JPS62116597A - 人インシユリンの製造方法 - Google Patents
人インシユリンの製造方法Info
- Publication number
- JPS62116597A JPS62116597A JP61266446A JP26644686A JPS62116597A JP S62116597 A JPS62116597 A JP S62116597A JP 61266446 A JP61266446 A JP 61266446A JP 26644686 A JP26644686 A JP 26644686A JP S62116597 A JPS62116597 A JP S62116597A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- insulin
- protecting group
- group
- derivative
- formula
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は人インシュリンの製造方法に関するものであり
、詳しくはＢｕ４２２位のアルギニンが保護基で修飾さ
れているインシュリン誘導体を保護基の脱離処理に付し
て人インシュリンを得る製造方法に関する。
、詳しくはＢｕ４２２位のアルギニンが保護基で修飾さ
れているインシュリン誘導体を保護基の脱離処理に付し
て人インシュリンを得る製造方法に関する。
インシュリンは糖果病の治療薬として代替品のない貴重
な薬物であり、現在上として牛インシュリンおよび豚イ
ンシュリンが治療に用いられている。しかし、これらの
インシュリンは構成アミノ酸の一部が人インシュリンと
異なっているため、体内で抗体が産生されることがあり
、抗体が産生されるとそれ以後のインシュリンの治療効
果が著しく低下するなどの閉頭を生じる。したがって、
工業的規模で行いうる人インシュリンの合成方法の確立
が強く望まれている。
な薬物であり、現在上として牛インシュリンおよび豚イ
ンシュリンが治療に用いられている。しかし、これらの
インシュリンは構成アミノ酸の一部が人インシュリンと
異なっているため、体内で抗体が産生されることがあり
、抗体が産生されるとそれ以後のインシュリンの治療効
果が著しく低下するなどの閉頭を生じる。したがって、
工業的規模で行いうる人インシュリンの合成方法の確立
が強く望まれている。
豚インンユリンは人インシュリンとＢ鎖の３０位のアミ
ノ酸が異なっているが、本発明者はこの相違するＢ鎖３
０位のアミノ酸を人インンユリンの３０位アミノ酸であ
るスレオニンに置換する方法を発見し、本発明を確立し
た。
ノ酸が異なっているが、本発明者はこの相違するＢ鎖３
０位のアミノ酸を人インンユリンの３０位アミノ酸であ
るスレオニンに置換する方法を発見し、本発明を確立し
た。
上記の方法によれば、大インシュリンとＢ鎖３０位のア
ミノ酸のみが異なる豚インシュリンを原料に用いて人イ
ンンユリンを容易に合成することができる。このように
して得られる人インシュリンが理想的な治療用インシュ
リンであることは論を俟たない。
ミノ酸のみが異なる豚インシュリンを原料に用いて人イ
ンンユリンを容易に合成することができる。このように
して得られる人インシュリンが理想的な治療用インシュ
リンであることは論を俟たない。
既に豚デスオクタペプチドインシュリンと人インシュリ
ンオクタペプチドから人インシュリンを得る試みはエム
・ニー・ルッテンベルグＣＭ、Ａ。
ンオクタペプチドから人インシュリンを得る試みはエム
・ニー・ルッテンベルグＣＭ、Ａ。
Ｒｕｔｔｅｎｂｅｒｇ ）によりサイエンス（５ｃｉｅ
ｎｃｅ） １７７巻６２３頁（１９７２年）に、アール
・オーへルマイヤ＝（Ｒ，Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ ）らに
よりサイッシュリフト・フユア・ヒジオロンッンエ・ヘ
ミ−（Ｚ。
ｎｃｅ） １７７巻６２３頁（１９７２年）に、アール
・オーへルマイヤ＝（Ｒ，Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ ）らに
よりサイッシュリフト・フユア・ヒジオロンッンエ・ヘ
ミ−（Ｚ。
Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ３５７巻７５９頁
（１９７６年）に示されているが、何れも化学的手段に
よるものであり、前者においては工程の最後にアルカリ
処理を含み、これに伴う副反応がさけられない。また後
者の場合は反応が非特異的で多くの副反応を生しるため
、精製が複雑かつ困難となり収率も著しく低い。従って
、工業的規模では到底行い得ない。
（１９７６年）に示されているが、何れも化学的手段に
よるものであり、前者においては工程の最後にアルカリ
処理を含み、これに伴う副反応がさけられない。また後
者の場合は反応が非特異的で多くの副反応を生しるため
、精製が複雑かつ困難となり収率も著しく低い。従って
、工業的規模では到底行い得ない。
本発明者らの方法は酵素によるインシュリン合成法で、
公知の化学的手段によるものと異なり、反応が特異的で
副反応を生ぜずラセミ化が起きず未反応原料も損傷なし
に回収できるなどの利点を有する。
公知の化学的手段によるものと異なり、反応が特異的で
副反応を生ぜずラセミ化が起きず未反応原料も損傷なし
に回収できるなどの利点を有する。
上記の方法は、トリプシンまたはトリプシン様酵素の作
用により、Ｂ鎖２２位のアルギニンが保護基で修ｉすれ
ておりＢ鎖３０位のアミノ酸が欠けているインシュリン
（下記の一般式１工で表わされ、以下化合物１１と記す
）に下記の一般式■で表わされるし一スレオニン誘導体
（以下化合物Ｉと記す）を縮合させ、得られた化合物（
下記の一般式ＩＩＩで表わされ、以下化合物ＩＩＩと記
す）の保護基を除去することよりなる。
用により、Ｂ鎖２２位のアルギニンが保護基で修ｉすれ
ておりＢ鎖３０位のアミノ酸が欠けているインシュリン
（下記の一般式１工で表わされ、以下化合物１１と記す
）に下記の一般式■で表わされるし一スレオニン誘導体
（以下化合物Ｉと記す）を縮合させ、得られた化合物（
下記の一般式ＩＩＩで表わされ、以下化合物ＩＩＩと記
す）の保護基を除去することよりなる。
（以下余白）
（式中、Ｒ３はグアニジノ基の保護基を表わす。）ＣＨ
。
。
ＣＨ−ＯＲ’
ＨＮ−ＣＨ−ＣＯＲ２Ｉ
（式中、Ｒ’は水素、Ｒ２はカルボキシ基の保護基を表
わす。） （以下余白） （式中、Ｒ’、Ｒ’およびＲ８はそれぞれ前記と同意義
を表わす。） なお、上式に用いられているアミノ酸はすべてＬ型であ
り、下記の意味を有する。
わす。） （以下余白） （式中、Ｒ’、Ｒ’およびＲ８はそれぞれ前記と同意義
を表わす。） なお、上式に用いられているアミノ酸はすべてＬ型であ
り、下記の意味を有する。
Ａｌａ アラニン Ａｒｇ アルギニン
Ａｓｐ アスパラギン酸 Ａｓｎ アスパラギ
ンＧｌｎ グルタミン Ｇｌｕ グルタミ
ン酸ｃ１ｙ グリシン Ｈｉｓ ヒスチ
ンン１１ａ イソロイシン Ｌｅｕ ロイシ
ンＬｙｓ リシン Ｐｒｏ プロリン
Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｓｅｒ セリンＩｈ
ｒ スレオニン Ｔｙｒ チロシンＶａｌ
バリン Ｃｙｓ システィン上記の
化合物ＩＩは、（１）先ず、豚より得たインシュリンを
用いてそのＢ鎖２２位に位置するアルキニンのグアニジ
ノ基に保護基を導入したのち酵素を作用させて３０位の
アミノ酸を切断する、または（２）豚よりえたインシュ
リンに酵素を作用許せてデスーＢ３０−イン〉ニリンと
したのも２２位のフルキニンのグアニ・７ノ基を修飾す
ることにより製造しうる。
Ａｓｐ アスパラギン酸 Ａｓｎ アスパラギ
ンＧｌｎ グルタミン Ｇｌｕ グルタミ
ン酸ｃ１ｙ グリシン Ｈｉｓ ヒスチ
ンン１１ａ イソロイシン Ｌｅｕ ロイシ
ンＬｙｓ リシン Ｐｒｏ プロリン
Ｐｈｅ フェニルアラニン Ｓｅｒ セリンＩｈ
ｒ スレオニン Ｔｙｒ チロシンＶａｌ
バリン Ｃｙｓ システィン上記の
化合物ＩＩは、（１）先ず、豚より得たインシュリンを
用いてそのＢ鎖２２位に位置するアルキニンのグアニジ
ノ基に保護基を導入したのち酵素を作用させて３０位の
アミノ酸を切断する、または（２）豚よりえたインシュ
リンに酵素を作用許せてデスーＢ３０−イン〉ニリンと
したのも２２位のフルキニンのグアニ・７ノ基を修飾す
ることにより製造しうる。
グアニジ７基の保護基導入は、２，３−ブタノオン、１
，２−シクロヘキサンンオン、フェニルグリオキサール
、２，４−ペンタジオンなとを、必髪に応してホウ酸イ
オンの存在下に反応させて実施する。詳細は生化学実験
講座１ クンバク質の化学ＩＶ（日本生化学会編、東京
化学同人）３４−４１頁に記載されている。
，２−シクロヘキサンンオン、フェニルグリオキサール
、２，４−ペンタジオンなとを、必髪に応してホウ酸イ
オンの存在下に反応させて実施する。詳細は生化学実験
講座１ クンバク質の化学ＩＶ（日本生化学会編、東京
化学同人）３４−４１頁に記載されている。
（１）の方法を行う場合はトリプシンでＢ鎖３０位のア
ミノ酸を切断するとよい。グアニジノ基の修飾法は、エ
ム・ローゼンブラット（ＭＲｏｓｅｎｂｌａｔｔ ）ら
によりバイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
） １７巻３１８８頁（１９７８年）に示されている。
ミノ酸を切断するとよい。グアニジノ基の修飾法は、エ
ム・ローゼンブラット（ＭＲｏｓｅｎｂｌａｔｔ ）ら
によりバイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
） １７巻３１８８頁（１９７８年）に示されている。
すなわち、原料となるインシュリンの溶液に１，２−ノ
クロヘキサンンオンを加え、０．２Ｍｍ酸塩（ｐＨ９）
存在下４０℃で１〜４時間または室温で一晩反応させた
後２０マドグラフイー、透析法などで精製し、得られた
［Ｎ７゜Ｎ’−（１，２−ンヒドロキシンクロヘキシレ
ン−１，２）（以下ＤＨＣＨと略記）−アルキニンーＢ
２２］−インシュリンに０．２Ｍ硼酸塩−（ｐＨ８）存
在下でトリプシンを加えて４０℃で１〜３日作用させ、
化合物工１を得る。
クロヘキサンンオンを加え、０．２Ｍｍ酸塩（ｐＨ９）
存在下４０℃で１〜４時間または室温で一晩反応させた
後２０マドグラフイー、透析法などで精製し、得られた
［Ｎ７゜Ｎ’−（１，２−ンヒドロキシンクロヘキシレ
ン−１，２）（以下ＤＨＣＨと略記）−アルキニンーＢ
２２］−インシュリンに０．２Ｍ硼酸塩−（ｐＨ８）存
在下でトリプシンを加えて４０℃で１〜３日作用させ、
化合物工１を得る。
また（２）の方法により、例えば、カルボキシペブチタ
ーゼＡを用いて豚インシュリンよりデスーＢ３０−イン
シュリン（豚型）が得られる。
ーゼＡを用いて豚インシュリンよりデスーＢ３０−イン
シュリン（豚型）が得られる。
この方法は、イー・ダブり１−・シュミット（Ｅ 譬
Ｓｃｈｍｉｔｔ ）らによりホツペーセイラーズ、サイ
トシュリフト、フユア・ヒジオロジツシエ伊ヘミ−（Ｈ
ｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ
ｆｉｉｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｃｈａｍｉ
ｅ） ３５９巻７９９頁（１９７８年）に記載されてい
る。ついで、この豚由来のデスーＢ３０−インシュリン
において、Ｂ鎖２２位のアルギニン側鎖を修飾し、化合
物１１を調製する。
Ｓｃｈｍｉｔｔ ）らによりホツペーセイラーズ、サイ
トシュリフト、フユア・ヒジオロジツシエ伊ヘミ−（Ｈ
ｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ
ｆｉｉｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｃｈａｍｉ
ｅ） ３５９巻７９９頁（１９７８年）に記載されてい
る。ついで、この豚由来のデスーＢ３０−インシュリン
において、Ｂ鎖２２位のアルギニン側鎖を修飾し、化合
物１１を調製する。
一般式１で示きれるし一スレオニン誘導体（以下化合物
■と記す）は通常の化学的方法で合成きれるが、その側
鎖官能基であるヒドロキシ基は保護きれていても保護諮
れていなくてもよい。保護する場合にはペプチド合成反
応で通常用いうる保護基などを用いるとよい。化合物Ｉ
のカルボキシ基は保護されていることが必須で、通常用
いられるカルボキン基保護基を使用する。例えは、１＝
ブチルやベンジルなどのアルキルやアラルキルエステル
、アミド、アニリノなどの置換アミド、さらに塩などの
形で修飾するとよい。
■と記す）は通常の化学的方法で合成きれるが、その側
鎖官能基であるヒドロキシ基は保護きれていても保護諮
れていなくてもよい。保護する場合にはペプチド合成反
応で通常用いうる保護基などを用いるとよい。化合物Ｉ
のカルボキシ基は保護されていることが必須で、通常用
いられるカルボキン基保護基を使用する。例えは、１＝
ブチルやベンジルなどのアルキルやアラルキルエステル
、アミド、アニリノなどの置換アミド、さらに塩などの
形で修飾するとよい。
上記の保護基の選択においては、それらの保護基の導入
または脱離処理について、インシュリンが変性したり失
活したりしないものを選択することを考慮すべきである
。ペプチド合成に用いられる保護基については、エム・
ボタンスンキーら（Ｍ、 Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ
ａｌ、 ）のベプチドシンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ ５
ｙｎｔｈｅｓｉｓ ）第２版（１９７６年）（ジョン・
ウィリー・アンド・サンス（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌａｙ ＆
５ｏｎｓ））に詳しく記載されている。
または脱離処理について、インシュリンが変性したり失
活したりしないものを選択することを考慮すべきである
。ペプチド合成に用いられる保護基については、エム・
ボタンスンキーら（Ｍ、 Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ
ａｌ、 ）のベプチドシンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ ５
ｙｎｔｈｅｓｉｓ ）第２版（１９７６年）（ジョン・
ウィリー・アンド・サンス（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌａｙ ＆
５ｏｎｓ））に詳しく記載されている。
なお、保護基の選択においては、一度の保護基脱離処理
によって同時に除去できるものを選択することが好まし
いことは当然である。
によって同時に除去できるものを選択することが好まし
いことは当然である。
化合物Ｉと化合物ＩＩの縮合反応はトリプシンまたはト
リプシン様酵素のペプチド結合形成反応に適した条件で
行なわれる。ｐＨ５〜８、特に６〜７付近が好ましく、
反応温度は０〜５０℃、とくに２０〜４０℃がよい。化
合物Ｉと化合物ＩＩの濃度は可能なかぎり高いことがの
ぞましい。さらに化合物■と化合物ＩＩは１：１〜１０
０：１のモル比で夏応させるのがよく、とくに２０：１
〜１００；１付近がよい。反応液には水と混合しうる適
当な有機溶媒を加える。有機溶媒の添加は、反応液中の
水の濃度を下げて、逆反応である加水分解反応を抑える
だけでなく、化合物工および化合物ＩＩの溶解性を著し
く高める点で効果がある。有機溶媒としては、例えば、
メタノール、エタノ−Ａｖ。
リプシン様酵素のペプチド結合形成反応に適した条件で
行なわれる。ｐＨ５〜８、特に６〜７付近が好ましく、
反応温度は０〜５０℃、とくに２０〜４０℃がよい。化
合物Ｉと化合物ＩＩの濃度は可能なかぎり高いことがの
ぞましい。さらに化合物■と化合物ＩＩは１：１〜１０
０：１のモル比で夏応させるのがよく、とくに２０：１
〜１００；１付近がよい。反応液には水と混合しうる適
当な有機溶媒を加える。有機溶媒の添加は、反応液中の
水の濃度を下げて、逆反応である加水分解反応を抑える
だけでなく、化合物工および化合物ＩＩの溶解性を著し
く高める点で効果がある。有機溶媒としては、例えば、
メタノール、エタノ−Ａｖ。
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、グリセ
リンなどを単独でまたは組合せて用いる。
リンなどを単独でまたは組合せて用いる。
とくに０〜６５％、とくに４０〜６０％の濃度で用いる
とよい。一般に有機溶媒を用いる場合は、原料の溶解度
、酵素の変性や加水分解反応などを考慮して水に対する
割合を決定する。反応液の緩衝剤としてはＤＨＣＨ−ア
ルギニン−Ｂ ２２ ノ安定化の為に硼酸塩が好適であ
る。
とよい。一般に有機溶媒を用いる場合は、原料の溶解度
、酵素の変性や加水分解反応などを考慮して水に対する
割合を決定する。反応液の緩衝剤としてはＤＨＣＨ−ア
ルギニン−Ｂ ２２ ノ安定化の為に硼酸塩が好適であ
る。
本発明で使用する酵素は、各種動物および微生物起源の
トリプシンおよびトリプシン様酵素を含む。後者の例と
しては、ストレプトマイセス属菌から抽出分離されたト
リプシン様酵素がある。同酵素については電属らがアー
カイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオ
ヒジクス（Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、 ） １２６巻９７１頁（１９６８年）に、吉田
らがエフイービーニス・レター（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、
） １５巻１２９頁（１９７１年）に記載している。
トリプシンおよびトリプシン様酵素を含む。後者の例と
しては、ストレプトマイセス属菌から抽出分離されたト
リプシン様酵素がある。同酵素については電属らがアー
カイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオ
ヒジクス（Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、 ） １２６巻９７１頁（１９６８年）に、吉田
らがエフイービーニス・レター（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、
） １５巻１２９頁（１９７１年）に記載している。
使用する酵素は混在するキモトリプシンまたはキモトリ
プシン様の活性を除去する目的でトシル−Ｌ−フェニル
アラニンクロロメチルケトン（以下ＩＰＣＫと記す）な
どで処理することが望ましい。
プシン様の活性を除去する目的でトシル−Ｌ−フェニル
アラニンクロロメチルケトン（以下ＩＰＣＫと記す）な
どで処理することが望ましい。
反応液の酵素濃度は基質濃度や酵素の活性で異なってく
るが、市販結晶トリプシンを用いる場合は、１ｍｇ／ｍ
１〜１０ ｍｇ／ ｍｌ付近がよい。酵素はそのまへ用
いてもよいし、適当な不溶性担体に結合又は包含さセた
固定化酵素として用いてもよい。
るが、市販結晶トリプシンを用いる場合は、１ｍｇ／ｍ
１〜１０ ｍｇ／ ｍｌ付近がよい。酵素はそのまへ用
いてもよいし、適当な不溶性担体に結合又は包含さセた
固定化酵素として用いてもよい。
反応時間は、反応条件により異なるが、通常は酵素反応
が平衡に達するに要する時間をとればよく、通常３〜７
２時間、多くの場合６〜２４時間程度である。
が平衡に達するに要する時間をとればよく、通常３〜７
２時間、多くの場合６〜２４時間程度である。
反応終了後反応液から目的の化合物ＩＩＩを採取する方
法は公知の種々の分離手段を用い行いうる。例えば、反
応液をゲル濾過にかけ未反応の化合物！および酵素を単
離回収する０回収した化合物Ｉおよび酵素はそのまへ再
使用できる。残部に化合物ＩＩＩとデスーＢ３０−イン
シュリンが含まれる。化合物ＩＩＩは凍Ｍ乾燥により得
ることができるが、最終目的物質入インシュリンを得る
ためには、化合物ＩＩＩを単離せずに、残部にアルギニ
ン保護基の脱離処理を施したのち適当なりロマトグラフ
イーまたはゲル濾過に付す、生成したＢ鎖末端スレオニ
ンのカルボキシル基が保護されたインシュリン誘導体と
Ｂ鎖３０位のアミノ酸が欠けているインシュリン（以下
デス−Ｂ２Ｏ−インシュリンと記す）が分離する０回収
したデスーＢ３０−インシュリンは再びＢｆｉ２２位の
アルギニンを修飾し、原料化合物ＩＩとして使用するこ
とができる。最後にＢ鎖末端スレオニンのカルボキシ基
の保護基をはずし、最終の目的化合物であるインシュリ
ンを得る。
法は公知の種々の分離手段を用い行いうる。例えば、反
応液をゲル濾過にかけ未反応の化合物！および酵素を単
離回収する０回収した化合物Ｉおよび酵素はそのまへ再
使用できる。残部に化合物ＩＩＩとデスーＢ３０−イン
シュリンが含まれる。化合物ＩＩＩは凍Ｍ乾燥により得
ることができるが、最終目的物質入インシュリンを得る
ためには、化合物ＩＩＩを単離せずに、残部にアルギニ
ン保護基の脱離処理を施したのち適当なりロマトグラフ
イーまたはゲル濾過に付す、生成したＢ鎖末端スレオニ
ンのカルボキシル基が保護されたインシュリン誘導体と
Ｂ鎖３０位のアミノ酸が欠けているインシュリン（以下
デス−Ｂ２Ｏ−インシュリンと記す）が分離する０回収
したデスーＢ３０−インシュリンは再びＢｆｉ２２位の
アルギニンを修飾し、原料化合物ＩＩとして使用するこ
とができる。最後にＢ鎖末端スレオニンのカルボキシ基
の保護基をはずし、最終の目的化合物であるインシュリ
ンを得る。
保護基の脱離方法は用いる保護基により異なるが、通常
の脱離方法に準して行えばよく、例えば、グアニジノ基
のＤＨＣＨ基脱離は１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７）
存在下３７°Ｃで１晩放置して行う。また、ヒドロキシ
基やカルボキシル基の保護基として使用されるｔ−ブチ
ル基はカチオン捕捉剤（例えば、アニソール）の存在下
トリフルオロ酢酸で処理すると脱離する。前記のように
単一の脱離処理で除去できる保護基を側鎖官能基および
スレオニンのカルボキシ基の保護に用いると脱離処理が
簡単で収率も向上する。カルボキシル末端がその他のエ
ステル、アミド、置換アミド、塩などになっている場合
も、適当な加水分解処理や脱塩操作により、保護基を除
去できる。
の脱離方法に準して行えばよく、例えば、グアニジノ基
のＤＨＣＨ基脱離は１Ｍヒドロキシルアミン（ｐＨ７）
存在下３７°Ｃで１晩放置して行う。また、ヒドロキシ
基やカルボキシル基の保護基として使用されるｔ−ブチ
ル基はカチオン捕捉剤（例えば、アニソール）の存在下
トリフルオロ酢酸で処理すると脱離する。前記のように
単一の脱離処理で除去できる保護基を側鎖官能基および
スレオニンのカルボキシ基の保護に用いると脱離処理が
簡単で収率も向上する。カルボキシル末端がその他のエ
ステル、アミド、置換アミド、塩などになっている場合
も、適当な加水分解処理や脱塩操作により、保護基を除
去できる。
化合物１１１は上記の如く、大インシュリンに変換でき
、得られた人インシュリンは先に記載したように血糖降
下作用を有する糖尿病治療薬として有用である。
、得られた人インシュリンは先に記載したように血糖降
下作用を有する糖尿病治療薬として有用である。
豚インシュリンより得た人インシュリンはマウスにおい
て豚インシュリンと同等の血糖降下作用を有することが
認められる。
て豚インシュリンと同等の血糖降下作用を有することが
認められる。
化合物ＩＩＩより得た大インシュリンは、市販の豚イン
シュリンや生インシュリンと同様に製剤化し、人に投与
される。すなわち、塩化亜鉛などを加えて安定な亜鉛複
合体としたり、リン酸水素ナトリウムや酢酸ナトリウム
等の緩衝剤を加えたり、等張液とするため塩化ナトリウ
ムを加えるなど、さらにクレゾール、フェノール、バラ
オキシ安息香酸アルキルエステル（例えば、メチル、エ
チル、プロピル、ブチルエステルなど）などの功腐剤を
加えるなどの市販のインシュリン製剤に用いられる様々
な調製法を利用して注射剤とする。
シュリンや生インシュリンと同様に製剤化し、人に投与
される。すなわち、塩化亜鉛などを加えて安定な亜鉛複
合体としたり、リン酸水素ナトリウムや酢酸ナトリウム
等の緩衝剤を加えたり、等張液とするため塩化ナトリウ
ムを加えるなど、さらにクレゾール、フェノール、バラ
オキシ安息香酸アルキルエステル（例えば、メチル、エ
チル、プロピル、ブチルエステルなど）などの功腐剤を
加えるなどの市販のインシュリン製剤に用いられる様々
な調製法を利用して注射剤とする。
かかる注射剤の投与量は患者の症状に応じて種々異なる
が、市販のインシュリン製剤の投与と同様に行えばよく
、成人１日約１〜１００単位を投与するとよい。
が、市販のインシュリン製剤の投与と同様に行えばよく
、成人１日約１〜１００単位を投与するとよい。
以下に実施例において、本発明化合物の製造例と示すが
、これら実施例は本発明を何ら限定するものではない。
、これら実施例は本発明を何ら限定するものではない。
なお、実施例で用いる略号は下記の意味を表わす。
ＯＢｕ’ ｔ−ブチルエステル
実施例１
（１）豚由来デス−８３０−インンユリン豚インシュリ
ン５００ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液（
ｐＨ８，３）１００ｍｌに溶解し、結晶カルポキンベブ
チターゼＡ（ワーンングトン社製、ジイソプロピルフル
オロホスフェート処理、４９ ｕ ７ｍｇ） ５ｍｇを
添加して室温で８時間反応させる。アラニンの生成量は
０．７７Ｍ／ＩＭインシュリンである。
ン５００ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液（
ｐＨ８，３）１００ｍｌに溶解し、結晶カルポキンベブ
チターゼＡ（ワーンングトン社製、ジイソプロピルフル
オロホスフェート処理、４９ ｕ ７ｍｇ） ５ｍｇを
添加して室温で８時間反応させる。アラニンの生成量は
０．７７Ｍ／ＩＭインシュリンである。
反応物を凍結乾燥した後０．５Ｍ酢酸に溶解し、セファ
デツクスＧ５０（超微細粒）にカラム（３，５Ｘ９５ｃ
ｍ）にかけ、０．５Ｍ酢酸で溶出する。１フラクシヨン
あたり１１．５ｍｌで、第４０から６０番目のフラクシ
ョンを集め凍結乾燥して標記化合物４６０ｍｇを集める
。収率９２％。
デツクスＧ５０（超微細粒）にカラム（３，５Ｘ９５ｃ
ｍ）にかけ、０．５Ｍ酢酸で溶出する。１フラクシヨン
あたり１１．５ｍｌで、第４０から６０番目のフラクシ
ョンを集め凍結乾燥して標記化合物４６０ｍｇを集める
。収率９２％。
６Ｎ塩酸で１１０°Ｃ１２４時間加水分解したアミノ酸
分析値は下記のとおりである。括弧内の数値は理論値を
表わす。上記の加水分解条件および表示方法は以下の実
施例においても同様である。
分析値は下記のとおりである。括弧内の数値は理論値を
表わす。上記の加水分解条件および表示方法は以下の実
施例においても同様である。
Ｌｙｓ １．００ （１）、Ｈｉｓ １．９１ （２）
、Ａｒｇ Ｏ，９５（１）、Ａｓｐ ３．２１ （３）
、Ｔｈｒ ２．０９ （２）、Ｓｅｔ ２．９７ （３
）、Ｇｌｕ ７．３５ （７）、Ｐｒｏ １．２５ （
１）、Ｇｌｙ ４．２９ （４）、Ａｌａ １．２６
（１）、Ｖａｔ ３．８６ （４）、Ｉｌａ １．５５
（２）、Ｌｅｕ ６．５３ （６）、Ｔｙｒ ４．０
８ （４）、Ｐｈｅ３．２２ （３）、（２）豚由来［
Ｂ ２２−Ａｒｇ（ＤＨＣＨ）コーデスーＢ５０−イン
シュリン 上記生成物２００ｍｇを０．２５Ｍ硼酸塩緩衝液（ｐＨ
９） １ 、７ｍｌに溶解し１，２−シクロヘキサン・
ジオン４５ｍｇを加え室温で１晩保つ。氷酢酸で酸性と
した後、セファデックスＧ５０（超微細粒）のカラム（
６Ｘ８５ｃｍ）にかけ０．５Ｍ酢酸で溶出する。
、Ａｒｇ Ｏ，９５（１）、Ａｓｐ ３．２１ （３）
、Ｔｈｒ ２．０９ （２）、Ｓｅｔ ２．９７ （３
）、Ｇｌｕ ７．３５ （７）、Ｐｒｏ １．２５ （
１）、Ｇｌｙ ４．２９ （４）、Ａｌａ １．２６
（１）、Ｖａｔ ３．８６ （４）、Ｉｌａ １．５５
（２）、Ｌｅｕ ６．５３ （６）、Ｔｙｒ ４．０
８ （４）、Ｐｈｅ３．２２ （３）、（２）豚由来［
Ｂ ２２−Ａｒｇ（ＤＨＣＨ）コーデスーＢ５０−イン
シュリン 上記生成物２００ｍｇを０．２５Ｍ硼酸塩緩衝液（ｐＨ
９） １ 、７ｍｌに溶解し１，２−シクロヘキサン・
ジオン４５ｍｇを加え室温で１晩保つ。氷酢酸で酸性と
した後、セファデックスＧ５０（超微細粒）のカラム（
６Ｘ８５ｃｍ）にかけ０．５Ｍ酢酸で溶出する。
２８０ｎｍの吸収を測定し、対応部を集めて凍結乾燥し
標記化合物１６８ｍｇを得る。収率８４％。
標記化合物１６８ｍｇを得る。収率８４％。
なお、高速液体クロマトグラフィー、スラブ電気泳動に
より、アルキニンがはｘ１ｏｏ％ＤＨＣＨ修飾されてい
ることが確認きれた。
より、アルキニンがはｘ１ｏｏ％ＤＨＣＨ修飾されてい
ることが確認きれた。
アミノ酸分析値
Ｌｙｓ １．００ （１）、Ｈｉｓ ２．０７ （２）
、Ａｒｇ”０．２７ （１）、Ａｓｐ ３．２Ｌ （３
）、Ｔｈｒ ２．０５ （２）、Ｓｅｒ ２．９８ （
３）、Ｇｌｕ ７．１９ （７）、Ｐｒｏ １．２３
（１）、ｃｌｙ ３．９１ （４）、Ａｌａ １．２９
（１）、Ｖａｌ ３．９９ （４）、Ｉｌｅ １．５
７ （２）、Ｌｅｕ ６．５７ （６）、Ｔｙｒ ３．
４８ （４）、Ｐｈｅ ３．１６ （３）。
、Ａｒｇ”０．２７ （１）、Ａｓｐ ３．２Ｌ （３
）、Ｔｈｒ ２．０５ （２）、Ｓｅｒ ２．９８ （
３）、Ｇｌｕ ７．１９ （７）、Ｐｒｏ １．２３
（１）、ｃｌｙ ３．９１ （４）、Ａｌａ １．２９
（１）、Ｖａｌ ３．９９ （４）、Ｉｌｅ １．５
７ （２）、Ｌｅｕ ６．５７ （６）、Ｔｙｒ ３．
４８ （４）、Ｐｈｅ ３．１６ （３）。
中加水分解時にＤＨＣＨ−Ａｒｇのはｙ′２０％がＡｒ
ｇに分解されたと考えられる（パンイ（Ｐａｔｔｈｙ
）ら、ジャーナル・才プ・バイオロジカル・ケミストリ
イ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ２５０巻５５
７頁（１９７５年））。
ｇに分解されたと考えられる（パンイ（Ｐａｔｔｈｙ
）ら、ジャーナル・才プ・バイオロジカル・ケミストリ
イ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） ２５０巻５５
７頁（１９７５年））。
（３）豚由来（Ｂ ２２−Ａｒ、ｇ（ＤＨＣＨ）、Ｂ５
０−Ｔｈｒ−ＯＢｕ’］−インシュリン （２）の生産物９７ 、８ｎ＋ｇ（１０ｍＭ）とＬ−ス
レオニンｔ−ブチルエステル酢酸塩２１１ｍｇ（５００
ｍＭ）をエタノール／ンメチルホルムアミＦ混液（１：
１、ｖ／ｖ） １ 、０８ｍ１に溶解し、結晶トリプ
シン（ワーシングトン社製、３回再結晶）４．２ｍｇお
よび最終濃度が０．０１ｍＭになるようにＴＰＣＫを含
んだ０．５Ｍ硼酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）０．７２ｍ１
と混合し３７℃で１晩保つ。
０−Ｔｈｒ−ＯＢｕ’］−インシュリン （２）の生産物９７ 、８ｎ＋ｇ（１０ｍＭ）とＬ−ス
レオニンｔ−ブチルエステル酢酸塩２１１ｍｇ（５００
ｍＭ）をエタノール／ンメチルホルムアミＦ混液（１：
１、ｖ／ｖ） １ 、０８ｍ１に溶解し、結晶トリプ
シン（ワーシングトン社製、３回再結晶）４．２ｍｇお
よび最終濃度が０．０１ｍＭになるようにＴＰＣＫを含
んだ０．５Ｍ硼酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）０．７２ｍ１
と混合し３７℃で１晩保つ。
最後のｐＨは６．５であった。
氷酢酸で酸性とした後、セファデックスＧ５０（超微細
粒）のカラムでゲル濾過を行い、酵素活性、２８０ｎｍ
の紫外線吸収度、ニンヒドリン反応によりトリプシン部
、インシュリン部、スレオニン誘導体部に分ける（第１
図参照）。回収したＬ−スレオ二ンｔ−ブチルエステル
は約５０％であった。インシュリン部を凍結乾燥し、標
記化合物８７ｍｇを得た。
粒）のカラムでゲル濾過を行い、酵素活性、２８０ｎｍ
の紫外線吸収度、ニンヒドリン反応によりトリプシン部
、インシュリン部、スレオニン誘導体部に分ける（第１
図参照）。回収したＬ−スレオ二ンｔ−ブチルエステル
は約５０％であった。インシュリン部を凍結乾燥し、標
記化合物８７ｍｇを得た。
（４）豚由来［Ｂ ３０−１ｈｒ−ＯＢｕ’ ］−イイ
ンシュリ ン記（３）の生成物８５ｍＢを１Ｍヒドロキシアミン（
ｐＨ７） ７ 、５ｍｌに溶解し、窒素ガス置換を行い
２８°Ｃで１晩保ったのち０ 、 ＯＩＭトリス緩衝？
＆（ｐＨ７，４）に対して冷所で透析する。次いで７Ｍ
床床台含有０ 、 Ｏ１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，４）
で綴衝化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５のカラム
（１，９Ｘ２４．５ｃｍ）により４℃でクロマトグラフ
ィを行う。上記緩衝液８００ｍ１を流したのち食塩濃度
を０．３Ｍまで上げる濃度勾配溶出を行い、０．０８〜
０．０９Ｍｍ度付近の分画Ａと０．１３〜０．１４Ｍ１
度付近の分画Ｂを得る。各分画を直ちに０．０１Ｍ酢酸
アンモニウム溶液に対して冷所で透析し、３−４日間続
けたのち凍結乾燥する。分画Ａより３０ｍｇ、分画Ｂよ
り２５ｍｇの粉末を得る。高速液体クロマトグラフィー
・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で前者が標記化合物
であり、後者がデスーＢ３０−インシュリン（豚型）と
豚インシュリンの混合物であることが確認された。
ンシュリ ン記（３）の生成物８５ｍＢを１Ｍヒドロキシアミン（
ｐＨ７） ７ 、５ｍｌに溶解し、窒素ガス置換を行い
２８°Ｃで１晩保ったのち０ 、 ＯＩＭトリス緩衝？
＆（ｐＨ７，４）に対して冷所で透析する。次いで７Ｍ
床床台含有０ 、 Ｏ１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，４）
で綴衝化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５のカラム
（１，９Ｘ２４．５ｃｍ）により４℃でクロマトグラフ
ィを行う。上記緩衝液８００ｍ１を流したのち食塩濃度
を０．３Ｍまで上げる濃度勾配溶出を行い、０．０８〜
０．０９Ｍｍ度付近の分画Ａと０．１３〜０．１４Ｍ１
度付近の分画Ｂを得る。各分画を直ちに０．０１Ｍ酢酸
アンモニウム溶液に対して冷所で透析し、３−４日間続
けたのち凍結乾燥する。分画Ａより３０ｍｇ、分画Ｂよ
り２５ｍｇの粉末を得る。高速液体クロマトグラフィー
・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で前者が標記化合物
であり、後者がデスーＢ３０−インシュリン（豚型）と
豚インシュリンの混合物であることが確認された。
（５）人インシュリンの製造
（４）の生成物２８ｍｇにアニソール０．２ｍｌを含む
トリフルオロ酢酸２ｍｌを加え、室温で３０分保つ。窒
素気流中でトリフルオロ酢酸を除去したのちＩＮ酢酸２
ｍｌを加えエーテル１５ｍ１でア二ソールを抽出する。
トリフルオロ酢酸２ｍｌを加え、室温で３０分保つ。窒
素気流中でトリフルオロ酢酸を除去したのちＩＮ酢酸２
ｍｌを加えエーテル１５ｍ１でア二ソールを抽出する。
酢酸部を凍結乾燥し標記化合物２６ｍｇを得る。厘料の
豚由来デス−Ｂ３０−インシュリンの純度を７７％とす
ると収率３８％である。
豚由来デス−Ｂ３０−インシュリンの純度を７７％とす
ると収率３８％である。
氷晶はアミノ酸分析値、スラブゲル電気泳動、高速液体
クロマトグラムより標記の化合物と同定された。
クロマトグラムより標記の化合物と同定された。
アミノ酸分析値
Ｌｙｓ １．００ （１）、Ｈｉｓ １．８５ （２）
、Ａｒｇ ０．９３ （１）、Ａｓｐ ３．２１
（３）、 Ｔｈｒ ２．９４ （３）、 Ｓａｒ
２．９６ （３）、Ｇｌｕ ７．２３ （７）、Ｐ
ｒｏ １．２３ （１）、Ｇｌｙ ４．２７ （４＞、
Ａｌｇ １．１９ （１）、Ｖａｌ ３．８９ （４）
、Ｉｌａ １．５６ （２）、Ｌｅｕ ６．５７
（６）、 Ｔｙｒ ３．７８ （４）、 Ｐｈｅ
３．１ｇ （３）。
、Ａｒｇ ０．９３ （１）、Ａｓｐ ３．２１
（３）、 Ｔｈｒ ２．９４ （３）、 Ｓａｒ
２．９６ （３）、Ｇｌｕ ７．２３ （７）、Ｐ
ｒｏ １．２３ （１）、Ｇｌｙ ４．２７ （４＞、
Ａｌｇ １．１９ （１）、Ｖａｌ ３．８９ （４）
、Ｉｌａ １．５６ （２）、Ｌｅｕ ６．５７
（６）、 Ｔｙｒ ３．７８ （４）、 Ｐｈｅ
３．１ｇ （３）。
第１図は豚由来［Ｂ ２２−Ａｒｇ （Ｄ）ＩｃＨ）、
Ｂ５０− Ｔｈｒ−ＯＢｕ’ ］−インンユリンを分離
する際のカラムクロマトグラフィーによる流出パターン
を示す。 特許出願人 塩野義製薬株式会社 代 理 人 弁理士 潮１）雄「−〇第１区 Ａ２８０口ｍ（−）
Ｂ５０− Ｔｈｒ−ＯＢｕ’ ］−インンユリンを分離
する際のカラムクロマトグラフィーによる流出パターン
を示す。 特許出願人 塩野義製薬株式会社 代 理 人 弁理士 潮１）雄「−〇第１区 Ａ２８０口ｍ（−）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記の一般式で表わされるＢ鎖２２位のアルギニンが保
護基で修飾されているインシュリン誘導体を保護基の脱
離処理に付して人インシュリンを得ることを特徴とする
人インシュリンの製造方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾ｔは水素、Ｒ＾２はカルボキシ基の保護基
、Ｒ＾３はグアニジノ基の保護基をそれぞれ表わす。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61266446A JPS62116597A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | 人インシユリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56175029A JPS57118546A (en) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | Insulin derivative |
| JP61266446A JPS62116597A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | 人インシユリンの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56175029A Division JPS57118546A (en) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | Insulin derivative |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62116597A true JPS62116597A (ja) | 1987-05-28 |
| JPH0150718B2 JPH0150718B2 (ja) | 1989-10-31 |
Family
ID=26496420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61266446A Granted JPS62116597A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | 人インシユリンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62116597A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5191288A (ja) * | 1974-12-21 | 1976-08-10 |
-
1986
- 1986-11-07 JP JP61266446A patent/JPS62116597A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5191288A (ja) * | 1974-12-21 | 1976-08-10 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0150718B2 (ja) | 1989-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0477885B1 (en) | Parathyroid hormone derivatives | |
| JP4519324B2 (ja) | 共有結合で架橋されたインスリンダイマー | |
| CA2091873C (en) | Parathyroid hormone derivatives | |
| Takahashi et al. | Isolation and characterization of the three fractions (DE‐I, DE‐II and DE‐III) of rat‐liver Z‐protein and the complete primary structure of DE‐II | |
| JPH052654B2 (ja) | ||
| US4320196A (en) | Semi-synthesis of human insulin | |
| JPH0764875B2 (ja) | 血液凝固阻害作用を有する新規ポリペプチド | |
| NO153061B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin | |
| MC2131A1 (fr) | Nouveaux derives de peptides intestinaux vasoactifs | |
| JP3506274B2 (ja) | 新規ペプチドおよび免疫賦活剤 | |
| US5130236A (en) | Process for producing des(64,65)-proinsulin | |
| JP2641742B2 (ja) | 新規ペプチド及び抗菌剤 | |
| JPS6246560B2 (ja) | ||
| JPH0150718B2 (ja) | ||
| JP2782232B2 (ja) | プロテアーゼ阻害剤 | |
| EP0348399B1 (fr) | Sorbine et peptides derives, elevant l'absorption par les muqueuses | |
| JPS62116598A (ja) | インシユリン誘導体の製造方法 | |
| JPH05208999A (ja) | セリンプロテアーゼインヒビターおよびこれを含有する医薬組成物 | |
| JP3009719B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 | |
| JP3012291B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造方法及び用途 | |
| JPS6312480B2 (ja) | ||
| JP2965682B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 | |
| JP2965683B2 (ja) | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 | |
| US5538947A (en) | Growth inhibitory factor | |
| JP3012292B2 (ja) | 新規ペプチド、その製造法及び用途 |