JPS6216425A - 肥満細胞機能調節剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、単離した肥満細胞の機能調節剤に関するもの
である。

（従来技術） 肥満細胞は動物の結合組織内に存在し、細胞内にケミカ
ルメディエータ−と呼ばれる生物活性物質を含む顆粒を
数多く持っている。炎症反応及びアレルギー反応はとも
に、刺激を受けた肥満細胞が脱顆粒反応を起こし、ヒス
タミン、セロトニンなどのケミカルメディエータ−を放
出するところから始まる。免疫グロブリンＥの受容体を
持つ細胞として肥満細胞が注目され、肥満細胞における
刺激の伝達機構及び脱顆粒反応の作用機作などを解明す
ることがアレルギー反応を理解することに直接つながる
ため、肥満細胞の脱顆粒作用及び脱顆粒抑制作用等の機
能調節作用をもつ物質の開発が望まれている。

〔目　　的〕

そこで、本発明者らは、このような作用を有する物質が
産生ずるか否か広く検討を行ったところ、既知のユーロ
シジン（日本農芸化学会誌第２９巻６５０〜６５２ペー
ジ、　１９５５年）の構成成分中の紫外線吸収スペクト
ルが約３００〜３５０ｎｍに吸収極大（肩を含む）を示
す物質が肥満細胞機能調節作用を有することを認め、か
つ市販のストレプトベルティシリウム・ユーロシジカム
（Ｓｔ、ｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｅｕｒｏ
ｃｉｄｉｃｕｍ、ＩＦＯＮ（１１３４９１）株の培養濾
液中にも強力な肥満細胞機能調節作用を有する物質を産
生することを認め、この物質を単離、精製した結果、上
記と同一のユーロシジンの一成分であることを認めた。

従って、本発明は新規な肥満細胞機能調節剤を提供する
ことを目的とする。

〔構　　成〕

本発明は、ユーロシジンの構成成分からなり、紫外線吸
収スペクトルが約３００〜３５０ｎｍに吸収極大（肩を
含む）を示す物質を有効成分とする肥満細胞機能調節剤
を提供するものである。ユーロシジンの構成成分中に、
肥満細胞の機能に対して機能調節作用があることを見出
したのは、本発明者らが初めてである。以下において、
このユーロシジン構成成分中に含まれる肥満細胞機能調
節作用物質を、本物質と呼称する。

本物質は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を
用いて、ユーロシジン又はユーロシジン産生微生物培養
濾液から分離取得することができる。例えば、直径１０
ｍ＋ｍ、長さ２５０ｍｍのカラム（充填剤としてヌクレ
オシル５Ｃ８使用）を用いてＩ（ＰＬＣ分離を行うと、
第１図（ｂ）のように分離でき、約３００〜３５０ｎｍ
に紫外線吸スペクトル吸収極を示す４種の物質、即ち、
ピークＮｏ、ｌ”Ｎｏ、４の各ピークに相当する物質Ｎ
ｏ、ｌ〜Ｎｏ、４を得ることができるにれらの物質Ｎ０
９１〜Ｎｏ、４の紫外線吸収スペクトルを第２図（ａ）
〜（ｄ）に示した。これらの物質はそれぞれ約３０２ｎ
ｍ、約３１６ｎｍ、約３３２ｎｍ、及び約３４９ｎｍに
吸収極大（肩を含む）を示す。

なお、第１図は、本物質のＨＰＬＣ分離結果を示し、第
１図（ａ）はユーロシジン産生微産物の培養濾液がら分
離取得した本物質についての結果及び第１図（ｂ）はユ
ーロシジンについての結果を示す。

また、本物質は、ストレプトベルティシリウム・ユーロ
シジカム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　
ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｍ。

ＩＦＯＮａ１３４９１）株又はストレプトベルティシリ
ウム。

アルビレティキュリ（Ｓｔ、ｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ　ａｌｂｉｒｅ七１ｃｕｌｉ、ＩＦＯＮα１
２７３７）株を、一般培地に培養し、培地中シュ産生さ
せ、常法により採取することができる。例えば、炭素源
としてグルコース、シュークロース、マルトース、デキ
トリン、澱粉、グリセリン等を、窒素源としてはペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス等を用い、さら
に無機塩として、ＮａＣＱ、Ｋ　２ＨＰＯ４、Ｎａ　２
　ＨＰＯ４、Ｍｇ５Ｏ４等を加えた中性液体培地中で１
通気、攪拌することにより培養される。培地のｐＨは５
〜８、好ましくは７付近で培養される。培養温度は通常
、２０〜３５℃の範囲であるが、３０℃付近が好ましい
。例えばグルコース１．５％、ペプトン０．５％、肉エ
キス０．５％、酵母エキス０．５％、ＮａＣＱ　Ｏ，５
％を含むｐｉ（７，０の液体培地で３０℃、４０時間培
養することにより、本物質を生産させることができる。

培養液からの採取は、イオン交換樹脂法、及び吸着剤を
用いた吸脱着法や、高速液体クロマトグラフィー法等を
用いて行うことができる。

さらに１本物質は、菌体をメタノール等の有機溶媒を用
いる抽出処理した後、濃縮、結晶化等の通常の精製操作
を行うことによっても得ることができる。培養液中に含
まれる物質を分離回収するには、例えば、培養液中に１
／１０体積量のアンバーライトＸＡＤ　−７を加えて時
々攪拌しながら室温で約４時開眼着処理を行った後、ア
ンバーライトＸＡＤ　−７を濾別し、これを洗浄後、８
０％メタノール溶液で溶出処理する。溶出液を減圧濃縮
後、水に再溶解し、ｐＨ４，０に調整した後、ＣＭ−ト
ヨパールイオン交換クロマトグラフィーを行うと、０．
０５Ｍ酢酸−酢酸アンモニウムによるＰＨグラジェント
によりｐＨ５，７付近から溶出が始まる。この溶出液を
さらに ｐＨ８，５に調整し、ＤＥＡＥ！−トヨパールイオン交
換クロマトグラフィーを行うとＰＨ７，５付近から溶出
が始まる。さらに活性画分を、ＭＣＩゲルＣ）ＩＰ　−
２０Ｐ吸着カラムに吸着させ、４０％アセトニトリル溶
出画分を分取し、減圧乾固することにより本物質のうち
物質Ｎｏ、３を得ることができる。

次に、本物質の肥満細胞脱顆粒抑制活性の試験方法及び
その結果を以下に示す。

ラット腹腔内より腹水を採取し、４℃、１５０ｘｇの条
件で１０分間遠心した後、沈澱した細胞を、牛血清アル
ブミン重層遠心法等での方法により分離し、肥満細胞画
分を得た。これを０．２％牛血清アルブミンを含むタイ
ロード液に肥満細胞が１０’個／ｍ１２となるように懸
濁し、肥満細胞浮遊液を得た。

次に被験化合物を含む生理食塩水２０μ℃に肥満細胞浮
遊液２０μＱを入れて混和し、３７℃で１０分間反応さ
せた後、脱顆粒誘発剤として５μｇ／ｍＱのコンパウン
ド（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）４８／８０溶液１０μＱ（最終
濃度で１μｇ／ｍＱ）を加えて１０分間反応させ、水冷
後遠心して上澄を採った。上澄に含まれるヒスタミンを
ＨＰＬＣ法（Ｏｎｄａ等、　　Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ、　
　Ｊ、　Ｍａｄ、　Ｓｃｉ、。

第２７巻、９３〜９７ページ、　１９７８年）により定
量することにより測定した。

なお、前記脱顆粒誘発剤としては、コンパウンド４８／
８０（シグマ社製）の他に、コンカナバリンＡ（和光純
薬工業（株）社製）、イオノフオアＡ２３１８７（カル
ビオケム・ベーリング社製）はじめ、抗原抗体複合物な
ど一般に知られている任意の薬剤を用いることができる
。　次に、被験化合物の濃度を種々変えて測定を行い１
本測定系で１μｇ／ｌｎＱのコンパウンド４８／８０に
より誘発される肥満細胞脱顆粒を５０％抑制する化合物
の濃度［ＩＣｓ　ｏ）値を求めた。また、コンパウンド
４ｇ／８０の存在しない状態や、コレステロールを添加
した状態など各種の条件下で本物質の肥満細胞に対する
機能調節作用の測定も合せて行い、その結果は以下に示
すように、本物質には、強い肥満細胞機能調節作用をも
つことが認められた。

（１）本物質はいずれも、低濃度領域では肥満細胞脱顆
粒作用を示し、そのＩＣ５ｏ値は下記の表−１に示す通
りであった。

（２）本物質は、上記（１）の作用を示す濃度より高濃
度領域では、単独で肥満細胞脱顆粒作用を示し、本作用
は反応液のカルシウムイオン濃度に依存していた。

（３）上記（１）及び（２）の作用は、ステロール骨格
を有する物質の添加によりその作用の強さを減じること
も可能であった。

なお、本測定系で１μｇ／ｍΩのコンパウンド４８／８
０により誘発される肥満細胞脱顆粒作用を５０％抑制す
る化合物の濃度を１単位／ｍΩ〔１ユニット／ｍｆｆ１
とした。

表−１ 〔実施例〕 次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１ グルコース１．５％、ペプトン０．５％、肉エキス０．
５％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ２０．５％を含む
ｐＨ７，０の液体培地１００ｍ　Ｑを５００ｍ　Ｑの坂
ロフラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌する。こ
の培地に放線菌ストレプトベルティシリウム・ユーロシ
ジカム株の斜面寒天培地より１白金耳量を接種し、３０
℃、３日間往復しんどう培養を行った。この培養液と同
組成の培地２０ｍを３０Ｑ用ジャーファーメンタ−に仕
込み、ストレプトベルティシリウム・二−ロシジカム株
の前培養液３００ｍ　Ｑをこの培地に移し、３０℃、２
００回転、通気量毎分１０Ωで４０時間培養を行った。

培養終了後、７０００回転の連続遠心を行うことにより
、菌体と培養液とを分散し、黒かっ色の培養液１８１２
を得た。この培養液の肥満細胞脱顆粒抑制活性は６４２
，５００ユニツトであった。

実施例２ 実施例１で得た菌体に５倍量のメタノールを加えて攪拌
後、室温にて放置した。時々攪拌しながら２４時間装い
た後、菌体を濾別後、メタノール抽出液を濃縮し、乾固
した。得られた残渣をメタノールを用いて再溶解させ、
可溶性画分のみを採った。

再度濃縮後、生成する結晶性の物質ユーロシジンを得た
。本物質の肥満細胞に対する活性は約１１３，０００ユ
ニツトであった。

実施例３ ユーロシジンをメタノールに溶解させ、ＩＩＰＬｃにぞ
分離した。この場合の分離条件は次の通りである。

カラム：　　ヌクレオシル５Ｃ８充填、直径１０ｍｍ、
長さ２５０ｍｍ 使用溶媒：　アセトニトリル／酢酸アンモニウム緩衝液
（０，０１Ｍ、ｐ）１５．０）　＝　３５／６５流　速
：　　４ｍＡ／分 検　出：　　紫外波長３５０ｎｍにおける吸光度測定試
料濃度：　　０．２ｍｇ／ｍＱ 注入量：２００μＱ 上記条件によりユーロシジンの構成成分を分離したとこ
ろ、第１図（ｂ）のような各成分の分離結果を示し、該
当するピークに相当する物質Ｎａ　ｌ　”　Ｎα４の画
分を得た。各両分は減圧濃縮後、凍結乾燥をくり返し、
物質Ｎｏｌ〜Ｎα４を得た。この物質Ｎα１〜Ｎα４の
紫外線吸収スペクトルは第２図（、）〜（ｄ）に示す通
り、各物質はそれぞれ約３０２ｎｍ、約３１６ｒ＋ｍ、
約３３２ｒ＋Ｌ＋！及び約３４９ｎｍに吸収極大（肩を
含む）を示した。

実施例４ （１）実施例１で得られた培養液のうち５ρ中に、その
１７１０体積に相当する吸着剤アンバーライトＸＡＤ　
−７を加え、時々振とうしながら４時間室温にて吸着処
理した。吸引濾過により、吸着剤を濾別し、精製水で洗
浄した後、吸着剤体積の２倍量に相当する２０％メタノ
ール水溶液で洗浄した。その後、吸着剤体積の３倍量に
相当する８０％メタノール水溶液で溶出させ、溶出液を
減圧濃縮した後、精製水に溶解させた。はぼ１００％近
い活性が回収できた。

（２）次に、ＣＭ−トヨパール６５０Ｍカラム〔東洋曹
達工業環、カラム体積５３３ｍΩ、０．０５Ｍ酢酸−酢
酸アンモニウム（ｐＨ，０）で平衡化〕にｐｌ＋４．０
に調整した試料溶液を吸着させ、０．０５Ｍ酢酸−酢酸
アンモニウム（ｐＨ６，０）で溶出させた。最も強い活
性画分は溶出液のｐＨ５，７から溶出してきた。活性画
分の肥満細胞脱顆粒抑制活性は２５　、２５０ユニツト
であった。

（３）さらに上記（２）の活性画分を、ｐＨ８，５に調
整した後、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム〔東洋
曹達工業環、カラム体積１７９ｍ　Ｑ、０．０５Ｍ酢酸
アンモニウム−アンモニア水でｐＨ８，５に平衡化〕に
、吸着させ、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム−アンモニア
水（ｐＨ７゜５）で溶出させた。この活性画分の活性は
、１６，５００ユニツトであった。

（４）さらに、ＭＣＩゲル（ＣＨＰ　−２０Ｐ、三菱化
成製）を充填した吸着カラム（カラム体積４０ｍＡ）に
、前記（３）で得られた活性画分を吸着させ、２０％ア
セトニトリル水溶液で洗浄後、　４０％アセトニトリル
水溶液で溶出させ、減圧濃縮して白色物質を得た。

本物質をメタノールに溶解して、紫外線吸収スペクトル
を測定し、さらに前記実施例３で示した分離条件により
ＨＰＬＣ分離を行い。その結果を各々第１図（ａ）及び
第３図に示した。得られた物質はユーロシジンの構成成
分のうち物質Ｎα３と同じものであった。活性量は１２
，５００ユニツトであった。

実施例５ （１）ウィスター系雌性ラット（体重１５０〜２５０　
ｇ　）を脱血致死させ、腹腔内にタイロード液を２０ｍ
　Ｑ注入し、腹部を約２分間軽くマツサージした。開腹
後腹水を採取し、４℃にて１５０Ｘｇ、１０分間の条件
で遠心分離し、沈澱する細胞を集めた。この細胞をタイ
ロード液２ｍＱに懸濁させ、比重１．０６８に調製した
牛血清アルブミン含有生理食塩水４ｍｌ１に重層し、４
℃、ｌｏＯＸｇの条件で１２分間遠心分離後、沈澱する
細胞を集めた。タイロード液で２回洗浄′　した後、０
．２％牛血清アルブミンを含むタイロード液に肥満細胞
が約１０５個／ｍＱとなるようにｊり濁させ、肥満細胞
浮遊液を得た。

（２）被験化合物を含むリン酸緩衝液２０μＱと肥満細
胞浮遊液２０μＱを１０分間３７℃にて反応させ、最終
濃度ｌμｇ７ｍＱとなるようにコンパウンド４８／８０
溶液１０μＱを加え、さらに１０分間反応させた。反応
後１分間水冷した後、３０００Ｘｇ、４分間の条件で遠
心し、上澄と細胞とを分離した。上澄は前記０ｎｄａら
のＨＰＬＣ法に従ってヒスタミンの蛍光定量を行い、そ
の値を０．５％トライトンＸ−１００で完全に細胞を壊
した時のヒスタミン量を１００とした相対値で表わした
。

（３）ｌμｇ／ｍＱのコンパウンド４８／８０の誘発す
る肥満細胞脱顆粒作用に対して物質Ｎα１〜Ｎα４の示
した作用は次の通りであった。

（３）　−（ｉ） 物質Ｎα１〜Ｎα４はいずれも低濃度領域では肥満細胞
脱顆粒抑制作用を示し、物質Ｎαｌ及びＮα３のＩＣ５
，値はともに４μｇ／ｍＱであった。物質Ｎα２及びＮ
α４は微量成分であり、定量的に測定することは固壁で
あったが、物質Ｎα１及びＮα３と同様の活性を有して
いた。

（３）　−（ｉｉ） 物質Ｎα１〜Ｎα４は高濃度領域では単独で肥満細胞脱
顆粒作用を示し１本作用は、反応液のカルシウムイオン
濃度を約１ｍＭ以上にした時に発現し、反応液のカルシ
ウムイオン濃度が０に近い時は発現しないというカルシ
ウムイオン依存性を示した。

（３）　−（ｉｉｉ） 反応後にコレステロールを一定濃度（約２μｇ／ｍＱ）
以上加えることにより、上記（３）　−（ｉ）及び（３
）−（ｉｉ）の作用はコレステロールに対して濃度依存
的に減少した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、高速液体クロマトグラフィーによる分離結果
を示すグラフで、第１図（ａ）は培養濾液中から精製さ
れた肥満細胞機能調節物質についての結果、第１図（ｂ
）はユーロシジンについての結果を示す。第１図におい
て、縦軸は３５０ｎｍの紫外吸収の強度、横軸は溶出時
間（分）を示し、第１図（ｂ）中のＮα１〜Ｎａ４は各
ピークに相当するユーロシジンの構成成分を示す。第２
図はユーロシジンの構成成分中の物質Ｎα１〜Ｎα４の
紫外線吸収スペクトルを示し、縦軸は紫外吸収の強度、
横軸は波長（ｎｍ）を示す。 第２図の図（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ第１図（ｂ）の
各ピークに相当する物質Ｎα１〜Ｎα４の紫外線吸収ス
ペクトルを示す。 第３図は紫外線吸収スペクトル図を示し１曲線すはユー
ロシジンの構成成分中物質（Ｎα３相当物質）及び曲線
ａは培養濾液中から精製された肥満細胞機能調節物質（
Ｎα３相当物質）の紫外線吸収スペクトルを示す。縦軸
は、紫外吸収の強度、横軸は波長（ｎ−）使を示す。 指定代理人　工業技術院微生物工業技術研究所長大　　
山　　次　　部 復代理人　弁理士　　池　浦　敏　明 第１図 溶出時間（分） ０　　　　　　　　　　　　　１０　　　　、　　　　
　　　　　２０溶出時間（分） 第２図 ３００　３５０　　（ｎｍ）　　　　３００　３５０　
（ｎｍ）３００　３５０　　（ｎｍ）　　　　３００　
３５０　　（ｎｍ）手　　続　　補　　正　　書 昭和６１年　７月２日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１１３０８０号 ２、発明の名称 肥満細胞機能調節剤 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　東京都千代田区霞が関１丁目３番１号氏名　
（１１４）工業技術院長飯塚幸三（ほか１名） ４、復代理人　〒１５１ 住　所　　東京都渋谷区代々木１丁目５８番１０号５、
補正命令の日付　　自　　発 ６、補正により増加する発明の数　　　　　０−−Ｍ　
　〜 ８、補正の内容 本願明細書中において、以下の通り補正を行います。 （１）第２頁第１５行及び第３頁第１４行の「培養濾液
」を。 「培養液」に訂正します。 （２）第３頁第１７行乃至１８行の「約３００−３５０
ｎａ＋に紫外線吸スペクトル吸収極を示す」を、「約３
００〜３５０ｎｍにおいて紫外線吸収スペクトルに吸収
極大を示す」に訂正します。 （３）第４頁第６行の「微産物」を、「微生物」に訂正
します。 （４）第５頁第６行乃至第１１行の「本物質を生産させ
ることができる。　、、、、、（中略）、、、、、さら
に１本物質は、菌体をメタノール等」を以下のように訂
正します。 「本物質を生産させることができる。 培養濾液からの採取は、有機溶媒抽出法、イオン交換樹
脂法、及び吸着剤を用いた吸脱着法や、高速液体クロマ
トグラフィー法等を用いて行うことがマキ６１本物質は
、菌体をメタノ゛−ル等」（５）第５頁第１４行及び第
１５行の「培養液中」を、「培養濾液中」に訂正します
。 （６）第７頁第７行の「ことにより測定した。」を、「
ことにより脱顆粒状態を測定した。」に訂正します。 （７）第７頁第１１行乃至第１２行の「抗原抗体複合物
など」を、「抗原抗体反応を利用したものなど」に訂正
します。 （８）第７頁第１２行の「任意の薬剤を」を、「任意の
薬剤もしくは方法を」に訂正します。 （９）第１０頁第４行の「菌体と培養液とを分散し」を
、「菌体と培養濾液を分離し」に訂正します。 （１０）第１０頁第５行の「培養液１８Ｑを得た。この
培養液の」を、「培養濾液１８Ｑを得た。この培養濾液
の」に訂正します。 （１１）第１０頁第１３行の「物質ユーロシジン」を、
「ユーロシジン含有物質」に訂正します。 （１２）第１１頁第１０行の「各画分は」を、「各画分
を」に訂正します。 （１３）第１１頁第１６行の「培養液」を、「培養濾液
」に訂正します。 （１４）第１３頁第１６行乃至第１７行の「調製した」
を、「調整した」に訂正します。 （１５）第１４頁第３行の「リン酸緩衝液」を、「生理
食塩水」に訂正します。 （１６）第１４頁第７行の「水冷した後、３０００　Ｘ
　ｇＪを、「氷冷した後、１５００Ｘｇ」に訂正します
。 （１７）第１４頁第１Ｏ行の「０．５％」を、ｒｏ、０
５％」に訂正します。 （１８）第１５頁第１１行の「反応後」を、「反応液」
に訂正します。 （１９）第１６頁第１５行の「使を示す、」を、「を示
す。」に訂正します。 手　　続　　補　　正　　書（方式） 昭和６１年　８月１３日 特許庁長官　　黒　１）明　雄　　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１１３０８０号 ２、発明の名称 肥満細胞機能調節剤 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　東京都千代田区霞が関１丁目３番１号氏名　
（１１４）工業技術院長飯塚幸三（ほか１名） ４、復代理人　〒１５１ 住　所　　東京都渋谷区代々木１丁目５８番ｌＯ号６、
補正の対象 手　　続　　補　　正　　書 昭和６１年７月２日 特許庁長官　　宇　賀　道　部　　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第１１３０８０号 ２、発明の名称 肥満細胞機能調節剤 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　東京都千代田区霞が関１丁目３番１号氏名　
（１１４）工業技術院長飯塚幸三（ほか１名） ４、復代理人　〒１５１ 住　所　　東京都渋谷区代々木１丁目５８番１０号第−
西脇ビル１１３号 氏名　（７４５０）弁理士　池浦敏明 電話（３７０）　２５３３番 ５、補正命令の日付　　　　自発 ６、補正により増加する発明の数　　０７、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」及び「図面の簡単な説明
」の欄

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ユーロシジンの構成成分からなり、紫外線吸収ス
   ペクトルの波長が約３００〜３５０ｎｍに吸収極大を示
   す物質を有効成分とする肥満細胞機能調節剤。