JPH044868B2 - - Google Patents
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- JPH044868B2 JPH044868B2 JP61099447A JP9944786A JPH044868B2 JP H044868 B2 JPH044868 B2 JP H044868B2 JP 61099447 A JP61099447 A JP 61099447A JP 9944786 A JP9944786 A JP 9944786A JP H044868 B2 JPH044868 B2 JP H044868B2
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- hyaluronic acid
- negative
- resistance
- culture
- streptococcus
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明はヒアルロン酸生産能を有し、ヒアルロ
ニダーゼ非生産性でかつ非溶血性を示す新規なス
トレプトコツカス・ズーエピデミカス
（Streptococcus zooepidemicus）に関する。よ
り具体的には、本発明は溶血素を含まずかつ高分
子量のヒアルロン酸を効率よく生産する能力を有
するストレプトコツカス・ズーエピデミカスの変
異株に関する。 従来の技術 ヒアルロン酸は今日では動物体の結合組織のあ
らゆる部分に存在することが認められており、工
業的には鶏のトサカや臍帯等の生体組織から抽出
法によつて得られ、その機能は細胞間に水を保持
し、又組織内にゼリー様マトリツクスを形成して
細胞を保持したり、細胞間の物質移動を制御した
り、外からの物理的シヨツクあるいは細菌等の感
染を防ぐことが挙げられている。このような機能
を利用してヒアルロン酸は医薬品（関節炎治療
薬、眼薬、創傷治癒剤等）、化粧品等に使用され
ている。 しかしながら生体組織からの抽出によるヒアル
ロン酸の製造は、分離精製の複雑性のため大量生
産がむつかしく極めて高価である。そしてこのこ
とがヒアルロン酸の用途開発の道を閉ざしてい
る。 微生物によるヒアルロン酸の生産についてはス
トレプトコツカス属細菌のうちの、ランスフイー
ルド（Lancefield）血清群のＡ、ＣおよびＤ型
菌、例えばストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコツカ
ス・ズーエピデミカス（Streptococcus
zooepidemicus）、ストレプトコツカス・エクイ
（Streptococcus equi）、ストレプトコツカス・エ
クイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ス
トレプトコツカス・デイスガラクチイエ
（Streptococcus dysgalactiae）およびストレプ
トコツカス・フエカリス・バー・ザイモゲネス
（Streptococcus faecalis var.zymogenes）そし
てパスツレラ・マルトシダ（Pasteurella
multocida）等がヒアルロン酸を生成することが
既に知られており、例えばケンドール等（F.E.
Kendall et al.，J.Biol.Chem.，118，61，
1937）、ピアース等（W.A.Pierce et al.，J.
Baact.，63，301，1952）、マツクレナン（A.P.
MacLennan，J.Gen.Microbiol.，14，134−142，
1956；J.Gen.Microbiol.，15，485−491，1956）、
ホルムストレーム等（B.Holmstro¨m et al.，
Appl.Microbiol.，15，1409−1413，1967）、ウー
ルコツク（J.B.Woolcock，J.Gen.Microbiol.，
85，372−375，1974）、キエム等（E.Kjems et
al.，Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B，84，
162−164，1976）、バーガン等（T.Bergan et
al.，Acta Path.Microbiol.Scand.，75，97−
103，1969）そしてシフオネリ（J.A.Cifonelli，
Carbohyd.Res.，14，272−276，1970）によつて
既に報告されている。これらの報告はヒアルロン
酸の大量生産を目的としたものではなく、炭素源
としてグルコースを１−1.5％用いて培養したも
ので、そのヒアルロン酸生産量は0.5−0.6ｇ／
以下であり、対糖収率は６％以下であつた。マツ
クレナンは上記の報告の中でストレプトコツカス
属のランスフイールド血清群Ｃ型菌の一種につい
て好気条件による培養はヒアルロン酸の生産を促
進する可能性があることを報告している。上記の
ヒアルロン酸を生産する微生物のうち、ストレプ
トコツカス属のランスフイールド血清群Ａ型菌や
パスツレラは人に対する病原菌として知られ、実
際大量培養するには不適である。 工業的にストレプトコツカス属のヒアルロン酸
生産菌を培養して、その培養液からヒアルロン酸
を抽出し、精製する方法が特開昭58−56692号に
開示されている。この方法はストレプトコツカス
属のランスフイールド血清群Ａ、Ｃ型菌を培養し
てヒアルロン酸を大量に得る方法で、炭素源とし
てグルコースを倍地に８％添加して培養し、４
ｇ／のヒアルロン酸を得ている。この場合のヒ
アルロン酸の対糖収率は５％であり、グルコース
添加量を１％から８％と変化させても変わつてい
ない。したがつてこの対糖収率（５％）は既報告
におけるヒアルロン酸生産菌の対糖収率とほとん
どかわりはない。この他にストレプトコツカス属
細菌を使用してヒアルロン酸を得る方法として、
特開昭60−500597、特開昭60−133894、特開昭61
−15698が有るが、得られるヒアルロン酸が低分
子量であつたり、収率が低いなどの問題点が存在
する。又いずれも、ヒアルロン酸生産菌株がスト
レプトリジン（可溶性溶血素）を生成し、β−溶
血性を示す事が知られている。この様な菌を大量
に培養してヒアルロン酸を生産しようとする場
合、該溶血素がヒアルロン酸生産物へ混入するお
それがあり、かかるヒアルロン酸を化粧品や医薬
品に配合することは好ましくない。 この欠点を改良する為に、化学変異剤による変
異処理によつて、ストレプトリジン生成能を欠如
させたヒアルロン酸生産菌株を培養することによ
つてヒアルロン酸を得る方法が特開昭60−251898
に開示されている。この中には、グルコースを６
％添加することにより3.6ｇ／のヒアルロン酸
が得られたことが記載されており、この時のヒア
ルロン酸の対糖収率は６％であり、やはり対糖収
率の観点から生産性の低いものである。 発明が解決しようとする問題点 上記問題点に鑑み、溶血素（ストレプトリジ
ン）を生成せず、高いヒアルロン酸生産能を有す
る微生物を創製することを目的として鋭意研究の
結果、自然界から単離したヒアルロン酸生産能を
有するストレプトコツカス・ズーエピデミカスか
ら変異処理によつて得た溶血性をしめさなくなつ
た菌株を、再度変異処理することにより、ヒアル
ロニダーゼ生成能を欠如し、高分子量ヒアルロン
酸の生産性が極めて高い新規な菌株を得ることに
成功した。 本発明はかかる知見に基づいて完成されたもの
であり、したがつて本発明は溶血素を含まずかつ
高分子量のヒアルロン酸を効率良く生産する能力
を有するストレプトコツカス・ズーエピデミカス
の変異株を提供するものである。 問題点を解決するための手段 (1) 変異株の取得 本発明者らは、本発明の目的を達成するべ
く、次の方法により新規変異株を取得した。ま
ず牛鼻粘膜よりヒアルロニダーゼ（ヒアルロン
酸分解酵素）の強い生成能を有しかつヒアルロ
ン酸を生産するランスフイールド血清群Ｃ型に
属するストレプトコツカス・ズーエピデミカス
（本菌の同定は、バージエイズ・マニユアル・
オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジイ
ー第８版、1974によつた）を得た。この菌株は
マツクレナン（MacLennan，J.Gen.
Microbiol.，14，134−142，1956）が指摘した
ように好気条件においてヒアルロン酸を良く生
産し、炭素源としてグルコースを用いた場合、
４％のグルコース添加によつて２ｇ／のヒア
ルロン酸を生産した（ヒアルロン酸の対糖収率
は５％）。そしてこの時得られたヒアルロン酸
の分子量は30−60万であつた。この菌株を常法
（細菌・フアージ遺伝実験法、淡白質核酸酵素
別冊、共立出版1972）によつて紫外線や化学剤
（Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン（NTG）、エチルメタンスルフオン酸
等）で処理して、この処理菌体を血液寒天倍地
に混釈してまき、溶血性を示さない集落を採取
し、次にこの菌体を再び変異処理した後、ヒア
ルロン酸を含有した栄養寒天倍地上に塗布し、
ヒアルロン酸を分解しない集落を採取すること
によつてストレプトコツカス・ズーエピデミカ
スの変異株１株を得た（後記実施例１参照）。 (2) 菌学的性質 後記実施例１で得たストレプトコツカス・ズ
ーエピデミカスの変異株（以下本菌という）
は、トツド・ヒユーイツト・ブロス（Todd
Hewitt broth）寒天倍地上で極めて強い粘性
を有する透明な集落を形成し、非溶血性（β−
溶血性：陰性）、ヒアルロニダーゼ非生産性、
ランスフイールド血清群Ｃ型に属する連鎖状球
菌であり、本菌の菌学的性質は下記の通りであ
る。 (a) グラム染色性：陽性 (b) 10℃増殖性：陰性 (c) 45℃増殖性：陰性 (d) 0.1％メチレンブルー抵抗性：陰性 (e) 6.5％食塩抵抗性：陰性 (f) 40％胆汁抵抗性：陰性 (g) バシトラシン抵抗性：陽性 (h) PH9.6抵抗性：陰性 (i) 60℃、30分抵抗性：陰性 (j) ゼラチン分解性：陰性 (k) 澱粉分解性：陽性 (l) 馬尿酸ソーダ分解性：陰性 (m) エスクリン分解性：弱陽性 (n) アルギニン分解性：陽性 (o) 糖醗酵性：グルコース、ガラクトース、
シユークロース、ラクトース、マルトース、
ソルビトールおよびサリシンは陽性、 グリセリン、マンニトール、トレハロース
およびアラビノースは陰性。 本発明者らは本菌の菌学的性質から、本菌を
ストレプトコツカス・ズーエピデミカス
YIT2030と命名し、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第1305号として寄託され
ている。 (3) 本菌によるヒアルロン酸の製造 本菌を培養してヒアルロン酸を得る培地は、
炭素源、有機無機窒素源、無機塩およびその他
必要に応じて有機微量栄養素を含有するもので
あることが好ましい。炭素源としては、グレコ
ース、ガラクトース、シユークロース、ラクト
ース、フラクトース、マルトース、ソルビトー
ル、澱粉加水分解物等の糖分を含むものが好ま
しく、他には有機酸や脂肪族アルコール等でも
よい。窒素源としては有機無機一般的な材料で
よく、各種肉エキス、アミノ酸混合物、ペプト
ン、酵母エキス等が好ましい。更に、ナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄
等の塩化物、硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、炭酸塩
そしてビタミンなどが必要に応じて添加されう
る。 培養は好気的条件が必須であり、培養液の粘
度の上昇に応じ撹拌速度を上げるのが良いが過
度の撹拌は好ましくない。培養温度は菌の増殖
が行われる25−38℃で行うことが一般的であ
る。更に培養時、本菌が乳酸を生成しその乳酸
によつて菌の増殖ならびにヒアルロン酸の生産
が抑制されることから、乳酸の中和の為にアル
カリ水溶液を添加して、PH６−８の範囲内に調
整することが必要である。この時使用するアル
カリ水溶液は水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ムの水溶液やアンモニア水でよい。 本菌は高分子量のヒアルロン酸（分子量200
−300万）を極めて高い収率、生産率で生産す
る菌株であるが、炭素源としてグルコースを用
いると特に良い結果がえられる。糖の添加量３
％以下では対糖収率14−15％であり、それ以上
の添加量では若干対糖収率は減少する傾向にあ
つた。糖の添加を６％にすると（参考例１参
照）、培養液の粘性は36℃で8000センチポアズ
（cp）となり、ほとんど培養液は流動性がなく
なり撹拌速度を上げても影響なく培養の限界と
なつた。 第１表に培地中のグルコースの添加量を変え
て培養したときのヒアルロン酸生産量を示し
た。即ち生成ヒアルロン酸を常法により精製し
た結果、グルコース１％添加時には対糖収率15
％で1.5ｇ／、６％添加時には対糖収率11％
で6.7ｇ／のヒアルロン酸が得られた。
ニダーゼ非生産性でかつ非溶血性を示す新規なス
トレプトコツカス・ズーエピデミカス
（Streptococcus zooepidemicus）に関する。よ
り具体的には、本発明は溶血素を含まずかつ高分
子量のヒアルロン酸を効率よく生産する能力を有
するストレプトコツカス・ズーエピデミカスの変
異株に関する。 従来の技術 ヒアルロン酸は今日では動物体の結合組織のあ
らゆる部分に存在することが認められており、工
業的には鶏のトサカや臍帯等の生体組織から抽出
法によつて得られ、その機能は細胞間に水を保持
し、又組織内にゼリー様マトリツクスを形成して
細胞を保持したり、細胞間の物質移動を制御した
り、外からの物理的シヨツクあるいは細菌等の感
染を防ぐことが挙げられている。このような機能
を利用してヒアルロン酸は医薬品（関節炎治療
薬、眼薬、創傷治癒剤等）、化粧品等に使用され
ている。 しかしながら生体組織からの抽出によるヒアル
ロン酸の製造は、分離精製の複雑性のため大量生
産がむつかしく極めて高価である。そしてこのこ
とがヒアルロン酸の用途開発の道を閉ざしてい
る。 微生物によるヒアルロン酸の生産についてはス
トレプトコツカス属細菌のうちの、ランスフイー
ルド（Lancefield）血清群のＡ、ＣおよびＤ型
菌、例えばストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコツカ
ス・ズーエピデミカス（Streptococcus
zooepidemicus）、ストレプトコツカス・エクイ
（Streptococcus equi）、ストレプトコツカス・エ
クイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ス
トレプトコツカス・デイスガラクチイエ
（Streptococcus dysgalactiae）およびストレプ
トコツカス・フエカリス・バー・ザイモゲネス
（Streptococcus faecalis var.zymogenes）そし
てパスツレラ・マルトシダ（Pasteurella
multocida）等がヒアルロン酸を生成することが
既に知られており、例えばケンドール等（F.E.
Kendall et al.，J.Biol.Chem.，118，61，
1937）、ピアース等（W.A.Pierce et al.，J.
Baact.，63，301，1952）、マツクレナン（A.P.
MacLennan，J.Gen.Microbiol.，14，134−142，
1956；J.Gen.Microbiol.，15，485−491，1956）、
ホルムストレーム等（B.Holmstro¨m et al.，
Appl.Microbiol.，15，1409−1413，1967）、ウー
ルコツク（J.B.Woolcock，J.Gen.Microbiol.，
85，372−375，1974）、キエム等（E.Kjems et
al.，Acta Path.Microbiol.Scand.Sect.B，84，
162−164，1976）、バーガン等（T.Bergan et
al.，Acta Path.Microbiol.Scand.，75，97−
103，1969）そしてシフオネリ（J.A.Cifonelli，
Carbohyd.Res.，14，272−276，1970）によつて
既に報告されている。これらの報告はヒアルロン
酸の大量生産を目的としたものではなく、炭素源
としてグルコースを１−1.5％用いて培養したも
ので、そのヒアルロン酸生産量は0.5−0.6ｇ／
以下であり、対糖収率は６％以下であつた。マツ
クレナンは上記の報告の中でストレプトコツカス
属のランスフイールド血清群Ｃ型菌の一種につい
て好気条件による培養はヒアルロン酸の生産を促
進する可能性があることを報告している。上記の
ヒアルロン酸を生産する微生物のうち、ストレプ
トコツカス属のランスフイールド血清群Ａ型菌や
パスツレラは人に対する病原菌として知られ、実
際大量培養するには不適である。 工業的にストレプトコツカス属のヒアルロン酸
生産菌を培養して、その培養液からヒアルロン酸
を抽出し、精製する方法が特開昭58−56692号に
開示されている。この方法はストレプトコツカス
属のランスフイールド血清群Ａ、Ｃ型菌を培養し
てヒアルロン酸を大量に得る方法で、炭素源とし
てグルコースを倍地に８％添加して培養し、４
ｇ／のヒアルロン酸を得ている。この場合のヒ
アルロン酸の対糖収率は５％であり、グルコース
添加量を１％から８％と変化させても変わつてい
ない。したがつてこの対糖収率（５％）は既報告
におけるヒアルロン酸生産菌の対糖収率とほとん
どかわりはない。この他にストレプトコツカス属
細菌を使用してヒアルロン酸を得る方法として、
特開昭60−500597、特開昭60−133894、特開昭61
−15698が有るが、得られるヒアルロン酸が低分
子量であつたり、収率が低いなどの問題点が存在
する。又いずれも、ヒアルロン酸生産菌株がスト
レプトリジン（可溶性溶血素）を生成し、β−溶
血性を示す事が知られている。この様な菌を大量
に培養してヒアルロン酸を生産しようとする場
合、該溶血素がヒアルロン酸生産物へ混入するお
それがあり、かかるヒアルロン酸を化粧品や医薬
品に配合することは好ましくない。 この欠点を改良する為に、化学変異剤による変
異処理によつて、ストレプトリジン生成能を欠如
させたヒアルロン酸生産菌株を培養することによ
つてヒアルロン酸を得る方法が特開昭60−251898
に開示されている。この中には、グルコースを６
％添加することにより3.6ｇ／のヒアルロン酸
が得られたことが記載されており、この時のヒア
ルロン酸の対糖収率は６％であり、やはり対糖収
率の観点から生産性の低いものである。 発明が解決しようとする問題点 上記問題点に鑑み、溶血素（ストレプトリジ
ン）を生成せず、高いヒアルロン酸生産能を有す
る微生物を創製することを目的として鋭意研究の
結果、自然界から単離したヒアルロン酸生産能を
有するストレプトコツカス・ズーエピデミカスか
ら変異処理によつて得た溶血性をしめさなくなつ
た菌株を、再度変異処理することにより、ヒアル
ロニダーゼ生成能を欠如し、高分子量ヒアルロン
酸の生産性が極めて高い新規な菌株を得ることに
成功した。 本発明はかかる知見に基づいて完成されたもの
であり、したがつて本発明は溶血素を含まずかつ
高分子量のヒアルロン酸を効率良く生産する能力
を有するストレプトコツカス・ズーエピデミカス
の変異株を提供するものである。 問題点を解決するための手段 (1) 変異株の取得 本発明者らは、本発明の目的を達成するべ
く、次の方法により新規変異株を取得した。ま
ず牛鼻粘膜よりヒアルロニダーゼ（ヒアルロン
酸分解酵素）の強い生成能を有しかつヒアルロ
ン酸を生産するランスフイールド血清群Ｃ型に
属するストレプトコツカス・ズーエピデミカス
（本菌の同定は、バージエイズ・マニユアル・
オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジイ
ー第８版、1974によつた）を得た。この菌株は
マツクレナン（MacLennan，J.Gen.
Microbiol.，14，134−142，1956）が指摘した
ように好気条件においてヒアルロン酸を良く生
産し、炭素源としてグルコースを用いた場合、
４％のグルコース添加によつて２ｇ／のヒア
ルロン酸を生産した（ヒアルロン酸の対糖収率
は５％）。そしてこの時得られたヒアルロン酸
の分子量は30−60万であつた。この菌株を常法
（細菌・フアージ遺伝実験法、淡白質核酸酵素
別冊、共立出版1972）によつて紫外線や化学剤
（Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン（NTG）、エチルメタンスルフオン酸
等）で処理して、この処理菌体を血液寒天倍地
に混釈してまき、溶血性を示さない集落を採取
し、次にこの菌体を再び変異処理した後、ヒア
ルロン酸を含有した栄養寒天倍地上に塗布し、
ヒアルロン酸を分解しない集落を採取すること
によつてストレプトコツカス・ズーエピデミカ
スの変異株１株を得た（後記実施例１参照）。 (2) 菌学的性質 後記実施例１で得たストレプトコツカス・ズ
ーエピデミカスの変異株（以下本菌という）
は、トツド・ヒユーイツト・ブロス（Todd
Hewitt broth）寒天倍地上で極めて強い粘性
を有する透明な集落を形成し、非溶血性（β−
溶血性：陰性）、ヒアルロニダーゼ非生産性、
ランスフイールド血清群Ｃ型に属する連鎖状球
菌であり、本菌の菌学的性質は下記の通りであ
る。 (a) グラム染色性：陽性 (b) 10℃増殖性：陰性 (c) 45℃増殖性：陰性 (d) 0.1％メチレンブルー抵抗性：陰性 (e) 6.5％食塩抵抗性：陰性 (f) 40％胆汁抵抗性：陰性 (g) バシトラシン抵抗性：陽性 (h) PH9.6抵抗性：陰性 (i) 60℃、30分抵抗性：陰性 (j) ゼラチン分解性：陰性 (k) 澱粉分解性：陽性 (l) 馬尿酸ソーダ分解性：陰性 (m) エスクリン分解性：弱陽性 (n) アルギニン分解性：陽性 (o) 糖醗酵性：グルコース、ガラクトース、
シユークロース、ラクトース、マルトース、
ソルビトールおよびサリシンは陽性、 グリセリン、マンニトール、トレハロース
およびアラビノースは陰性。 本発明者らは本菌の菌学的性質から、本菌を
ストレプトコツカス・ズーエピデミカス
YIT2030と命名し、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第1305号として寄託され
ている。 (3) 本菌によるヒアルロン酸の製造 本菌を培養してヒアルロン酸を得る培地は、
炭素源、有機無機窒素源、無機塩およびその他
必要に応じて有機微量栄養素を含有するもので
あることが好ましい。炭素源としては、グレコ
ース、ガラクトース、シユークロース、ラクト
ース、フラクトース、マルトース、ソルビトー
ル、澱粉加水分解物等の糖分を含むものが好ま
しく、他には有機酸や脂肪族アルコール等でも
よい。窒素源としては有機無機一般的な材料で
よく、各種肉エキス、アミノ酸混合物、ペプト
ン、酵母エキス等が好ましい。更に、ナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄
等の塩化物、硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、炭酸塩
そしてビタミンなどが必要に応じて添加されう
る。 培養は好気的条件が必須であり、培養液の粘
度の上昇に応じ撹拌速度を上げるのが良いが過
度の撹拌は好ましくない。培養温度は菌の増殖
が行われる25−38℃で行うことが一般的であ
る。更に培養時、本菌が乳酸を生成しその乳酸
によつて菌の増殖ならびにヒアルロン酸の生産
が抑制されることから、乳酸の中和の為にアル
カリ水溶液を添加して、PH６−８の範囲内に調
整することが必要である。この時使用するアル
カリ水溶液は水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ムの水溶液やアンモニア水でよい。 本菌は高分子量のヒアルロン酸（分子量200
−300万）を極めて高い収率、生産率で生産す
る菌株であるが、炭素源としてグルコースを用
いると特に良い結果がえられる。糖の添加量３
％以下では対糖収率14−15％であり、それ以上
の添加量では若干対糖収率は減少する傾向にあ
つた。糖の添加を６％にすると（参考例１参
照）、培養液の粘性は36℃で8000センチポアズ
（cp）となり、ほとんど培養液は流動性がなく
なり撹拌速度を上げても影響なく培養の限界と
なつた。 第１表に培地中のグルコースの添加量を変え
て培養したときのヒアルロン酸生産量を示し
た。即ち生成ヒアルロン酸を常法により精製し
た結果、グルコース１％添加時には対糖収率15
％で1.5ｇ／、６％添加時には対糖収率11％
で6.7ｇ／のヒアルロン酸が得られた。
【表】
次いでグルコース２％の組成の培地を使用
し、希釈率0.3（hr-1）で連続培養を行うと、操
作し易い低粘度で極めて安定に連続的に高収
率、高生産率でヒアルロン酸を生産することが
できた。ヒアルロン酸の対糖収率は15％、その
生産性は0.9ｇ／／hrであり、一日当たり
21.6ｇ／のヒアルロン酸を生産することがで
きた（参考例２参照）。 本菌は高分子物質として、ヒアルロン酸以外
の物質は培養液中に蓄積しないので、培養後、
培養液中に蓄積されたヒアルロン酸の分離、精
製は容易で、既に公知の多糖類の分離精製法を
用いればよい。 ヒアルロン酸の分離、精製法の一例を示す。
培養液を適当な粘度となるように（100センチ
ボアズ以下が好ましい）水で希釈し、トリクロ
ル酢酸にてPHを４以下にする。次いで遠心分離
あるいは膜濾過（ポアーサイズ 0.2μｍ以下）
によつて菌体を分離除去する。次ぎに溶液中に
溶解している低分子物質を、限外濾過、透析、
有機溶媒沈澱法又はイオン交換樹脂等による吸
着法などによつて除去した後、有機溶媒沈澱
法、凍結乾燥又は噴霧乾燥などの手段を用いて
ヒアルロン酸を得ることができる（参考例１参
照）。 このようにして上記培養液から抽出精製して得
たヒアルロン酸について、ヒアルロン酸標品
（Sigma社製）と対比しながら種々の検討を行つ
た結果、本品はヒアルロン酸であることを確認し
た。以下にその性質を示す。 (1) 酢酸セルロース膜を用いる電気泳動において
標品と同じ移動度を示す。 (2) 放線菌ヒアルロニダーゼ（天野製薬製）によ
つて分解を受け、その分解物をシリカゲル薄層
クロマトグラフイーにかけると、処理後の標品
分解物と同じ移動度で二つのスポツトが現れ
る。 (3) 化学組成を分析すると、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンとＤ−グルクロン酸がモル比１：
１で存在する。 (4) 比施光度は〔α〕20 D＝−69°である。 (5) 薄膜法による赤外吸収スペクトルは第３図の
通りで標品と同じ。 (6) 重水に溶解して測定した 13C−NMRスペク
トルは第４図の通りで標品と同じ。 (7) 分子量は粘度測定法（T.C.Laurent et al.，
Biochim.Biophys.Acta，42，476−485，1960）
による結果、200−300万であつた。 以下に実施例および参考例を示して本発明をさ
らに詳細に説明する。 実施例 １ 牛鼻粘膜より採取した、β−溶血性を示し、ヒ
アルロニダーゼを生産し、かつヒアルロン酸を生
産するストレプトコツカス・ズーエピデミカスを
トツド・ヒユーイツト・ブロス培地（デイフコ
製）中、37℃で10時間培養し、対数増殖期の菌体
を遠心分離によつて集め、低温下遠心分離を繰り
返しつつ２回0.05Mトリスーマレイン酸緩衝液
（PH6.0）を用いて無菌的に洗浄した後、１×
108／mlの菌濃度となるように同緩衝液に懸濁し、
これにNTGを200μｇ／mlのなるよう添加し37℃
にて30分間振とうした。つづいて、低温下菌体を
0.05Mトリス−マレイン酸緩衝液（PH6.0）で２
回洗浄した後、トツド・ヒユーイツト・ブロス培
地に接種して37℃、18時間培養した。この培養液
を滅菌生理食塩水にて１×103／mlとなるよう希
釈し、その0.1mlを血液（ウサギ脱繊血）寒天
（20ml）に混釈してまき培養し、溶血性を示さな
い集落を採取した。この変異株の取得頻度は約４
×10-6であつた。次ぎにこの非容血性菌株を、上
と同様に、トツド・ヒユーイツト・ブロス培地に
37℃で培養し、対数増殖期の菌体を集め、0.05M
トリスーマレイン酸緩衝液（PH6.0）で洗浄後、
NTG200μｇ／mlを含む同緩衝液中で37℃、20分
間振とうした。つづいて、低温下菌体を同緩衝液
で洗浄後、限外濾過処理培地（トツド・ヒユーイ
ツト・ブロス培地からアミコン製限外濾過膜YM
−10にて高分子画分を除去したもの）に接種して
37℃、18時間培養した。この培養液を滅菌生理食
塩水にて１−５×102／mlとなるよう希釈し、そ
の0.1mlをヒアルロン酸ソーダ0.1％を含む上記限
外濾過処理培地寒天（高純度寒天）上に塗布して
37℃、20−40時間モイスチヤーチヤンバー中で培
養し、増殖した集落中の菌をレプリカ法にて採取
しておき、寒天上に10％セチルピリジニユームク
ロライド水溶液を噴霧して、約50万の菌株の中か
ら集落周囲が濁る集落を形成するヒアルロニダー
ゼ非生産変異株ストレプトコツカス・ズーエピデ
ミカスYIT2030を取得した。 なお上記ヒアルロニダーゼ生産・非生産菌の識
別法はエリカバルケ等の方法（Erika Balke et
al.，Zbl.Bakt.Hyg.A，259，194−200，1985）
を改変して行なつた。 参考例 １ バツチ培養 グルコース６％、ポリペプトン（大五栄養化学
製）1.5％、パン酵母エキス（オリエンタル酵母
工業製）0.5％、燐酸第二カリ0.2％、硫酸マグネ
シウム７水塩0.1％、塩化カルシウム0.005％アデ
カノールLG−109（消泡剤 旭電化工業製）0.001
％の組成の培地（PH7.0）を10のジヤーフアー
メンターに５入れ、滅菌後、前培養したストレ
プトコツカス・ズーエピデミカスYIT2030を１
％接種し、6N−水酸化ナトリウム水溶液にて培
養PHを７に連続的に調節しながら37℃で42時間通
気撹拌培養した。 グルコースは別滅菌して、培養開始時に一度に
添加した。この時の培養経過を第１図に示す。培
養の経過と共に、ヒアルロン酸が蓄積し培養29時
間で、培養液の粘性は8000センチポアズ近くに達
しほとんど流動性がなくなり、培養42時間後、培
養液中のグルコースが零に達した時点で培養を終
了した。 収穫した培養液は流動性がないため、これを水
にて粘性が100センチポアズ以下となるように希
釈した。次ぎにこの溶液をトリクロル酢酸にてPH
を４以下にして、中空糸マイクロフイルターモジ
ユール（PW−103旭化成製）に通し、菌体およ
び不溶成分を除去し、更に中空糸限外濾過膜
（HIP30−43 アミコン製）に、濾過内液に水を
注加しながら通し溶液中の低分子物質を除去し
た。そしてこの溶液を凍結乾燥法によつて乾燥し
ヒアルロン酸を培養液１当たり6.7ｇ得た。 参考例 ２ 連続培養 グルコース濃度を2.5％にした以外は参考例１
と同一の組成の培地を10のジヤーフアーメンタ
ーに５入れ、滅菌後（グルコースは別滅菌）、
前培養したストレプトコツカス・ズーエピデミカ
スYIT2030を１％接種し、6N−水酸化ナトリウ
ム水溶液にて培養PHを７に調節しながら、37℃で
15時間通気撹拌培養した。その後グルコース濃度
を２％にした以外は参考例１と同一の組成の培地
を、希釈率0.3（hr-1）で連続的に注加しながら、
37℃、PH７で通気撹拌連続培養を１週間おこなつ
た。 この時の培養経過を第２図に示す。培養槽外に
流出した培養液を一定時間ごとに集め、参考例１
と同様にしてヒアルロン酸を抽出精製した。この
結果、ヒアルロン酸の対糖収率は15％、その生産
性は0.9ｇ／／hrであり一日当たり21.6ｇ／
のヒアルロン酸を得ることができた。 発明の効果 本発明によるストレプトコツカス・ズーエピデ
ミカス変異株を培養することによつて、今まで報
告されたストレプトコツカス属細菌を使つたヒア
ルロン酸の製造法における収率、収量をはるかに
上回る、ストレプトリジンの混入の全く無いかつ
高分子量のヒアルロン酸の高収率、高生産率で安
価に得ることができる。この様にして製造したヒ
アルロン酸は化粧品、医薬品原料として最適なも
のである。
し、希釈率0.3（hr-1）で連続培養を行うと、操
作し易い低粘度で極めて安定に連続的に高収
率、高生産率でヒアルロン酸を生産することが
できた。ヒアルロン酸の対糖収率は15％、その
生産性は0.9ｇ／／hrであり、一日当たり
21.6ｇ／のヒアルロン酸を生産することがで
きた（参考例２参照）。 本菌は高分子物質として、ヒアルロン酸以外
の物質は培養液中に蓄積しないので、培養後、
培養液中に蓄積されたヒアルロン酸の分離、精
製は容易で、既に公知の多糖類の分離精製法を
用いればよい。 ヒアルロン酸の分離、精製法の一例を示す。
培養液を適当な粘度となるように（100センチ
ボアズ以下が好ましい）水で希釈し、トリクロ
ル酢酸にてPHを４以下にする。次いで遠心分離
あるいは膜濾過（ポアーサイズ 0.2μｍ以下）
によつて菌体を分離除去する。次ぎに溶液中に
溶解している低分子物質を、限外濾過、透析、
有機溶媒沈澱法又はイオン交換樹脂等による吸
着法などによつて除去した後、有機溶媒沈澱
法、凍結乾燥又は噴霧乾燥などの手段を用いて
ヒアルロン酸を得ることができる（参考例１参
照）。 このようにして上記培養液から抽出精製して得
たヒアルロン酸について、ヒアルロン酸標品
（Sigma社製）と対比しながら種々の検討を行つ
た結果、本品はヒアルロン酸であることを確認し
た。以下にその性質を示す。 (1) 酢酸セルロース膜を用いる電気泳動において
標品と同じ移動度を示す。 (2) 放線菌ヒアルロニダーゼ（天野製薬製）によ
つて分解を受け、その分解物をシリカゲル薄層
クロマトグラフイーにかけると、処理後の標品
分解物と同じ移動度で二つのスポツトが現れ
る。 (3) 化学組成を分析すると、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンとＤ−グルクロン酸がモル比１：
１で存在する。 (4) 比施光度は〔α〕20 D＝−69°である。 (5) 薄膜法による赤外吸収スペクトルは第３図の
通りで標品と同じ。 (6) 重水に溶解して測定した 13C−NMRスペク
トルは第４図の通りで標品と同じ。 (7) 分子量は粘度測定法（T.C.Laurent et al.，
Biochim.Biophys.Acta，42，476−485，1960）
による結果、200−300万であつた。 以下に実施例および参考例を示して本発明をさ
らに詳細に説明する。 実施例 １ 牛鼻粘膜より採取した、β−溶血性を示し、ヒ
アルロニダーゼを生産し、かつヒアルロン酸を生
産するストレプトコツカス・ズーエピデミカスを
トツド・ヒユーイツト・ブロス培地（デイフコ
製）中、37℃で10時間培養し、対数増殖期の菌体
を遠心分離によつて集め、低温下遠心分離を繰り
返しつつ２回0.05Mトリスーマレイン酸緩衝液
（PH6.0）を用いて無菌的に洗浄した後、１×
108／mlの菌濃度となるように同緩衝液に懸濁し、
これにNTGを200μｇ／mlのなるよう添加し37℃
にて30分間振とうした。つづいて、低温下菌体を
0.05Mトリス−マレイン酸緩衝液（PH6.0）で２
回洗浄した後、トツド・ヒユーイツト・ブロス培
地に接種して37℃、18時間培養した。この培養液
を滅菌生理食塩水にて１×103／mlとなるよう希
釈し、その0.1mlを血液（ウサギ脱繊血）寒天
（20ml）に混釈してまき培養し、溶血性を示さな
い集落を採取した。この変異株の取得頻度は約４
×10-6であつた。次ぎにこの非容血性菌株を、上
と同様に、トツド・ヒユーイツト・ブロス培地に
37℃で培養し、対数増殖期の菌体を集め、0.05M
トリスーマレイン酸緩衝液（PH6.0）で洗浄後、
NTG200μｇ／mlを含む同緩衝液中で37℃、20分
間振とうした。つづいて、低温下菌体を同緩衝液
で洗浄後、限外濾過処理培地（トツド・ヒユーイ
ツト・ブロス培地からアミコン製限外濾過膜YM
−10にて高分子画分を除去したもの）に接種して
37℃、18時間培養した。この培養液を滅菌生理食
塩水にて１−５×102／mlとなるよう希釈し、そ
の0.1mlをヒアルロン酸ソーダ0.1％を含む上記限
外濾過処理培地寒天（高純度寒天）上に塗布して
37℃、20−40時間モイスチヤーチヤンバー中で培
養し、増殖した集落中の菌をレプリカ法にて採取
しておき、寒天上に10％セチルピリジニユームク
ロライド水溶液を噴霧して、約50万の菌株の中か
ら集落周囲が濁る集落を形成するヒアルロニダー
ゼ非生産変異株ストレプトコツカス・ズーエピデ
ミカスYIT2030を取得した。 なお上記ヒアルロニダーゼ生産・非生産菌の識
別法はエリカバルケ等の方法（Erika Balke et
al.，Zbl.Bakt.Hyg.A，259，194−200，1985）
を改変して行なつた。 参考例 １ バツチ培養 グルコース６％、ポリペプトン（大五栄養化学
製）1.5％、パン酵母エキス（オリエンタル酵母
工業製）0.5％、燐酸第二カリ0.2％、硫酸マグネ
シウム７水塩0.1％、塩化カルシウム0.005％アデ
カノールLG−109（消泡剤 旭電化工業製）0.001
％の組成の培地（PH7.0）を10のジヤーフアー
メンターに５入れ、滅菌後、前培養したストレ
プトコツカス・ズーエピデミカスYIT2030を１
％接種し、6N−水酸化ナトリウム水溶液にて培
養PHを７に連続的に調節しながら37℃で42時間通
気撹拌培養した。 グルコースは別滅菌して、培養開始時に一度に
添加した。この時の培養経過を第１図に示す。培
養の経過と共に、ヒアルロン酸が蓄積し培養29時
間で、培養液の粘性は8000センチポアズ近くに達
しほとんど流動性がなくなり、培養42時間後、培
養液中のグルコースが零に達した時点で培養を終
了した。 収穫した培養液は流動性がないため、これを水
にて粘性が100センチポアズ以下となるように希
釈した。次ぎにこの溶液をトリクロル酢酸にてPH
を４以下にして、中空糸マイクロフイルターモジ
ユール（PW−103旭化成製）に通し、菌体およ
び不溶成分を除去し、更に中空糸限外濾過膜
（HIP30−43 アミコン製）に、濾過内液に水を
注加しながら通し溶液中の低分子物質を除去し
た。そしてこの溶液を凍結乾燥法によつて乾燥し
ヒアルロン酸を培養液１当たり6.7ｇ得た。 参考例 ２ 連続培養 グルコース濃度を2.5％にした以外は参考例１
と同一の組成の培地を10のジヤーフアーメンタ
ーに５入れ、滅菌後（グルコースは別滅菌）、
前培養したストレプトコツカス・ズーエピデミカ
スYIT2030を１％接種し、6N−水酸化ナトリウ
ム水溶液にて培養PHを７に調節しながら、37℃で
15時間通気撹拌培養した。その後グルコース濃度
を２％にした以外は参考例１と同一の組成の培地
を、希釈率0.3（hr-1）で連続的に注加しながら、
37℃、PH７で通気撹拌連続培養を１週間おこなつ
た。 この時の培養経過を第２図に示す。培養槽外に
流出した培養液を一定時間ごとに集め、参考例１
と同様にしてヒアルロン酸を抽出精製した。この
結果、ヒアルロン酸の対糖収率は15％、その生産
性は0.9ｇ／／hrであり一日当たり21.6ｇ／
のヒアルロン酸を得ることができた。 発明の効果 本発明によるストレプトコツカス・ズーエピデ
ミカス変異株を培養することによつて、今まで報
告されたストレプトコツカス属細菌を使つたヒア
ルロン酸の製造法における収率、収量をはるかに
上回る、ストレプトリジンの混入の全く無いかつ
高分子量のヒアルロン酸の高収率、高生産率で安
価に得ることができる。この様にして製造したヒ
アルロン酸は化粧品、医薬品原料として最適なも
のである。
第１図は本発明の参考例１におけるヒアルロン
酸製造の培養経過を示す図であり、第２図は参考
例２における培養経過を示す図であり、第３図お
よび第４図はそれぞれ参考例１で得られたヒアル
ロン酸の赤外吸収スペクトルおよびNMRスペク
トルを示す図である。
酸製造の培養経過を示す図であり、第２図は参考
例２における培養経過を示す図であり、第３図お
よび第４図はそれぞれ参考例１で得られたヒアル
ロン酸の赤外吸収スペクトルおよびNMRスペク
トルを示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒアルロン酸生産能を有し、ヒアルロニダー
ゼ非生産性でかつ非溶血性を示すストレプトコツ
カス・ズーエピデミカス（Streptococcus
zooepidemicus）。 ２ 下記の菌学的性質を示す特許請求の範囲第１
項に記載のストレプトコツカス・ズーエピデミカ
ス (a) グラム染色性：陽性 (b) 10℃増殖性：陰性 (c) 45℃増殖性：陰性 (d) 0.1％メチレンブルー抵抗性：陰性 (e) 6.5％食塩抵抗性：陰性 (f) 40％胆汁抵抗性：陰性 (g) バシトラシン抵抗性：陽性 (h) PH9.6抵抗性：陰性 (i) 60℃，30分抵抗性：陰性 (j) ゼラチン分解性：陰性 (k) 澱粉分解性：陽性 (l) 馬尿酸ソーダ分解性：陰性 (m) エスクリン分解性：弱陽性 (n) アルギニン分解性：陽性 (o) 糖醗酵性：グルコース、ガラクトース、シ
ユークロース、ラクトース、マルトース、ソル
ビトールおよびサリシンは陽性、 グリセリン、マンニトール、トレハロースお
よびアラビノースは陰性。 ３ ストレプトコツカス・ズーエピデミカスがス
トレプトコツカス・ズーエピデミカスYIT2030
（微工研条寄第1305号）である特許請求の範囲第
１項または第２項に記載のストレプトコツカス・
ズーエピデミカス。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61099447A JPS62257382A (ja) | 1986-05-01 | 1986-05-01 | 新規なストレプトコツカス・ズ−エピデミカス |
| US07/038,907 US5023175A (en) | 1986-05-01 | 1987-04-16 | Novel production process of hyaluronic acid and bacterium strain therefor |
| CA000535098A CA1314508C (en) | 1986-05-01 | 1987-04-21 | Production process of hyaluronic acid and bacterium strain therefor as well as cosmetic composition containing hyaluronic acid |
| AU71960/87A AU598809B2 (en) | 1986-05-01 | 1987-04-24 | Novel production process of hyaluronic acid and bacterium strain therefor as well as cosmetic composition containing hyaluronic acid |
| KR1019870003999A KR960005736B1 (ko) | 1986-05-01 | 1987-04-25 | 히아루론산의 신규 생산방법 |
| DE3750733T DE3750733T2 (de) | 1986-05-01 | 1987-04-29 | Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure, dafür benötigte Bakterienstämme und kosmetische Zusammensetzung, welche Hyaluronsäure enthält. |
| EP87106247A EP0244757B1 (en) | 1986-05-01 | 1987-04-29 | Novel production process of hyaluronic acid and bacterium strain therefor as well as cosmetic composition containing hyaluronic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61099447A JPS62257382A (ja) | 1986-05-01 | 1986-05-01 | 新規なストレプトコツカス・ズ−エピデミカス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62257382A JPS62257382A (ja) | 1987-11-09 |
| JPH044868B2 true JPH044868B2 (ja) | 1992-01-29 |
Family
ID=14247615
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61099447A Granted JPS62257382A (ja) | 1986-05-01 | 1986-05-01 | 新規なストレプトコツカス・ズ−エピデミカス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62257382A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0713099B2 (ja) | 1988-12-14 | 1995-02-15 | 工業技術院長 | 感光性ポリビニルアルコール誘導体 |
| AU2003252566A1 (en) | 2002-08-19 | 2004-03-03 | Kolon Ind. Inc. | Microorganism producing hyaluronic acid and purification method of hyaluronic acid |
| JP4920552B2 (ja) * | 2007-11-07 | 2012-04-18 | 株式会社ヤクルト本社 | ヒアルロン酸の製造方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60251898A (ja) * | 1984-05-25 | 1985-12-12 | Shiseido Co Ltd | 醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法 |
-
1986
- 1986-05-01 JP JP61099447A patent/JPS62257382A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62257382A (ja) | 1987-11-09 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |