JPS6191127A - 抗腫瘍性多糖の製造法 - Google Patents
抗腫瘍性多糖の製造法Info
- Publication number
- JPS6191127A JPS6191127A JP59211293A JP21129384A JPS6191127A JP S6191127 A JPS6191127 A JP S6191127A JP 59211293 A JP59211293 A JP 59211293A JP 21129384 A JP21129384 A JP 21129384A JP S6191127 A JPS6191127 A JP S6191127A
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- JP
- Japan
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- polysaccharide
- antitumor
- flavobacterium
- producing
- antitumor polysaccharide
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗ＩＩ！瘍性多糖の製造法に関し、詳しくは精
製された咳多糖の製造法に関する。
製された咳多糖の製造法に関する。
本発明に係る抗腫瘍性多糖（以下、マリナクタンと称す
る。）は）苺洋１′１ｍ生物であるフラボバクテリウム
属に属する微生物により生産される下記の性質ををする
ヘテログリカンである。
る。）は）苺洋１′１ｍ生物であるフラボバクテリウム
属に属する微生物により生産される下記の性質ををする
ヘテログリカンである。
イ）（ａ）フコース、（ｂ）マンノースおよび（ｃ）グ
ルコースを構成成分とし、その組成比がモル比でｌａ）
： （ｂｌ ： （ｃｌ ＝０．１５±０．０５：０．
３１±Ｏ，ＯＳ：ｌである 口）第１図に示す赤外線吸収スペクトルを有する なお、多υ３マリナククンの物理化学的性質の詳細は特
開昭５７−９６００１号公報に記載されている。
ルコースを構成成分とし、その組成比がモル比でｌａ）
： （ｂｌ ： （ｃｌ ＝０．１５±０．０５：０．
３１±Ｏ，ＯＳ：ｌである 口）第１図に示す赤外線吸収スペクトルを有する なお、多υ３マリナククンの物理化学的性質の詳細は特
開昭５７−９６００１号公報に記載されている。
この多糖マリナククンはサルコーマＳ−１８０固型癌系
、サルコーマｓ５−１ａｏ水癌系等に対して強い抗ルｌ
Ｔ傷・活性を有し、さらに免疫賦活作用を有しているこ
とが既に知られている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、 ｖｏｌ’、３６＋
Ｎｏ、５． ４ ７ １ 〜４ ７ ７（１９８３）
、特開昭５７−９６００１号公報）。
、サルコーマｓ５−１ａｏ水癌系等に対して強い抗ルｌ
Ｔ傷・活性を有し、さらに免疫賦活作用を有しているこ
とが既に知られている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、 ｖｏｌ’、３６＋
Ｎｏ、５． ４ ７ １ 〜４ ７ ７（１９８３）
、特開昭５７−９６００１号公報）。
多糖マリナククンの精製法としては、たとえは上記文献
にも一部記載されているように、培養上清液にエタノー
ル等のアルコール類を加えて沈澱させ、沈設物からマリ
ナクタンを熱水抽出し、抽出液を透析して低分子物質を
除去した後、セバーグ法等の公知の除蛋白法を施して混
入している蛋白を除去する方法などがある。
にも一部記載されているように、培養上清液にエタノー
ル等のアルコール類を加えて沈澱させ、沈設物からマリ
ナクタンを熱水抽出し、抽出液を透析して低分子物質を
除去した後、セバーグ法等の公知の除蛋白法を施して混
入している蛋白を除去する方法などがある。
ところが、フラボバクテリウム属のようなグラム陰性Ｉ
ＩＩ菌は一般に菌体毒素、たとえば大腸菌の菌体内毒素
であるリポポリサッカライド（Ｌ Ｐ Ｓ）等のルミナ
ステスト陽性因子の存在が良く知られており、上記の精
製法によって調製されたマリナクタン標品についてもこ
のようなＬＰＳ様活性物質（ルミナステスト陽性因子）
の存在が問題とされる。すなわち、このＬＰＳまたはル
ミナステスト陽性因子は免疫賦活作用を示すものの副作
用として発熱性および毒作用を伴うため、当該因子を可
及的に少なくすることが必要である。
ＩＩ菌は一般に菌体毒素、たとえば大腸菌の菌体内毒素
であるリポポリサッカライド（Ｌ Ｐ Ｓ）等のルミナ
ステスト陽性因子の存在が良く知られており、上記の精
製法によって調製されたマリナクタン標品についてもこ
のようなＬＰＳ様活性物質（ルミナステスト陽性因子）
の存在が問題とされる。すなわち、このＬＰＳまたはル
ミナステスト陽性因子は免疫賦活作用を示すものの副作
用として発熱性および毒作用を伴うため、当該因子を可
及的に少なくすることが必要である。
しかし、マリチククン中に含まれるルミナステスト陽性
因子の除去は非常に困難であり、ゲル濾過法等の精製手
段によっても除去することが出来なかった。
因子の除去は非常に困難であり、ゲル濾過法等の精製手
段によっても除去することが出来なかった。
そこで、本発明者らはＬＰＳ様活性を示さないマリナク
タン標品を得るための精製法について鋭意研究を重ねた
結果、ＬＰＳ様活性を示すマリナクタン標品を酸性溶液
中でマリナクタンの加水分解を招かない条件下で加熱処
理することによりＬＰＳ様活性を除去し精製されたマリ
ナクタン標品が得られることを見出し、かかる知見に基
いて本発明を完成するに至った。
タン標品を得るための精製法について鋭意研究を重ねた
結果、ＬＰＳ様活性を示すマリナクタン標品を酸性溶液
中でマリナクタンの加水分解を招かない条件下で加熱処
理することによりＬＰＳ様活性を除去し精製されたマリ
ナクタン標品が得られることを見出し、かかる知見に基
いて本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、フラボバクテリウム属に属する抗腫
瘍性多糖マリナクタン生産菌を栄養培地で培養し、培養
液中にマリナククンを生成、蓄積せしめ、該培養液から
アルコール沈澱法によりマリナクタンを採取し、次いで
濃度０．０５〜１．ＯＮの酸性溶液中で加熱処理してル
ミナステスト陽性因子を除去することを特徴とする精製
された抗腫瘍性多糖マリナククンの製造法に関するもの
である。
瘍性多糖マリナクタン生産菌を栄養培地で培養し、培養
液中にマリナククンを生成、蓄積せしめ、該培養液から
アルコール沈澱法によりマリナクタンを採取し、次いで
濃度０．０５〜１．ＯＮの酸性溶液中で加熱処理してル
ミナステスト陽性因子を除去することを特徴とする精製
された抗腫瘍性多糖マリナククンの製造法に関するもの
である。
多糖マリナククンの生産菌であるフラボバクテリウム属
の微生物の培養方法等については前記特開昭５−７−９
６００１号公報に記載された方法を適用すればよい。ま
た、マリナクタン生産菌の１例としてフラボバクテリウ
ム・ウリギノザム（ＦｌａｖｏＩ）ａｃＬｅｒｉｕｍ
ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ ） Ｍ Ｐ −５
５株（ＦＩＦ、ＲＭ Ｉ）−５７９３）があり、本閑
の菌学的物質は特開昭５’ｌ−９６００１号公？しに示
されている。
の微生物の培養方法等については前記特開昭５−７−９
６００１号公報に記載された方法を適用すればよい。ま
た、マリナクタン生産菌の１例としてフラボバクテリウ
ム・ウリギノザム（ＦｌａｖｏＩ）ａｃＬｅｒｉｕｍ
ｕｌｉｇｉｎｏｓｕｍ ） Ｍ Ｐ −５
５株（ＦＩＦ、ＲＭ Ｉ）−５７９３）があり、本閑
の菌学的物質は特開昭５’ｌ−９６００１号公？しに示
されている。
本発明では、マリナククン生産菌の培養液からアルコー
ル沈澱法によりマリナクタンを採取するか、一般的には
該培養液から遠心分離等の固液分面１操作により得た−
［二゛請液にエタノール等のアルコールを加えたのら氷
室に放置して沈ｄＧを生成せしめる。
ル沈澱法によりマリナクタンを採取するか、一般的には
該培養液から遠心分離等の固液分面１操作により得た−
［二゛請液にエタノール等のアルコールを加えたのら氷
室に放置して沈ｄＧを生成せしめる。
アルコール沈澱によりマリナククンを採取した後、酸処
理を行なうが、望ましくは酸処理前に一ヒ記したような
透析法を使用した低分子物質の除去および除蛋白操作を
施す。
理を行なうが、望ましくは酸処理前に一ヒ記したような
透析法を使用した低分子物質の除去および除蛋白操作を
施す。
本発明の方法で使用する酸としては種々のものがあり、
たとえば酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸や塩酸
、硫酸などの無機酸を挙げることができる。酸の濃度は
０．０５〜１．ＯＮ、好ましくは０．１〜０．５Ｎの範
囲が適当である。酸処理は５０℃以上、好ましくは７０
〜１００℃の温度で５〜６０分間、好ましくは５〜３０
分間加熱することにより行なう。酸処理条件を厳しくす
ると、マリナククンの抗腫瘍活性が低下するので、上記
範囲内で行なうことが必要である。この酸処理によって
ルミナステスト陽性因子を除去することができ、通常は
酸処理終了後直ちに冷却し、次いで酸処理によって生し
た不溶性物質を遠心分離、濾過等の操作によって除去し
たのち苛性ソーダ等のアルカリを用いてｐｌ＋６．０〜
８．５に中和する。中和後、再びアルコール沈澱を行な
いマリナクタン標品を採取する。このマリナクタン標品
についてルミナステストを行なってＬＰＳ様活性を測定
したところ、試料１．０ｇ当りＬＰＳ （Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ０１１１ ・１１３４）換算で２〜３０■程度で
あり、本発明の酸処理によって該活性物質を１／１０〜
１／１００に低減することが出来、ルミナステスト陽性
因子を実質的に含有しない標品を得ることができる。
たとえば酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸や塩酸
、硫酸などの無機酸を挙げることができる。酸の濃度は
０．０５〜１．ＯＮ、好ましくは０．１〜０．５Ｎの範
囲が適当である。酸処理は５０℃以上、好ましくは７０
〜１００℃の温度で５〜６０分間、好ましくは５〜３０
分間加熱することにより行なう。酸処理条件を厳しくす
ると、マリナククンの抗腫瘍活性が低下するので、上記
範囲内で行なうことが必要である。この酸処理によって
ルミナステスト陽性因子を除去することができ、通常は
酸処理終了後直ちに冷却し、次いで酸処理によって生し
た不溶性物質を遠心分離、濾過等の操作によって除去し
たのち苛性ソーダ等のアルカリを用いてｐｌ＋６．０〜
８．５に中和する。中和後、再びアルコール沈澱を行な
いマリナクタン標品を採取する。このマリナクタン標品
についてルミナステストを行なってＬＰＳ様活性を測定
したところ、試料１．０ｇ当りＬＰＳ （Ｅ、 ｃｏｌ
ｉ ０１１１ ・１１３４）換算で２〜３０■程度で
あり、本発明の酸処理によって該活性物質を１／１０〜
１／１００に低減することが出来、ルミナステスト陽性
因子を実質的に含有しない標品を得ることができる。
したがって、本発明の方法により得られるマリナククン
は副作用のない抗腫瘍性物質として非常に有用である。
は副作用のない抗腫瘍性物質として非常に有用である。
次に、実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例１
市販の人工海水（ジャーマリンＳ、ジャマリンラボラト
リ−Ｗ）３ｏｏｇにグルコース０．６％。
リ−Ｗ）３ｏｏｇにグルコース０．６％。
ポリペプトン０．５％、イーストエキス００１％透析外
液を加えｐＨ７，３に調整し、この培地を５００１容タ
ンクに張り込み１２０℃で１５分間加熱、滅菌した。こ
れに同培地で培養して得た種培養液３０ｅを接種し、２
７℃で２４時間通気攪拌培養（１／２Ｖ、Ｖ、Ｍ、、３
０００ｒ、ｐ、ｍ、）を行なった。培養液を遠心分離し
て菌体を除去し、得られた培養上澄液を減圧、濃縮して
５０１の濃縮液とした。これに等量のエタノールを加え
、生じた沈澱物を遠心分離により採取した。この沈澱物
を２ＯＮの熱水で２回抽出しく９０°ｃ、 ２時間）
、不溶性残渣を除去（遠心分離法）後、流水に対して３
日間透析した。
液を加えｐＨ７，３に調整し、この培地を５００１容タ
ンクに張り込み１２０℃で１５分間加熱、滅菌した。こ
れに同培地で培養して得た種培養液３０ｅを接種し、２
７℃で２４時間通気攪拌培養（１／２Ｖ、Ｖ、Ｍ、、３
０００ｒ、ｐ、ｍ、）を行なった。培養液を遠心分離し
て菌体を除去し、得られた培養上澄液を減圧、濃縮して
５０１の濃縮液とした。これに等量のエタノールを加え
、生じた沈澱物を遠心分離により採取した。この沈澱物
を２ＯＮの熱水で２回抽出しく９０°ｃ、 ２時間）
、不溶性残渣を除去（遠心分離法）後、流水に対して３
日間透析した。
透析内液１容に対し１／３容のクロロホルムと１７３０
容のｎ−ブタノールを加えて３０分間激しく振盪したの
ち生じた沈澱物を遠心分離（３０，０Ｏｒ、ｐ、ｍ、、
１５分）により除去して上清液を得た。さらに、この操
作を２回操り返して除蛋白を行なった。
容のｎ−ブタノールを加えて３０分間激しく振盪したの
ち生じた沈澱物を遠心分離（３０，０Ｏｒ、ｐ、ｍ、、
１５分）により除去して上清液を得た。さらに、この操
作を２回操り返して除蛋白を行なった。
このようにして得られた上清液に１．５倍容のエタノー
ルを加え、生じた沈澱物を採取し、純エタノールで洗浄
後、減圧上乾燥して粗マリナクタン標品３０ｇを得た。
ルを加え、生じた沈澱物を採取し、純エタノールで洗浄
後、減圧上乾燥して粗マリナクタン標品３０ｇを得た。
この粗マリナクタン標品の糖含有量（フェノール−硫酸
法）は７０％であり、ローリ−法で測定した蛋白含有量
は１，５％、ルミナステスト法で測定した活性は上記Ｌ
ＰＳ換算で１２０ｍｇ／ｇであった。この標品１．２ｇ
を１００ｍｆｆ１の水に溶解し、これに２．４Ｎ酢酸水
溶液２０ｍ（ｌを加え、還流下で１５分間加熱した。加
熱後、遠心分離して不溶性物質を除去したのち、ＩＯＮ
苛性ソーダでρ１１７．５に中和した。
法）は７０％であり、ローリ−法で測定した蛋白含有量
は１，５％、ルミナステスト法で測定した活性は上記Ｌ
ＰＳ換算で１２０ｍｇ／ｇであった。この標品１．２ｇ
を１００ｍｆｆ１の水に溶解し、これに２．４Ｎ酢酸水
溶液２０ｍ（ｌを加え、還流下で１５分間加熱した。加
熱後、遠心分離して不溶性物質を除去したのち、ＩＯＮ
苛性ソーダでρ１１７．５に中和した。
中和液に１．５倍容のエタノールを加え、生じた沈澱を
濾別、採取し、さらにエタノール沈澱を繰り返して得ら
れた沈澱物をエタノールで洗浄後、減圧下で乾燥して８
７０ｒｖｔの標品を得た。この標品について加熱時間を
変えたこと以外は前記と同様の方法で酸処理を行なった
。得られた各標品についてり、 ｐ ｓ様活性およびマ
ウスを用いるサルコーマ１８０固型癌に対する抗腫瘍活
性を測定し、酸処理の加熱時間との関係を調べた。
濾別、採取し、さらにエタノール沈澱を繰り返して得ら
れた沈澱物をエタノールで洗浄後、減圧下で乾燥して８
７０ｒｖｔの標品を得た。この標品について加熱時間を
変えたこと以外は前記と同様の方法で酸処理を行なった
。得られた各標品についてり、 ｐ ｓ様活性およびマ
ウスを用いるサルコーマ１８０固型癌に対する抗腫瘍活
性を測定し、酸処理の加熱時間との関係を調べた。
その結果を第１表に示す。
′ニー」
第 １ 表
第１表中の腫瘍増殖阻止率はＩＣＲマウス（５週令、雌
）に３Ｘ１０６個のサルコーマ１８０細胞を皮下移植し
、翌日より１０日間試料の所定量を腹腔的投与し、５週
目に腫瘍重量を測定して試料の腫瘍増殖阻止率を求めた
。
）に３Ｘ１０６個のサルコーマ１８０細胞を皮下移植し
、翌日より１０日間試料の所定量を腹腔的投与し、５週
目に腫瘍重量を測定して試料の腫瘍増殖阻止率を求めた
。
一方、延命率はＩＣＲマウス（５週令、１ｌｔｆｆ）
７匹にサルコーマ１８０１１！水癌を１×１０６個／
匹の割合で腹腔内投与し、翌日より１０日間試料を２５
■／ｋｇの割合で腹腔内投与し°ζ延命率を求めた。
７匹にサルコーマ１８０１１！水癌を１×１０６個／
匹の割合で腹腔内投与し、翌日より１０日間試料を２５
■／ｋｇの割合で腹腔内投与し°ζ延命率を求めた。
第１表に示すように、５分〜３０分間の加熱処理により
抗腫瘍活性を殆んど失うことなくルミナステスト陽性因
子の大部分を除去することができた。
抗腫瘍活性を殆んど失うことなくルミナステスト陽性因
子の大部分を除去することができた。
次に、上記租マリナクタン標品１．２ｇを１００ｍβの
０．１ Ｎ塩酸に溶解し、８０℃で２０分間加熱処理し
た。加熱後、濾過して不溶性物質を除去し、ＩＯＮ苛性
ソーダでＰＨ７，５に中和し、１．５倍容のエタノール
を加えて生成する沈澱物を採取した。次いで、エタノー
ルで洗浄後、減圧乾燥して８００＃の精製標品を得た。
０．１ Ｎ塩酸に溶解し、８０℃で２０分間加熱処理し
た。加熱後、濾過して不溶性物質を除去し、ＩＯＮ苛性
ソーダでＰＨ７，５に中和し、１．５倍容のエタノール
を加えて生成する沈澱物を採取した。次いで、エタノー
ルで洗浄後、減圧乾燥して８００＃の精製標品を得た。
この標品の腫瘍増殖阻止率、延命率およびルミナステス
ト（ＬＰｓ換算）はそれぞれ７８％、１６５％および８
．５ｍｇ／ｇであった。
ト（ＬＰｓ換算）はそれぞれ７８％、１６５％および８
．５ｍｇ／ｇであった。
第１図は本発明に係るヘテログリカンの赤外線吸収スペ
クトルである。 特許出願人 財団法人 微生物化学研究会前１頁の続き ９発 明 者 鈴 木 克 美 東京都豊島区
池袋３“９発 明 者 椎 尾 剛 鎌
倉市寺分２−３２−丁目１６３１
クトルである。 特許出願人 財団法人 微生物化学研究会前１頁の続き ９発 明 者 鈴 木 克 美 東京都豊島区
池袋３“９発 明 者 椎 尾 剛 鎌
倉市寺分２−３２−丁目１６３１
Claims (2)
- （１）フラボバクテリウム属に属し、下記の性質を有す
る抗腫瘍性多糖 イ）（ａ）フコース、（ｂ）マンノースおよび（ｃ）グ
ルコースを構成成分とし、その組成比がモル比で（ａ）
：（ｂ）：（ｃ）＝０．１５±０．０５：０．３１±０
．０５：１である ロ）第１図に示す赤外線吸収スペクトルを有する の生産菌を栄養培地で培養し、培養液中に該多糖を生成
、蓄積せしめ、該培養液からアルコール沈澱法により該
多糖を採取し、次いで濃度０．０５〜１．０Ｎの酸性溶
液中で加熱処理してルミナステスト陽性因子を除去する
ことを特徴とする抗腫瘍性多糖の製造法。 - （２）フラボバクテリウム属に属する抗腫瘍性多糖生産
菌がフラボバクテリウム・ウリギノザムＭＰ−５５株（
ＦＥＲＭ Ｐ−５７９３）である特許請求の範囲第１項
記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59211293A JPS6191127A (ja) | 1984-10-11 | 1984-10-11 | 抗腫瘍性多糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59211293A JPS6191127A (ja) | 1984-10-11 | 1984-10-11 | 抗腫瘍性多糖の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6191127A true JPS6191127A (ja) | 1986-05-09 |
Family
ID=16603531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59211293A Pending JPS6191127A (ja) | 1984-10-11 | 1984-10-11 | 抗腫瘍性多糖の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6191127A (ja) |
-
1984
- 1984-10-11 JP JP59211293A patent/JPS6191127A/ja active Pending
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