JPH0415770B2

JPH0415770B2 -

Info

Publication number: JPH0415770B2
Application number: JP60113080A
Authority: JP
Inventors: Kazuya Nakagome; Noboru Tomizuka; Hideo Suzuki; Susumu Maruyama; Makoto Takeuchi; Tadashi Yasuhara; Terumi Nakajima
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1985-05-28
Publication date: 1992-03-19
Also published as: JPS6216425A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は、単離した肥満細胞の機能調節剤に関
するものである。〔従来技術〕肥満細胞は動物の結合組織内に存在し、細胞内
にケミカルメデイエーターと呼ばれる生物活性物
質を含む顆粒を数多く持つている。炎症反応及び
アレルギー反応はともに、刺激を受けた肥満細胞
が脱顆粒反応を起こし、ヒスタミン、セロトニン
などのケミカルメデイエーターを放出するところ
から始まる。免疫グロブリンＥの受容体を持つ細
胞として肥満細胞が注目され、肥満細胞における
刺激の伝達機構及び脱顆粒反応の作用機作などを
解明することがアレルギー反応を理解することに
直接つながるため、肥満細胞の脱顆粒作用及び脱
顆粒抑制作用等の機能調節作用をもつ物質の開発
が望まれている。〔目的〕そこで、本発明者らは、このような作用を有す
る物質が産生するか否か広く検討を行つたとこ
ろ、ストレプトベルテイシリウム属菌により生産
される既知のユーロシジン（日本農芸化学会誌
第29巻650〜652ページ、1955年）の構成成分中の
紫外線吸収スペクトルが約300〜350nmに吸収極
大（肩を含む）を示す物質が肥満細胞機能調節作
用を有することを認め、かつ市販のストレプトベ
ルテイシリウム・ユーロシジカム
（Streptoverticillium eurocidicum、IFO No.
13491）株の培養液中にも強力な肥満細胞機能調
節作用を有する物質を産生することを認め、この
物質を単離、精製した結果、上記と同一のユーロ
シジンの一成分であることを認めた。従つて、本発明は新規な肥満細胞機能調節剤を
提供することを目的とする。〔構成〕本発明は、ストレプトベルテイシリウム属菌生
産物の主成分をなすユーロシジンであつて、紫外
線吸収スペクトルが約302nm、約316nm、約
332nm及び約349nmに吸収極大を示す化合物群の
中から選ばれる少なくとも１種からなる肥満細胞
機能調節剤を提供するものである。ユーロシジン
に、肥満細胞の機能に対して機能調節作用がある
ことを見出したのは、本発明者らが初めてであ
る。なお、本明細書中で言うユーロシジンとは、ス
トレプトベルテイシリウム属菌によつて産生され
る化合物で、下記式で表わされる基本骨格構造を
有する化合物の総称を意味するものである。（式中、R¹〜R⁵は水素原子又は置換基である）本発明に係る前記特定のユーロシジン化合物
は、以下において本物質と呼称する。本物質は、高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）を用いて、市販のユーロシジン又はユ
ーロシジン産生微生物培養液から分離取得するこ
とができる。例えば、直径10mm、長さ250nmのカ
ラム（充填剤としてヌクレオシル5C8使用）を用
いてHPLC分離を行うと、第１図ｂのように分離
でき、約300〜350nmにおいて紫外線吸収スペク
トルに吸収極大を示す４種の単一化合物からなる
物質、即ち、ピークNo.１〜No.４の各ピークに相当
する物質No.１〜No.４を得ることができる。これら
の物質No.１〜No.４の紫外線吸収スペクトルを第２
図ａ〜ｄに示した。これらの物質はそれぞれ約
302nm、約316nm、約332nm、及び約349nmに吸
収極大（肩を含む）を示す。なお、第１図は、本物質のHPLC分離結果を示
し、第１図ａはユーロシジン産生微生物の培養濾
液から分離取得した本物質についての結果及び第
１図ｂは市販のユーロシジンについての結果を示
す。また、本物質は、ストレプトベルテイシリウ
ム・ユーロシジカム（Streptoverticillium
eurocidicum、IFO No.13491）株又はストレプ
トベルテイシリウム・アルビレテイキユリ
（Streptoverticillium albireticuli、IFO No.
12737）株を、一般培地に培養し、培地中に産生
させ、常法により採取することができる。例え
ば、炭素源としてグルコース、シユークロース、
マルトース、デキトリン、澱粉、グリセリン等
を、窒素源としてはペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、麦芽エキス等を用い、さらに無機塩とし
て、NaCl、K₂HPO₄、Na₂HPO₄、MgSO₄等を
加えた中性液体培地中で、通気、撹拌することに
より培養される。培地のPHは５〜８、好ましくは
７付近で培養される。培養温度は通常、20〜35℃
の範囲であるが、30℃付近が好ましい。例えばグ
ルコース1.5％、ペプトン0.5％、肉エキス0.5％、
酵母エキス0.5％、NaCl0.5％を含むPH7.0の液体
培地で30℃、40時間培養することにより、本物質
を生産させることができる。培養濾液からの採取は、有機溶媒抽出法、イオ
ン交換樹脂法、及び吸着剤を用いた吸脱着法や、
高速液体クロマトグラフイー法等を用いて行うこ
とができる。本物質は、菌体をメタノール等の有
機溶媒を用いる抽出処理した後、濃縮、結晶化等
の通常の精製操作を行うことによつても得ること
ができる。培養濾液中に含まれる物質を分離回収
するには、例えば、培養濾液中に1/10体積量のア
ンバーライトXAD−７を加えて時々撹拌しなが
ら室温で約４時間吸着処理を行つた後、アンバー
ライトXAD−７を濾別し、これを洗浄後、80％
メタノール溶液で溶出処理する。溶出液を減圧濃
縮後、水に再溶解し、PH4.0に調整した後、CM−
トヨパールイオン交換クロマトグラフイーを行う
と、0.05M酢酸−酢酸アンモニウムによるPHグラ
ジエントによりPH5.7付近から溶出が始まる。こ
の溶出液をさらにPH8.5に調整し、DEAE−トヨ
パールイオン交換クロマトグラフイーを行うとPH
7.5付近から溶出が始まる。さらに活性画分を、
MCIゲルCHP−20P吸着カラムに吸着させ、40％
アセトニトリル溶出画分を分取し、減圧乾固する
ことにより本物質のうち物質No.３を得ることがで
きる。次に、本物質の肥満細胞脱顆粒抑制活性の試験
方法及びその結果を以下に示す。ラツト腹腔内より腹水を採取し、４℃、150×
ｇの条件で10分間遠心した後、沈澱した細胞を、
牛血清アルブミン重層遠心法等での方法により分
離し、肥満細胞画分を得た。これを0.2％牛血清
アルブミンを含むタイロード液に肥満細胞が10⁶
個／mlとなるように懸濁し、肥満細胞浮遊液を得
た。次に被験化合物を生理食塩水20μlに肥満細胞
浮遊液20μlを入れて混和し、37℃で10分間反応さ
せた後、脱顆粒誘発剤として5μg／mlのコンパウ
ンド（compound）48/80溶液10μl（最終濃度で
1μg／ml）を加えて10分間反応させ、氷冷後遠心
して上澄を採つた。上澄に含まれるヒスタミンを
HPLC法（Onda等、Hiroshima、J.Med.Sci.，
第27巻、93〜97ページ、1978年）により定量する
ことにより脱顆粒状態を測定した。なお、前記脱顆粒誘発剤としては、コンパウン
ド48/80（シグマ社製）の他に、コンカナバリン
Ａ（和光純薬工業(株)社製）、イオノフオアA23187
（カルビオケム・ベーリング社製）はじめ、抗原
抗体反応を利用したものなど一般に知られている
任意の薬剤もしくは方法を用いることができる。
次に、被験化合物の濃度を種々変えて測定を行
い、本測定系で1μg／mlのコンパウンド48/80に
より誘発される肥満細胞脱顆粒を50％抑制する化
合物の濃度〔IC₅₀〕値を求めた。また、コンパウ
ンド48/80の存在しない状態や、コレステロール
を添加した状態など各種の条件下で本物質の肥満
細胞に対する機能調節作用の測定も合せて行い、
その結果は以下に示すように、本物質には、強い
肥満細胞機能調節作用をもつことが認められた。 (1) 本物質はいずれも、低濃度領域では肥満細胞
脱顆抑制作用を示し、そのIC₅₀値は下記の表−
１に示す通りであつた。 (2) 本物質は、上記(1)の作用を示す濃度より高濃
度領域では、単独で肥満細胞脱顆粒作用を示
し、本作用は反応液のカルシウムイオン濃度に
依存していた。 (3) 上記(1)及び(2)の作用は、ステロール骨格を有
する物質の添加によりその作用の強さを減じる
ことも可能であつた。なお、本測定系で1μg／mlのコンパウンド48/8
０により誘発される肥満細胞脱顆粒作用を50％抑
制する化合物の濃度を１単位／ml〔１ユニツト／
ml〕とした。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。実施例１グルコース1.5％、ペプトン0.5％、肉エキス0.5
％、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％を含むPH7.0の
液体培地100mlを500mlの坂口フラスコに分注し、
120℃、20分間滅菌する。この培地に放線菌スト
レプトベルテイシリウム・ユーロシジカム株の斜
面寒天培地より１白金耳量を接種し、30℃、３日
間往復しんとう培養を行つた。この培養液と同組
成の培地20を30用ジヤーフアーメンターに仕
込み、ストレプトベルテイシリウム・ユーロシジ
カム株の前培養液300mlをこの培地に移し、30℃、
200回転、通気量毎分10で40時間培養を行つた。
培養終了後、7000回転の連続遠心を行うことによ
り、菌体と培養濾液を分離し、黒かつ色の培養濾
液18を得た。この培養濾液の肥満細胞脱顆粒抑
制活性は642500ユニツトであつた。実施例２実施例１で得た菌体に５倍量のメタノールを加
えて撹拌後、室温にて放置した。時々撹拌しなが
ら24時間置いた後、菌体を濾別後、メタノール抽
出液を濃縮し、乾固した。得られた残渣をメタノ
ールを用いて再溶解させ、可溶性画分のみを採つ
た。再度濃縮後、生成する結晶性のユーロシジン
含有物質を得た。本物質の肥満細胞に対する活性
は約113000ユニツトであつた。実施例３市販のユーロシジン（武田薬品工業(株)製）をメ
タノールに溶解させ、HPLCにて分離した。この
場合の分離条件は次の通りである。カラム：ヌクレオシル5C8充填、直径10mn、
長さ250mm 使用溶剤：アセトニトリル／酢酸アンモニウム
緩衝液（0.01M、PH5.0）＝35/65 流速：４ml／分検出：紫外波長350nmにおける吸光度測定試料濃度：0.2mg／ml 注入量：200μl 上記条件により市販のユーロシジンの構成成分
を分離したところ、第１図ｂのような各成分の分
離結果を示し、該当するピークに相当する物質No.
１〜No.４の画分を得た。各画分を減圧濃縮後、凍
結乾燥をくり返し、物質No.１〜No.４を得た。この
物質No.１〜No.４の紫外線吸収スペクトルは第２図
ａ〜ｄに示す通り、各物質はそれぞれ約302nm、
約316nm、約332nm及び約349nmに吸収極大（肩
を含む）を示した。実施例４ (1) 実施例１で得られた培養濾液のうち５中
に、1/10本体積に相当する吸着剤アンバーライ
トXAD−７を加え、時々振とうしながら４時
間室温にて吸着処理した。吸引濾過により、吸
着剤を濾別し、精製水で洗浄した後、吸着剤体
積の２倍量に相当する20％メタノール水溶液で
洗浄した。その後、吸着剤体積の３倍量に相当
する80％メタノール水溶液で溶出させ、溶出液
を減圧濃縮した後、精製水に溶解させた。ほぼ
100％近い活性が回収できた。 (2) 次に、CM−トヨパール650Mカラム〔東洋
曹達工業製、カラム体積533ml、0.05M酢酸−
酢酸アンモニウム（PH4.0）で平衡化〕にPH4.0
に調整した試料溶液を吸着させ、0.05M酢酸−
酢酸アンモニウム（PH6.0）で溶出させた。最
も強い活性画分は溶出液のPH5.7から溶出して
きた。活性画分の肥満細胞脱顆粒抑制活性は
25250ユニツトであつた。 (3) さらに上記(2)の活性画分を、PH8.5に調整し
た後、DEAE−トヨパール650Mカラム〔東洋
曹達工業製、カラム体積179ml、0.05M酢酸ア
ンモニウム−アンモニア水でPH8.5に平衡化〕
に、吸着させ、0.05M酢酸アンモニウム−アン
モニア水（PH7.5）で溶出させた。この活性画
分の活性は、16500ユニツトであつた。 (4) さらに、MCIゲル（CHP−20P、三菱化成
製）を充填した吸着カラム（カラム体積40ml）
に、前記(3)で得られた活性画分を吸着させ、20
％アセトニトリル水溶液で洗浄後、40％アセト
ニトリル水溶液で溶出させ、減圧濃縮して白色
物質を得た。本物質をメタノールに溶解して、
紫外線吸収スペクトルを測定し、さらに前記実
施例３で示した分離条件によりHPLC分離を行
い。その結果を各々第１図ａ及び第３図に示し
た。得られた物質は市販のユーロシジンの構成
成分のうち物質No.３と同じものであつた。活性
量は12500ユニツトであつた。実施例５ (1) ウイスター系雌性ラツト（体重150〜250ｇ）
を脱血致死させ、腹腔内にタイロード液を20ml
注入し、腹部を約２分間軽くマツサージした。
開腹後腹水を採取し、４℃にて150×ｇ、10分
間の条件で遠心分離し、沈澱する細胞を集め
た。この細胞をタイロード液２mlに懸濁させ、、
比重1.068に調整した牛血清アルブミン含有生
理食塩水４mlに重層し、４℃、100×ｇの条件
で12分間遠心分離後、沈澱する細胞を集めた。
タイロード液で２回洗浄した後、0.2％牛血清
アルブミンを含むタイロード液に肥満細胞が約
10⁶個／mlとなるように懸濁させ、肥満細胞浮
遊液を得た。 (2) 被験化合物を含む生理食塩水20μlと肥満細胞
浮遊液20μlを10分間37℃にて反応させ、最終濃
度1μg／mlとなるようにコンパウンド48/80溶
液10μlを加え、さらに10分間反応させた。反応
後１分間氷冷した後、1500×ｇ、４分間の条件
で遠心し、上澄と細胞とを分離した。上澄は前
記OndaらのHPLC法に従つてヒスタミンの蛍
光定量を行い、その値を0.05％トライトンＸ−
100で完全に細胞を壊した時のヒスタミン量を
100とした相対値で表わした。 (3) 1μg／mlのコンパウンド48/80の誘発する肥
満細胞脱顆粒作用に対して物質No.１〜No.４の示
した作用は次の通りであつた。 (3) (i) 物質No.１〜No.４はいずれも低濃度領域では肥満
細胞脱顆粒抑制作用を示し、物質No.１及びNo.３の
IC₅₀値はともに4μg／mlであつた。物質No.２及び
No.４は微量成分であり、定量的に測定することは
困難であつたが、物質No.１及びNo.３と同様の活性
を有していた。 (3) (ii) 物質No.１〜No.４は高濃度領域では単独で肥満細
胞脱顆粒作用を示し、本作用は、反応液のカルシ
ウムイオン濃度を約1mM以上にした時に発現し、
反応液のカルシウムイオン濃度が０に近い時は発
現しないというカルシウムイオン依存性を示し
た。 (3) (iii) 反応液にコレステロールを一定濃度（約2μg／
ml）以上加えることにより、上記(3)−(i)及び(3)−
(ii)の作用はコレステロールに対して濃度依存的に
減少した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、高速液体クロマトグラフイーによる
分離結果を示すグラフで、第１図ａは培養濾液中
から精製された肥満細胞機能調節物質についての
結果、第１図ｂは市販のユーロシジンについての
結果を示す。第１図において、縦軸は350nmの紫
外線吸収の強度、横軸は溶出時間（分）を示し、
第１図ｂ中のNo.１〜No.４は各ピークに相当する市
販のユーロシジンの構成成分を示す。第２図は市
販のユーロシジンの構成成分中の物質No.１〜No.４
の紫外線吸収スペクトルを示し、縦軸は紫外吸収
の強度、横軸は波長（nm）を示す。第２図の図
ａ〜ｄは、それぞれ第１図ｂの各ピークに相当す
る物質No.１〜No.４の紫外線吸収スペクトルを示
す。第３図は紫外線吸収スペクトル図を示し、曲
線ｂは市販のユーロシジンの構成成分中物質（No.
３相当物質）及び曲線ａは培養濾液中から精製さ
れた肥満細胞機能調節物質（No.３相当物質）の紫
外線吸収スペクトルを示す。縦軸は、紫外吸収の
強度、横軸は波長（nm）を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１ストレプトベルテイシリウム属菌生産物の主
成分をなすユーロシジンであつて、紫外線吸収ス
ペクトルが約302nm、約316nm、約332nm及び約
349nmに吸収極大を示す化合物群の中から選ばれ
る少なくとも１種からなる肥満細胞機能調節剤。