ１／に５
−５に６　　工ｇＧ　　ＩｇＧ２ａ　　ｒ２ａ／＆５−
６Ｅ４　　工ｇＧ　　ＩｇＧ１　　γ１／に５−１５Ｆ
１２　ＩｇＧ　　Ｉｇ（］１　　γ１／に５−３Ｂ４　
　ＩｇＧ　　ＩｇＧ１　　γ１／に５７Ｅ９　　ＩｇＧ
　　ＩｇＧ１　　γ１／に５−８ＦＩ　　ＩｇＧ　　Ｉ
ｇＧ１　　γ１／に５−９Ｅ３　　工ｇＧ　　１ｇＧ１
　　γ１／に５−１６Ｄ５　　ＩｇＧ　　ＩｇＧ１　　
γ１／に５１７Ｆ６　　ＩｇＧ　　ＩｇＧ２ａ　　ｒ２
ａ／ｃ５−１０Ｈ５工ｇＧ　　ＩｇＧ１　　γ１／に５
１１Ｄ７　　工ｇＧ　　１ｇＧ１　　γ１／に５１２Ｅ
Ｉ　　Ｉｇ（ｌ　　ＩｇＧ１　　γ１／に５−１３Ｇ１
１　ＩｇＧ　　ＩｇＧ１　　γ１／？５−１４Ｄ６　　
ＩｇＧ　　ＩｇＧ１　　γ１１５第　　２　　表 ５−１８Ｆ１２　８８．７　９０，８　８１゜１５−Ｉ
Ｈ４８５，７８７，１７１，９ ５−４０３７３，９７８，８６７，３ ５−２ＣＩ２　８０，３　７７．０　６９．３５−５Ｂ
６　６８，５　７５，７　７１．３５−１４　６８．５
６９，８　７５．６５−１５Ｆｉ２　　Ｂ６，５　７０
，５　７５．０５−３Ｂ４　９１，２　６９，６　７５
．０５−７刊９　９０，１　６２．２５Ｚ１５−８Ｉ＋
’１　７８，２９７．９　１１７．７５−９ｍ３　７５
，６８５，６　９０．５５−１６Ｄ５　７４．ＯＢ５，
０　９２．Ｂ５−１７Ｆ６　６３，２　５５，３　７１
．４５−１０Ｈ５９２，４８０，９９５，８５−１１Ｄ
７．　９３，４　５２．７　８８．５５−１２ｍ１　７
７．１　７６．８　８６．９５−１３Ｇ１１　７０．４
６７．３　６７．３５−１４Ｄ６　６２．２４４，１　
５３．６コントロール　　　９７，１　　７９．０　　
　　ｑ４５−２１＝ 中試験管当り０．１６　ｍＵ単鎖ウロキナーゼ、０．２
９ｍＵ高分子ウロキナーゼおよびＱ、３ｍＵ低分子ウロ
キナーゼにモル換算で１００倍量の各クローンを加えた
。ただし、単クローン抗体、単鎖ウロキナーゼ高分子ウ
ロキナーゼおよび低分子ウロキナーゼの分子量を＠１５
０Ｋ、・５５に４・５４’におよび６６にとして計算し
た。なお、コントロールとしては、非単銀ウロキナーゼ
抗体産生ハイブリドーマからの腹水をＩｇＧクラスの場
合と同様に精製したものを用いた。

【図面の簡単な説明】

第１図はクローン５−５Ｂ４　（ＩｇＧ１　）の腹水を
硫安分画後、ＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｃｅｌイオン交換ク
ロマトグラフィー処理した時のたん自溶出図であり、第
２図は、第１図のＰ６−２９画分を５ｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−３［Ｉ　Ｑ　Ｅｌｕｐｅｒｆｉｎｅカラムでゲル濾
過した時のたん自溶出図であり、第３Ａ図、３Ｂ図およ
び６０図は、固相−抗体結合テスト法による精製各車ク
ローン抗体の単鎖ウロキナーゼとの結合図である。第３
Ａ図において（−・−）５−１８４、（−〇−）５−５
１、（−△−）　５−２０１２、（−Ｘ−）　５−３Ｂ
４、（−一−・−）５−１４、（−一−○−）５−４０
３、（−ｍ−△−）５−８Ｆ１、（−−−Ｘ　−−−）
　５−７Ｅ９であり、第３Ｂ図において（−・−）５−
１７Ｉ＋’６、（−〇−）５−１６Ｄ５、（−△−）５
−１１１、（−Ｘ−）５−１０１１５、（−−−・−）
５−１１Ｄ５、（＝−−０−−−）５−９Ｅ３、（−△
−）５−１３０１１、（−ｘ−）　５−１４Ｄ６であり
、第３Ｃ図において（−・−）５−１５Ｆ１２、（−〇
−）５−１８Ｆ１２である。第４図は、固相−抗体結合
法による単鎖ウロキナーゼおよび人尿高分子ウロキナー
ゼ、人尿低分子ウロキナーゼと精製各車クローン抗体の
反応図である。１．５−１８Ｆ１２；　２，５−Ｈ（４
；　３，５−４０３；　４，５−２Ｃ１２；　５，５−
５Ｆ／）；　６．５−６Ｅ４Ｉ７．５−１５Ｆ１２ｉ　
８，５−３Ｂ４；　９．５−７に９；　１０，５−８１
；　１１．５−９に３；１２．５−１６Ｄ５；　１３，
５−１７Ｆ６；　１４，５−１０Ｈ５ｉ　１５，５−１
１Ｄ７；１６．５−１２ＥＩ＋１７．５−１３Ｇ１１；
　１Ｂ、５−１４Ｄ６゜特許出願人　富士薬品工業株式
会社 代　埋　人　　弁理士　　南　　　孝　　夫符閉昭６ｌ
−８５３２Ｇ　（９） ｆ続補ＩＥ４） 昭和６０年１０月２９１１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ヒト単鎖ウロキナーゼに存在する抗原決定基のうちのい
   ずれか一つの抗原決定基のみに免疫交差反応性を有する
   各単クローン性抗体。