JPS6210517B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗乳酸菌活性と抗腫瘍活性をもつ新抗
生物質248−Sq−2A物質および248−Sq−2B物
質、ならびにその製造法に関する。以下、単に
248−Sq−２物質と記載するときは248−Sq−2A
物質または248−Sq−2B物質あるいはこれらの混
合物を指す。 本発明者は長野県で採取した土壤試料から分離
されたストレプトミセス属の菌株で248−Sq ２
の番号を与えた微生物の培養液中に抗乳酸菌活性
をもつ２つの物質が存在することを見出し、これ
ら物質を単離、精製し、さらに新規物質であるこ
とを認めて248−Sq−2A物質、248−Sq−2B物質
と命名してその物理化学的および生物学的性質を
研究した。 本発明の248−Sq−2Aおよび248−Sq−2B物質
は共通してそれぞれ次の諸性質を有する。これら
は白色非結晶性の粉末であり、水に易溶、アルコ
ール類たとえばメタノールに僅溶、ケトン類例え
ばアセトン、および酢酸エチル、塩素化炭化水素
溶媒、例えばクロロホルムに事実上不溶、その融
点は220℃（分解を伴なう）である。 248−Sq−2A物質の紫外吸収スペクトル（水中
25mg／３c.c.の濃度で測定）は220nｍまで特徴的
吸収を示さず、その赤外吸収スペクトル（臭化カ
リウム錠で測定）を添付図面の第１図に示した。
主な赤外吸収帯〔波数（cm^-1）〕は次の通りであ
る。 3260（ｓ） 2880（ｗ） 1660（ｓ） 1530（ｍ） 1410（ｍ） 1230（ｍ） 1165（ｗ） 1155（ｗ） 1050（ｍ） 960（ｗ） 但し、ｓ＝強、ｍ＝中程度、ｗ＝弱を示す。 248−Sq−2A物質は下記の混合溶媒系で展開す
るとシリカゲル薄層の上昇クロマトグラフイーで
次の如く単一スポツトを与える。 (1) クロロホルム−メタノール−アンモニア水
（２：３：１容量比）の展開溶媒でRf0.75 (2) ブタノール−酢酸−水（４：１：２）の展開
溶媒でRf0.25 248−Sq−2A物質は、炭素、水素、窒素および
酸素を含む。その元素組成は、おおよそ次の通り
である。 C51.10％、H7.14％、N15.83％、O26.37％その
元素分析、プロトンNMRスペクトル（添付図面
の第３図）、ならびに炭素¹³C NMRのスペクトル
から248−Sq−2A物質は次の実験式C₃₁H₅₂N₈O₁₂
を有すると思われる。更にプロトンNMRスペク
トルおよび炭素¹³C NMRスペクトルは248−Sq−
2Aの分子内に六つのメチル基が存在することを
示す。 248−Sq−2A物質の紫外吸収スペクトル（水中
25mg／３c.c.の濃度で測定）は220nｍまで特徴的
吸収を示さず、その赤外吸収スペクトル（臭化カ
リウム錠で測定）を添付図面の第２図に示す。主
な赤外吸収帯〔波数（cm^-1）〕は次の通りである。 3260（ｓ） 2880（ｗ） 1660（ｓ） 1530（ｍ） 1410（ｍ） 1230（ｍ） 1165（ｗ） 1155（ｗ） 1050（ｍ） 960（ｗ） 但し、ｓ＝強、ｍ＝中程度、ｗ＝弱を示す。 248−Sq−2B物質は下記の混合溶媒系を用いる
シリカゲル薄層の上昇クロマトグラフイーで次の
如く単一スポツトを与える。 (1) クロロホルム−メタノール−アンモニア水
（２：３：１容量比）の展開溶媒でRf0.70 (2) ブタノール−酢酸−水（４：１：２）の展開
溶媒でRf0.20 248−Sq−2B物質は炭素、水素、窒素および酸
素を含む。その元素組成はおおよそ次の通りであ
る。 C48.98％、H6.71％、N16.33％、O27.99％その
元素分析、プロトンNMRスペクトル（添付図面
の第４図）、ならびに炭素¹³C NMRのスペクトル
から248−Sq−2Bは次の実験式C₂₈H₄₆N₈O₁₂を有
すると思われる。更にプロトンNMRスペクトル
および炭素¹³C NMRスペクトルは248−Sq−2B
の分子内に五つのメチル基が存在することを示
す。 本発明の248−Sq−２物質は次に述べる抗菌性
を有する。 248−Sq−2Aおよび248−Sq−2A物質はある種
のグラム陽性菌に対して静菌活性を示す。幾つか
の微生物に対する248−Sq−2Aおよび248−Sq−
2Bの静菌活性を常用の倍数希釈法で測定された
最小生育阻止濃度（M.I.C.）（mcg／ml）で次表
に示す。

【表】

【表】 更に、248−Sq−2A、および248−Sq−2B物質
は次表に示す組成の合成培地上で乳酸菌を生育さ
せた際に強い抗乳酸菌活性を示す。

【表】 本合成培地上での乳酸菌（Lactobacillus
casei）に対する最小生育阻止濃度は248−Sq−
2A物質で0.3mcg／ml、また248−Sq−2B物質で
0.5mcg／mlである。 更に、本発明の248−Sq−２物質についてその
抗腫瘍活性を見るために、サルの腫瘍ウイルス
SV−40の感染により腫瘍転換した細胞と正常細
胞とに供給物質を作用させた後にその細胞の形態
の変化の差を観察して抗腫瘍活性を評価する標準
方法に従つて試験すると、248−Sq−2Aおよび
248−Sq−2B物質は50mcg／mlの濃度で抗腫瘍活
性があることが認められ、本発明の新規物質は抗
腫瘍剤としての用途が期待される。 本発明の第２の要旨は、ストレプトミセス属に
属する248−Sq−２物質生産菌を培養し、その培
養物から248−Sq−2A物質又は248−Sq−2B物質
又はこれらの混合物を採取することを特徴とする
抗生物質248−Sq−２物質の製造法にある。248
−Sq−２物質生産菌の一例としては、本発明者
により長野県で採取した土壤試料から分離された
前述のストレプトミセス属の248−Sq−２株があ
る。この菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
に昭和56年２月18日、寄託番号5882号で寄託され
てある。 この菌株は、少量の土壤試料を滅菌蒸留水中に
けん濁し、このけん濁液を種々な濃液に希釈し、
そして各希釈液の少量を栄養寒天培地を含むペト
リ皿の表面に拡げ、微生物の発育を許す27℃で２
〜３日間インキユベーシヨン後、コロニーを取り
出し、斜面栄養寒天に移植して一層豊富な培養を
作り出すようにして一般の菌単離法に従つて単離
されたものである。 この248−Sq−２株の菌学的性質を次に記載す
るが、この菌株はストレプトミセス・シイラタス
の一新菌株であると認められた。 (a) 形態的性状 栄養菌糸は巾0.5〜0.9μｍ、単軸分枝、寒天
培地上では分断しないが、液体培地で振盪培養
するとコリネバクテリア状に分断する。空中菌
糸は比較的短い主軸上に短い胞子柄を房状に単
軸分枝し、その上に長い胞子鎖を着生する。胞
子鎖は通常直状、まれに曲状、ループ状を示
し、10〜50個またはそれ以上の胞子からなつて
いる。胞子は長円形（0.6〜0.8×1.3〜2.0μ
ｍ）または指骨形（フアランギフオーム；0.3
〜0.5×1.3〜2.0μｍ）、平滑表面を呈す。特殊
形態として集中菌糸、空中菌核状物体を形成
し、胞子のう、運動性胞子などは観察されな
い。 (b) 細胞壁タイプ 全細胞加水分解法によりヂアミノピメリン酸
（DAP）の糖成分を調べた。LL−DAPを含み
メゾ−DAPを含まず、分類指標となる糖を含
まない。すなわち、細胞壁タイプを示す。 (c) 培養性状 培養性状はISPの方法に準じて観察し、下記
の第３表に示す。 (d) 生理的性状 生理的性状は後記の第４表に示す。

【表】

【表】

【表】 (e) 炭素源の同化性 プリドハム・ゴドリーブ寒天培地を用いて観
察し、結果は第５表に示す。

【表】

【表】 放線菌248−Sq2株はその形態学的性状と細胞
壁タイプＩであることよりストレプトミセス属に
包含されると判断される。 本菌株は菌叢色が赤色系列と灰色系列との両者
にまたがり、胞子鎖の形態も直状（RF）ときに
曲状からループ状（RA）を示し、空中菌核状物
体を形成し、平滑胞子を着生する。これらの特性
と炭素源の同化性を基準にして、バージー氏細菌
同定便覧及びISP記載により検索した。その結
果、ストレプトミセス・シラタス（S.
cirratus）、ストレプトミセス・ポリクロモゲネ
ス（S.polychromogenes）の２種が本菌株に近縁
であり、菌叢色が赤色と灰色の両系列にまたがる
前者が最も近縁であると判断される。 本菌株は胞子鎖が通常RFを示し、典形的RAで
ない点、メラニン様色素を形成しない点でストレ
プトミセス・シラタスの標準株と異なる。一般に
RFとRAの両形態を示す菌株は培地組成、PH、温
度など培養条件により両形態の発現度合が変える
ことが知られており、ストレプトミセス・シラタ
ス標準株のメラニン様色素生成の陽性度はあまり
明確でないことなどの理由により、これらの相異
点は明確に種を分ける基準とは判断されない。よ
つて、本菌株はストレプトミセス・シラタスの新
菌株と同定し、ストレプトミセス・シラタス
（Streptomyces cirratus KOSHIYAMA et.al.）
248−Sq2株と称する。 本発明の方法では248−Sq−２物質生産菌、例
えば248−Sq−２株（FERM−P5882）を通常の
微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養
する。栄養源としては、従来ストレプトミセス属
の菌の培養に利用されている公知のものが使用で
きる。例えば炭素源としてグルコース、澱粉、グ
リセリン、シユクロース、水あめ、糖密等を使用
しうる。また窒素源として大豆粉、小麦胚芽、肉
エキス、ペプトン、乾燥酵母、コーンステイープ
リカー、硫酸アンモン、硝酸ソーダ等を使用しう
る。その他必要に応じて炭酸カルシウム、食塩、
塩化カリ、燐酸塩等の無機塩類を添加するほか、
菌の発育を助け、248−Sq−２物質の生産を促進
するごとき有機及び無機物を適当に添加すること
が出来る。 培養法としては、一般抗生物質生産の方法と同
じく、液体培養法、特に深部培養法が最も適して
いる。培養は好気的条件下で行われ、培養に適当
な温度は25〜35℃であるが、多くの場合、27℃付
近で培養する。かくして248−Sq−２物質の生産
は振盪培養、タンク培養共に３〜５日で最高に達
する。 248−Sq−２物質は主として培養物の液体部分
に存在するが後記の理化学性状で示すように水溶
性の物質であるのでその抽出・精製にあたつては
活性炭、ダイヤイオンHPのような微多孔の非イ
オン性吸着樹脂あるいはアンバーライトIR−
120、ダウエツクス50W等の陽イオン交換樹脂を
使用して吸着させ、これを有機溶媒又は適当な酸
溶液を用いて溶出することが出来る。 例えば培養液をダウエツクス50W（Ｈ型）の
樹脂塔を通過させ、有効成分を樹脂部に吸着さ
せ、これを0.5M−ピリジン−酢酸溶液で溶出す
る方法は本物質の精製法として有効な手段であ
る。 このような方法で得られた248−Sq−２物質の
粗粉末はセルロース、シリカゲル、アルミナ乃至
はセフアデツクスを使用するクロマトグラフイー
によつてさらに純度を高めることが出来る。 かくして得られた248−Sq−２物質は白色の無
定形粉末である。 248−Sq−2A物質と−2B物質との分離はシリ
カゲル又はセフアデツクスＧ−25のカラムに吸着
させた後にブタノール−酢酸−水（４：１：２容
比）で展開することにより行われる。 次に実施例により本発明の方法を説明する。 実施例 １ (イ) ストレプトミセス・シラタス248−Sq2株
（FERM−P5882）のスラントから１白金耳を
とり、滅菌されたYH培地を入れた15mlの試験
管内に接種、27℃で48時間振とう培養して前々
培養物を得た。デキストリン25ｇ、大豆粉20
ｇ、NaCl ５ｇ、CaCO₃4ｇを水で１にした
滅菌された培地（PH6.4）100mlを500mlの三角
フラスコに入れ、上記の前々培養物の２mlを接
種し27℃で72時間振とう培養して前培養液を得
た。 (ハ) 次の成分よりなる生産培地を30の醗酵器に
導入する。 デキストリン 375ｇ 大豆粉 300ｇ NaCl 75ｇ CaCO₃ 60ｇ 水道水 （13とするに十分な量） PHを4N塩酸溶液の添加により0.4に調節す
る。この培地をその中に122℃の水蒸気を20分
間通入することにより滅菌する。冷却後、培養
液の容種は滅菌過程で水蒸気が凝縮するために
15になりPHは7.0である。次にこれに上記の
前培養液（300ml）を接種する。培養を27℃で
72時間行つた。この間、400回転／分で回転す
るタービンにより撹拌し滅菌し空気（30／
分）を通気する。この操作の終りで培養液のPH
7.8であり容積は14であつた。 (ハ) 上記のようにして得た培養液14に過助剤
（500ｇ）を加えて過し、培養液を得る。
液をダイヤイオンHP−20のカラム（３）に
通し吸着後、メタノール（10）により溶出を
行なう。上記のようにして得た溶出液を減圧濃
縮によりメタノールを除き、濃縮液をダウエツ
クス50のカラムに通す。カラムを水洗後、５％
ピリジン水溶液（10）にて吸着物質を溶出す
る。減圧濃縮後PHを7.0に調節し、次にダイヤ
イオンHP−20のカラムに通し、水→100％メタ
ノールのグラジエント溶出を行なう。ここで２
通りの活性な区分Ａ及びＢが得られる。それぞ
れの活性区分を集め、減圧濃縮し、続いてダウ
エツクス50レジンでクロマトグラフイーをそれ
ぞれ行なう。0.5Mピリジン−酢酸溶液にて溶
出し、活性区分をそれぞれ集め減圧濃縮を行な
う。次にセフアデツクスＧ−25で分配クロマト
グラフイーをそれぞれ行なう。溶出をブタノー
ル−酢酸−水（４：１：２）で行ない、活性区
分をそれぞれ集め減圧濃縮を行なう。続いてセ
フアデツクスＧ−50のカラムに通し、活性区分
をそれぞれ濃縮、凍結乾燥により、248−Sq−
2A物質の50mg、248−Sq−2B物質の30mgを得
る。 実施例 ２ 実施例１(ロ)と同様にして得た培養液14に過
助剤（500ｇ）を加え培地を過し培養液を得
る。液（13）に活性炭500ｇを加え20分間撹
拌、過を行なう。次に活性炭を70％アセトン水
（10）（PH2.0）に混入し撹拌、過を行ない
液を得る。これに塩酸水溶液を加えPH7.0とし、
減圧濃縮を行ない、アセトンを除去して粗抽出液
（３）を得る。 上記のようにして得た粗抽出液をダウエツクス
50のカラムに通す。カラムを水洗後、５％ピリジ
ン水溶液（10）にて吸着物質を溶出する。減圧
濃出後PHを7.0に調節し、次にダイヤイオンHP20
のカラムに通し、水→100％メタノールのグラジ
エンド溶出を行なう。ここで２通りの活性区分
Ａ、Ｂが得られる。それぞれの活性区分を集め減
圧濃縮し続いてダウエツクス50レジンでクロマト
グラフイーをそれぞれ行なう。0.5Mピリジン−
酢酸溶液にて溶出し、活性区分をそれぞれ集め減
圧濃縮を行なう。次にセフアデツクスＧ−25で分
配クロマトグラフイーをそれぞれ行なう。溶出は
ブタノール−酢酸−水（４：１：２）混液を用
い、活性区分をそれぞれ集め、減圧濃縮を行な
う。続いてセフアデツクスＧ−50のカラムに通
し、活性区分をそれぞれ濃縮凍結乾燥により248
−Sq−2A物質の50mg、248−Sq−2B物質の30mg
を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は夫々に本発明の248−Sq−
Ａ及び−Ｂ物質の赤外吸収スペクトル図であり、
第３図及び第４図はプロトンNMRスペクトル図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 白色非結晶性の粉末で水に易溶、アルコール
   類たとえばメタノールに僅溶、ケトン類たとえば
   アセトンおよび酢酸エチル、塩素化炭化水素溶媒
   たとえばクロロホルムに事実上不溶、融点は220
   ℃（分解を伴なう）であり、紫外吸収スペクトル
   に特徴的吸収を示さず、赤外吸収スペクトル（臭
   化カリウム錠で測定）で波数3260、2880、1660、
   1530、1410、1230、1165、1155、1050および960
   cm^-1に吸収帯を示し、クロロホルム−メタノール
   −アンモニア水（２：３：１容量比）を用いたシ
   リカゲルの薄層上昇クロマトグラフイーで0.75の
   Rfを有しブタノール−酢酸−水（４：１：２容
   量比）を用いたシリカゲルの薄層上昇クロマトグ
   ラフイーで0.25のRfを有し、その元素組成はおお
   よそC51.10％、H7.14％、N15.38％、O26.37％で
   ある抗乳酸菌活性を有する248−Sq−2A物質と、
   白色非結晶性の粉末で水に易溶、アルコール類た
   とえばメタノールに僅溶、ケトン類たとえばアセ
   トンおよび酢酸エチル、塩素化炭化水素溶媒たと
   えばクロロホルムに事実上不溶、融点は220℃
   （分解を伴なう）であり、紫外吸収スペクトルに
   特徴的吸収を示さず、赤外吸収スペクトル（臭化
   カリウム錠で測定）では波数3260、2880、1660、
   1530、1410、1230、1165、1155、1050および960
   cm^-1に吸収帯を示し、クロロホルム−メタノール
   −アンモニア水（２：３：１容量比）を用いたシ
   リカゲルの薄層上昇クロマトグラフイーで0.70の
   Rfを有し、ブタノール−酢酸−水（４：１：２
   容量比）を用いたシリカゲルの薄層上昇クロマト
   グラフイーで0.20のRfを有し、その元素組成は
   C48.98％、H6.71％、N16.33％、O27.99％である
   抗乳酸菌活性を有する248−Sq−2B物質とからな
   る群から選ばれる抗生物質248−Sq−２物質。 ２ ストレプトミセス属に属する248−Sq−２物
   質生産菌を培養し、その培養物から248−Sq−2A
   物質又は248−Sq−2B物質又はこれらの混合物を
   採取することを特徴とする抗生物質248−Sq−２
   物質製造法。