JPS62223206A - 活性化したポリマ固体及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は天然又は合成の、ヒドロキシル基含有のポリマ
固体の化学的に改質され活性化された表面であってバイ
オ製造技術、バイオ科学ならびに医学において分析及び
ｆＡ製の目的のためプロティン、核酸、低分子配位子、
細胞、微生物その他の生物学的物質の結合のため用いら
れるもの及びその製法に関する。

担体に固定された生物学的に活性な物質は数年来特異な
相互作用の相手の分離及び単離のために（展望：　Ｈ，
Ｄ、　０ｒｔｈ　、　１１　Ｂｒｉｉｍｅｒ　：　Ａｎ
ｇｅｗ。

Ｃｈｅｍ　、　８Ｓ（１９７２）　３１９；　Ｗ、Ｂ、
　Ｊａｋｏｂ、Ｍ、ｆｉｌｃｈ−ｅｋ　ｍＭｅｔｈｏｄ
ｅ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　３４　（１９７４）、酵素
の固定及びその酵素反応器としての使用につい”ＣＫ、
　Ｍｏ５ｂａｃｈ　１ｍ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、４４（１９７６））　　ならびに生物学的
に重要な化合物の定性的及び定量的検出のためにバイオ
科学、バイオ製造技術においてまたますます医学におい
ても広く使用されている〇 一般的に理想のマトリクスには下記の要求が課せられる
： 一不浴性 一マクロ多孔性 一機械的及び化学的安定性 一特殊な形状 一親水性 一僅かな非特異性結合 一微生物及び酵素の影響に対する耐性 −化学的改質及び活性化のだめの官能基の存在すべての
要求を満たし従って万能に使用可能であるこのような理
想のマトリクスは存在し【いない。それゆえ近年多数の
担体材料が記述され市場に提供されており、それらの多
様性はデキストラン類及びアガロース類など天然のポリ
マ（ポリサツカリド）からポリビニルアルコール、アク
リル＃１誘導体、ビニルポリマなと合成ポリマならびに
アガロース及びポリアクリルアミドなと天然及び合成の
コポリマまでにわたっている。これらの担体はすべてそ
れらの表面に大なり小なりヒドロΦシル基がありこれら
が本質的に親水性緒特性の、従ってまた僅かな非特異性
結合の原因となっている。

プロティン、レクチン、酸素、核酸、低分子配位子、細
胞その他の生物学的物質など生物学的に活性の物質の固
定のための助長条件は多くの場合において化学的結合を
可能にする化学的に反応性の基の導入である。活性化と
呼ばれる化学的改質は主としてマトリクスと配位子との
官能基の種類によって左右されるがまたマトリクスの化
学的安定性ならびに配位子の生物学的緒特性の安定性に
よって決定される。活性化法の選択はそのほか活性化の
際の製造技術上の負担及びこれと結びついている活性化
法、導入された化学的基の反応性、活性化された担体の
貯蔵可能性、改質反応剤の毒性及び生物学的適合性なら
びに固体表面と配合子との間の化学的結合の安定性のコ
ストによって決定される。

それゆえ顧慮すべきまた限定すべきパラメータ及び因子
が多数あるので、多数の担体材料と結合して活性化法が
なお見透しできないほどの数で記述されたことに不思議
はない。

その代りにゲルタールアルデヒド又は他の同種又は異種
三官能反応剤を用いる活性化法、ＣＮＢ　ｒ−活性化、
ヒドラジン、ビスエポキシラン、ジビニルスルホン、エ
ピクロルヒドリン、ベンゾキノン、カルボニルイミダシ
ル、トリアジン誘導体、トシルクロリドを用いる活性化
ならびに過沃素酸塩酸化及びジアゾ化をあげる（展望：
　Ｊ　、Ｍ、　Ｅｇｌｙ　、　Ｈ，Ｂｏ３ｃｈｅｔｔｌ
ｊｔＮ和カクロマトグラフイー及び関連技法における使
用の実際的指針、　ＩＢＦ−ＬＪＣ８，１９８３年）大
差をもって最も広まっているのはＡｘｅｎほかによって
導入されたブロムシアンによる活性化（Ｒ，Ａｘｅｎ　
、　Ｊ　、　Ｐｏｒａｔｈ　、　８．　Ｅｒｎｂａｃｋ
　：　Ｎａｔｕｒｅ２１４　（１９６７）　１３０２　
）である。この方法は争いの余地なくバイオ科学及びバ
イオ製造技、術において担体に固定しである物質の広汎
な応用へ導いたに拘わらず、固体表面と配位子との間の
比較的不安定な化学的結合（と（に５より小さく１０よ
り大きいＰＨ値において、このことが固定された配位子
の少なくない放出（漏洩）へ導くことがあり、従ってま
たその応用を、とりわけ医学における生体内治療法のた
めのものを著しく制限する）、ブロムシア／の高い毒性
（このことが活性化の製造技術を高価なものとする）及
び担体表面上でのカナオン基生成の危険などの欠点がと
りついている＠ ヒドラジ／活性化の場合に不利であるのはその除に現わ
れる、高分子配位子との結合歩留りの低いことなど技術
上の問題である。

これに対して他の活性化法には反応剤（ジビニルスルホ
ン、トリアシフ　ｒｕｇ　’４　体、エピクロルヒドリ
ン）の高い毒性及び／又はプロセスの高いコスト（ジビ
ニルスルホン、トシルクロリド、トレシルクロリド）、
結合中の不利な環境条件、従ってまた生物学的物質（ビ
スエポキシラン、トリアジン誘導体、エピクロルヒドリ
ン）の不活性化の危険、ＰＨ値が高い場合の不安定な固
定（ジビニルスルホ／、カルボニルジイミダゾール、ジ
アゾニウム化合物）、配位子（エビクロルヒドリ／、ビ
スエポキシラン）にとって長い活性化−及び固定時間、
プロセスのコストにこれまた影響を及ぼす製造技術上の
問題（トリアジン誘導体、トシルクロリド、カルボニル
ジイミダゾール、ジアゾ化）、低い結合歩留り（過沃素
酸塩酸化）ならびに比較的強い一電荷を移す相互作用に
帰し得る一非特異性ｆｐ！Ｎ酋（ベンゾキノン、トリア
ジン誘導体４体、ジアゾニウム化合物）などの欠点がと
りついている。

暫く前から（Ｒ，Ａ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　、　Ｈ，Ｈ，
Ｗｅｅｔａｌｌ：米国特許Ｋ　３５１９５３８号；Ｈ，
Ｈ，Ｗｅｅｔａｌｌ　ｅＮ、Ｙ、　Ｅ１ｍｉｒｌ米国特
許第３６５２７６１号；Ｈ，Ｈ，Ｗｅｅｔａｌｌ　ｍ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　４４　（１９
７６）１３４）　　５ｉｎ２とくにガラスの表面上のＯ
Ｈ−基が化学薬剤とくにさまざまな官能基を備えた有機
シランにとって攻隼点として利用可能であることが公知
である。確かにこれらの有機シランは従来もっばら無機
体担及び固体表面用に使用された。

本発明の目的は天然又は合成のヒドロキシル基含有のポ
リマ固体表面用の単純な金のかからない無毒の活性化法
であって、プロティン、核酸、低分子配位子、細胞、微
生物その他の安定性、歩留りならびに生物学的適合性の
高い生物学的物質を固定できる活性化された安定な固体
表面へ導くものを開発することである。

本発明は、天然及び合成のヒトａｆシル基含有のボＩＪ
−ｒ固体表面を、通常は有機質を無機質に請合するため
に用いられる化合物を用いて活性化し、高度に活性化さ
れた、安定な、生９勿学的適合可能のポリマ固体を生じ
させることが課題である。本発明によってこの課題は天
然又は合成の固体表面に存在しているヒドロキクル基が
一般式 ％式％（） （式中Ｘはアミノ、カルボニル、カルボキシル、エポキ
シ−、イソシアノ−、ジアゾ−、イソチｒ　−／　７ノ
ー、ニトロソ−、スルフヒドリル−又はハロカルボニル
−＆、Ｒ’　　ｆｆ、アルキル−、アルキルフニニルー
又はフェニル基であり、一方Ｒはγルコキシー、フェノ
キシ−又はハロゲン基を表わし、ｎｌは０乃至加の値で
またｎは１乃至３の値であり得る）の有機７ランと反応
することによって解決される。通常の有機シジンは下式
で表わずことができる： ５ｉＲ ｎ４−ｎ　　　　　　（ＩＩ） （式中Ｙはアミノ−、カルボニル−、カルボ午ン−、エ
ボ中シー又はスルフヒドリル基を表わし、Ｒはアル；キ
ジ−、フェノキシ−及びハロゲン基を表わし、ｎは１乃
至３の値とすることができる。実地において広く流布し
ておりしばしば用いられる有機シランは一般的組成がＸ
ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−８１（ＯＲ）３（ｌｆｉ）である
。式中Ｘは式１に対応の反応性有機の基であり、Ｒはメ
チル−又はエチル基を＝ｓｂｆ。

反応はまた少なくとも二つの式１の有機シランで混合物
中において又は順次に実施することもできる。有機シラ
ンにとって望ましい媒体は液相又は気相であり、活性化
は水系、水−溶媒晶金物又は有機溶媒中で行なわれ得る
。引続いて、場合によっては改質ずみの固体表面を同質
−又は異質二官能反応剤を用いてさらに処理する。

本発明による方法に従って作られた、活性化されたポリ
マ固体はＯＨ−基含有の有機高分子かうなり、その表面
上には一般式 ％式％（） の基団と　ＯＨ−基とがあり、Ｒ１はアルキル−、アル
キルツエニルー又はフェニル基、ｘはｙｔ／−、−ｈ＃
Ｍニル−、カルボキシル−、エホキシー、インシアノ−
、ジアゾ−、イソチオシア／−、＝）ロソー、スルフヒ
ドリル−又ハノｓｃ１カルボニル基であり、ｎｌ　　は
０乃至加の値、ｎはｌ乃至３の値である。基団■とＯＨ
基との数の比率は１：９乃至９：１である。

天然及び合成のポリマはそれらの表面上に、すでに述べ
たとおり、ＯＨ基がありこれらが固体表面の親水性特性
を高め、従ってまた非特異性の乃至望ましくない相互作
用の低減に寄与する。

天然及び合成のポリマ中に存在しているＯＨ−基の一部
のみがこれらの担体の表面に立体的に達成可能のはずで
あるに拘わらず意外なことに、反応性の高い有機シラｙ
とこの種の固体表面とが高い歩留りで反応することが発
見された。シリ：ｘ官能基が固体の、到達可能のヒトｃ
ｔ午シル基と反応する一方では有機官能基はアミノ−、
カルボニル−、カルボキシル−、イソシアノ−、ジアゾ
−、インチオシアノ−、スルフヒドリル−、ニトロソ−
又はハロカルボニル−基を用いての通常の化学反応に利
用できてこれらの化合物が固体表面と有機／生物学的化
合物との間の橋として機能するようにする。こうして活
性化した天然又は合成の固体表面はもはや後αして直接
に対応の官能基を介して又は同質又は異質二官能反応剤
を介在させてそれ自体公知の方法ニ従って、固定すべき
プロティン、レクチン、＃素、核酸、低分子配位子、細
胞、微生物その他生物学的物質と反応させ得る。このこ
とはたとえば本発明に従って、ヒドロキシル基含有固体
の表面をγ−アミノグロビルトリエトキシシラン（式１
において　Ｘ：ＮＨ２−１Ｒ１＝（−ＣＨ２）３、Ｎ’
−４、Ｒ＝−ＱＣ’　２Ｈ５、ｎ＝１）と反応させるよ
うに行なわれる。今は固体表面に存在しているアｔノ基
は続いてゲルタールジアルデヒド又はＮ−スクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナ）　（５ｐ
ＰＤ）と反応できる。プロティン又は他の配位子の固定
はこれらの場合においてアミノ基−望ましくはりシン（
Ｌｙｓｉｎ）位置にあるアミノ基−を介して又はジスル
フィド結合な介してアルデヒド基になされる。全く同様
にして、ヒドロキシル基含有固体表面はグリシドキシプ
ロビルトリエトキシシラ／と反応できる。この変形にお
いては固定すべき生物学的物質が直接に固体表面のエポ
キシ基と反応する。この場合に重要なのは、無毒であり
、大規模工業的にかなり広範囲に生産されている有機シ
ラ、との反応は単純に接触させて又は浸漬して行なわれ
、活性化は固体を膨潤させた又は膨潤させてない状態に
おいて実施でき又は気相において行なわれることである
。

この場合重大なのは液相における有機シランとの反応が
ア七トン、ドルオール、ジオキサ／、メタノール、エタ
ノールなど有機溶媒、メタノール／エタノールなど爵媒
混合物ならびに水系媒体又はエタノール／水及びメタノ
ール／水など水−溶媒混合物中において実施でき、他の
多数の活性化法と異なって製造技術上の負担が小さくな
っていることである。エーロゾル利用により又は負圧に
より気相中において活性化がとくに有利に具体化できる
はずである。さらにまた本発明の基本的な原理を活用し
て極めてさまざまな官能基（式１のＸ）を備えた固体表
面を得ることができるのでさまざまな有機７ラン及び場
合によっては二官能結合反応剤の選択により実質上すべ
ての、問題となる反応可能性の実現できることが有利で
ある。加えて、有機シラン（Ｒ′＝０−２０）の及び／
又は二官能結合反応剤（たとえばゲルタールアルデヒド
）のスペーサ効果によって、固定された生物学的物質は
ほとんど例外なしにそれらの生物学的活性を保持する・
さまざまな官能基の有機シランの混合物の使用がとくに
有利に形成される。これらがさまざまな機榊を介して生
物学的物質を高い歩留りで固定できるからである。それ
でアミノプロピルトリエトキシシラン及びグリシドキシ
プロビルトリエトキシシランのならびにアミノプロピル
トリエトキシシラｙ及びメルカグトプロビルトリメトキ
シシラ／の混合物がとくに好適と判明する。

これら生物学的物質がさまざまな官能基を介しての反応
によって極めて高い歩留りで固定できるからである。

これらの場合には配位子の固定はアルデヒド−及びエポ
キシ基を介して乃至アルデヒド−及びメルカルブト基団
を介して行なわれる。

メルカブトグロビルトリメトキシシランの使用により生
物学的物質の可逆的結合の可能性が開かれる。結果とし
て生じるジスルフィド結合が適切な還元剤の使用により
可逆的に分離され得るからである。可逆的配位子結合は
とくに、％異的に固定された相互作用の相手のｍ離が変
成の危険を蔵していてプロティン−配位子複合体の尋離
が優先される場合に有利と判明する。

天然及び合成のポリマのヒドロキシル基と有機シランと
の反応によって生成する化学的結合は極めて安定であっ
てこうして活性化された固体は乾いた又は湿った状態に
おいて長期間にわたって貯蔵できまた固定された生物学
的に活性の配位子が極端な条件の下でも長時間にわたっ
て安定に固定されたままでいるほどである。こうして活
性化された天然又は合成のポリマ固体表面への非特異性
結合は極端に少ない。有機シラ／は生物学的適合性の良
いことですぐれている。

天然又は合成のポリマ固体表面としては、十分な個数の
立体的に到達可能のヒドロキシル基がそれらの表面で利
用できるすべてのポリマが問題となり、固体の組成は本
発明による活性化法にとって決定的ではない。橋かけし
たデキストラン基質の天然ポリマ（８ｅｐｈａｄｅｘ■
）又はアガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（！５）又はセ
ルｔｉｔ　−ス基質のポリサツカリドが広（流布してい
る。通常の合成ポリマはたとえば橋かけしたポリビニル
アルコール、シー、トリー及びグリシジルメタクリラー
トとアルコールとのコポリマ（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ”）
ならびにＮ−アクリロイル−２−アミノ−２−ヒドロキ
シメチル−１，ｓ−７’ロバンジオール（Ｔｒ　−１ｓ
ａｃｒｙｌ■）から導かれるコポリマである。しかしま
た天然及び合成のポリマ、アガロース及びポリアクリル
アミド（Ｕｌ　ｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ＠）などからのコ
ポリマであって本発明によっても活性化できるものもし
ばしば用いられる。とドロキシエチルメタクリラート、
エチレングリコールジメタクリラートーコボリマならび
にセルロース含有固体であって十分な個数の立体的に到
達可能のヒドロΦシル基が利用できるものも同じ（本発
明による方法を用いて活性化できる。

こうして活性化した固体は好都合に成形体として存在し
ており、これらの成形体は球面状。

繊ｍ状又は角形とすることができ、充填、織成により又
は結合剤によりカラム充填物、平坦担体又は他の高級組
織に給仕しておくことができる。この場合とくに重要な
ものはとりわけクロマトグラフィーの諸方法及びプロセ
スに用いられる球面状のセルロース含有固体（たとえば
粒状セルロース）及び分析化学及び＃新字におい【広＜
用いられるようになった平坦担体（活性化紙）である。

これらのうちに含まれるものには本発明による反応に採
り入れられていない他の固体表面上にフィルム又はラッ
カとして存在し得る４層もあり、本発明による活性化反
応にとって不活性の担体材料は均質であってもな（ても
また成形してあってもなくてもよい。

活性化した固体表面はプロティン、抗原、抗体、酵素及
びレクチンなど、核酸、低分子配位子、細胞、微生物及
び他の生物学的物質の化学固定のために用いられる。固
体表面に固定しであるこの檜の配位子は生物学的特異性
相互作用の相手の、親和力クロマトグラフィー法による
分離及び単離のために、酵素反応器として、バイオ科学
、バイオ製造技術また医学において生物学的に重要な化
合物の定性的及び定１的検出のため用いられる。

以下本発明を若干の実施例について説明する。

実施例１： 橋かけしたデキストラン（スエーデンＰｈａｒｍ−社Ｅ
ｌｅｐｈａｒｏ８ｅ　４　Ｂの）　、　Ｔｒｉｓａｃｒ
ｙｌ”　（スエーデンＬＫＢ社）ならびにＦｒａｃｔｏ
ｇｅｌｏ（西独Ｍｅ−ｒＣｋ社）それぞれ１ｇと５％ア
ンノプロビルトリエトキシシラン（東独１！：Ｂ　Ｃｈ
ｅｍｉｅｗｅｒｋ　Ｎ５−ｎｃｈｒｉｔｚ社ＮＢ１１１
４）とをエタノール／水（１：１）ｐＨｚ、ｓ中で、６
０℃において６時間保温し、引続いてエタノール／水５
−ずつで２回また０、１ｍ燐酸塩緩衝液ＰＨ６，８，５
−ずつで５回洗う。続いてＧ、　Ａｎｔｏｎｉ　（Ａｎ
ａｌ　、　ＢＩｏｃｈｅｍ　譚遼（１９８３）６０）に
従って固体表面のアミノ基の測定により活性化度を測定
する。活性化度は有機シランの濃度及び／又は保温時間
の選択によって広範囲にわたって変動できる。通常は担
体ｇあたりアミノ基１０乃至（資）μＭｏｌの％徴的な
活性化度が得られる。

実施例２： Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　ｏＧＦ　２００　５．ヲＬＯ％７
　ミ／　７’。

ピルトリエトキシシラン（東独ＷＥＢ　Ｃｈｅｍｉｅ　
−ｗｅｒｋ　Ｎｕｎｃｈｒｉｔｚ社ＮＢ　１１１４　）
とエタノール／水（１：１）　ｐＨ２，５中で６００に
おいて６時間保温し、硯いてエタノール／水（１：１）
　３０−ずつで２回乃至３層１ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ６，
８２０ｍずつで５回洗う。こうして活性化したゲルは恍
いて５％ゲルタールアルデヒドをもって０．１ｍ燐戚塩
緩衝液ｐＨ６，８中で２時間３７℃において反応させ絖
いて再び燐ぼ塩緩衝液２ｏゴずつで５回洗う。プロティ
ンの固定はこうして活性化したゲルにプロティン浴奴を
単に添加して行なわれる。このため担体な０．１　ｍ　
Ｍ＠塩緩衝液ｐＨ６，８中の３５．５ｂｙ４の製置のヒ
トの免疫グロブリンＧ　１０−と室温において２時間混
合する。固定されなかった残部を吸取った侵に担体上の
プロティン固定量の測定を、使用したグ９ティン溶液及
び残部の蛋白質一度差測定により行なう。この方法でト
リスアクリル−あたり　ＩｇＧ４９．７Ｉｎ９が固定で
きた。

実施例３： ＴｒｉｓａｃｒｙｌｏＧＦ　２０００１−を実権例第１
及び第２記載のとおり活性化し３％のｖ！に度のグルタ
ルアルデヒドと反♂させる。続いてこうして活性化した
ｍ体を４１．３ｍ９／ｌｄ　（７）Ｆ１ｋ度の　Ｊ−Ｉ
ｇ（）（ウサギから、アルカリ性ホスファターゼに対し
て向けられたもの）と混合し常温において２時間保温す
る。過剰のプロティンを吸取り続いて＋’；Ａｉｍ塩緩
眞夜５−ずつでよく洗った後に、使用したグロティｙｍ
液をいっしょに導きながら放射能の測定によりプロティ
ン固定量を測定する。この実験ではトリスアクリル−あ
たり１２５Ｊ−ＩｇＧ　３２．４〜が固定できた。

実施例４： ＴｒｉｓａｃｒＹｌ■Ｃ）Ｆ２０００　１ｍｇをアミノ
プロピルトリエト中シシツンとグリシドキシプロビルト
リエトキシシラン（付着媒介剤６１３０．東独ＶＫＢ　
Ｃｈｅｍｉｅｗｅｒｋ　Ｎｊｔｎｃｈｒ目２社）との混
合物と接触させ、常温において２時間振遣する。過剰の
反応剤を吸城り、乾燥させ続いて０．１ｍ燐酸塩緩衝液
ｐＨ６，８でよく洗った後に、担体はゲルメールアルデ
ヒドと反応させ、続いて実施例第３記載のとおり　１２
５Ｊ−ＩｇＧ　ｌｋ固定させる。ト！Ｊ　Ｘ　７　／　
！Ｊ　ｋｗｔアタＩＪ　１２５Ｊ　−ＩｇＧ　３２．７
１ｖを固定できた。

］０ＩｉＬ上。

８ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ■１ｖｔ　Ｉｆ実Ａａ例第１
及び第２記載のとおりシラン付漕剤及びゲルタールアル
デヒドをもって活性化し、貌いて実施例第３記載のとお
り０．１ｍｇＩ＃酸塩緩衝液中＋７）　４１．３Ｖ９／
ｄの一度の１２５．　＋　工ｇＧと反応させ常温におい
て２時間保温する。実施例第３記載のとおりプロティ／
の固定量を測定したがゲル−あたり５６６りが得られた
。

」１且り二 ８ｅｐｈａｒｏｉｅ　４　Ｂｏｌ−を実施例第４記載ど
おす２ｆｉｔの相異なる有機シラン及びゲルタールアル
デヒドをもって活性化し、続いてｔ２５Ｊ−ＩｇＧと反
応させる。この実験においてゲル−あたりＩｇＧ　１５
．２１１５１が固定できた。

実施例７： 実施例第３及び第４のとおりに１２５５−工ｇＧト反応
させたゲル（Ｔｒｌｓａｃｒｙｌ　）をジオキサ７２０
％含有のＰＨ１−緩衝液ｐＨ７，４２０ｔｄずつをもっ
て３回洗い、続いて固定された放射能を測定する。

トリスアクリルに残っているプロティン量は１４．３　
＃／−で不変である。

実施例８： 実施例第５及び第６のとおりに１２５５−工ｇＧと反応
させた８ｅＥ）ｂｌｒｏｓａ　　を実施例第７紀戟のと
おりジオキサン２０％含有のＰＨ１−緩衝液でよく洗う
。放射能測定により立証されたプロティン量はゲル−あ
たりｓ、５ＩＩ９（実施例第５）乃至１４２ｈ１９（冥
施例第６）と測定された。

実施例９： 実施例第３乃至第８に用いられた免疫グロブリンＧは酵
素アルカリホスファターゼを用いるウサギの免疫によつ
【得られた。従って１２’Ｊ　−ＩｇＧを対応の抗体活
性を活用しながら酵素アルカリホスファターゼの精製及
び単離のため使用することが可能である。このためｎ−
ブタノール抽出により予備精製したアルカリホスファタ
ーゼを実施例第６のとおりに１２５．ｒ　＋＋　Ｉ　ｇ
ｏと反応させたＢｅｐｈａｒＩｏｓｅを固定し、続い【
トリエチルアミンｐＨ１１，４で溶離する１、こうして
精製した＃素は比活性１０００ＩＵ／ζ、歩留り約８０
％である・ボリアクリルアオド電気泳動において随伴プ
ロティンは検出不能である。

実施例１０： ヒトの免疫グロブリンＧを実施例第１及び第２記載のと
おりＴｒｉｓａｃｒｙｌ’　ＧＦ　２０００に固定しウ
ナギから抗ヒ）　　ＩｇＧ抗体の単離に用いる。

このため　ＩｇＧを負荷した担体をクロマトグラフィー
カラムに充填し、カラムにヒトのＩｇＧに対１゛る特Ｊ
４性抗血情を負荷する。溶離は１ずＰＨ１−４を衝液を
もって、続いて３　ｍ　ｒｃｓｃＮ−溶液で行なわれる
。抗体フラクションをただちに透析した後に特異性抗体
の検出を酵素免疫試験及び二重免疫拡散（Ｏｕｃｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ技法）をもって夾施し、た。非特異性固定の
検量は対応のウサギ正常血清の塗布ならびにポリアクリ
ルアミド円板を気泳励を用いてのすぺ−〔の抗体含有フ
ラクションのテストにより行なわれる。

命４．’Ｍ　ｊ’１．’１１　＋−１ ８ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　１　ｉを５％メルカプト
グプロルメトキシシラン（西独５ｅｒｖａ社）とエタノ
ール／水（１：１）中でω℃において４時間保温し、続
いてエタノール／水４−ずつで２回、０．１ｍ燐酸塩緩
衝液ｐＨ６，７５ｗｄずつで５回洗う。続いてゲルを製
造者の報告によると予めＮ−スクシンイミジル−３−（
２−ピリジルジチオ）プロビオナート（スエーデンＰｈ
ａｒｍａｃｉａ社８ＤＰＤ）をもって活性化しであるヒ
トのＩｇＧ　１０１９と混合する。反応の際に遊離する
ピリジン−２−チオ／は３４３ｎｍにおいて光度針によ
り追求できる。こうして固定したこのＩｇＧは実施例＃
！１ｏと同様にウサギの抗と）　　ＩｇＧ抗体の回収及
び単離に使用できる。親和力クロマトグラフィーの終了
後はジスルフィド橋か汁を介して固定しであるＩｇＧを
メルカプトエタノール又はジチオトレイトール（５０ｍ
Ｍ）により再び分離して活性化したマトリクスが改めて
配合子を固定するのに利用できるようにすることができ
る。

実施例１２： 粒度１５乃至５μｍ１内！ｌＩ表１ｊ１１積が担体ｇあ
たり約７０−ならびに排除限界２．１６ダルトンのマク
ロ多孔性球状の２−ヒドロキシエチルメタクリラート−
エチレンジメタクリラート−コポリマ（以下５ｅｐａｒ
ｏｎ■Ｈｅｍａ　１０００と呼ぶ）ＩＩをエタノール／
水（１：ｌ）、ｐＨ２，５中の１０％アミノプロピルト
リエトキンシラン（東独ＶＦｉＢ　ＣｈｅｍｉｅＷ−ｅ
ｒｋ　Ｎｔｊｎｃｈｒ目工社ＮＢ　１１１４　）ととも
にＳＯＣにおいて６時間、次に１２０℃において６時間
保温し、続いてエタノ−砂水５ｍずつで２回、０．１ｍ
燐酸塩緩衝液Ｉ）Ｈ６，８５−ずつで５回洗う。続いて
活性化度を担体上のアミノ基の測定により求める。この
ためにはＧ　−ＡｎｔＯｊ’ｌｉほか（Ａｎａｌ　Ｂｉ
ｏ　−ｃｈｅｍ　Ｊｌ　　（１９８３）　６０　）によ
る方法が推興される。

活性化度は有愼クラ／の一度及び／又は保温時間の選択
により広い範囲にわたって変動させることができる。通
常は５ｅｐａｒｏｎ　、ｉｉｌあたり（資）μＭｏｌの
活性化度が達成される。

ｇエユ 粒度１５乃至２５　ｐｍの８ｅｐａｒｏｎ　Ｈｅｍａ　
１０００５Ｊをエタノール／水（１：１）ｐＨ２，５中
の７ミノプロビルトリエトキシシラン（￥ｊＩＬ独ＶＥ
Ｂ　Ｃｈｅｍｉｅ−ｗｅｒｋ　Ｎｌｎｃｈｒｉｔｚ社Ｎ
Ｂ　１１１４　）とともに１０％■Ｃにおいて６時間保
温し続いてエタノール／水（１：１）３Ｏｆｎｔずつで
２回乃至０．１ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ６，８２０−ずつで
５回洗う。こうして活性化したゲルは、就いて５％ゲル
タールジアルデヒドをもって０．１ｍｍ酸塩緩衝液　ｐ
Ｈ６，８中で田℃において２時間反応させ続いてさらに
燐酸塩緩衝液２０−ずつで５回洗う。プロティンの固定
はこうして活性化したゲルに単にプロティン溶液を添加
して行なわれる。このため活性化した８ｅｐＢｏｎを０
．１ｍ燐酸塩緩衝−あたり１８．６１９の濃度のヒトの
免疫グロブリン（ＩｇＧ）　１０　ｍと混合し３７℃に
おいて２時間又は４℃において１夜保温する。固定され
なかった残部を吸取った後に、使用したプロティン溶液
と残部との蛋白質一度差測定により担体上に固定された
プロテイ／童の測定を行なう。こうし゛〔谷実験におい
て供給されたプロティンの少な（とも９５％が固定でき
た。２滅のＪＡ施例において供冶したＩｇＣ）　１８６
ダのうち１８３　＃のプロティ／が固定され、５ｅｐａ
ｒ　−ｏｎ　９あたり３６．７１９のＩｇＧが固定され
ている。

」Ａ」上ユ 膨潤させた５ｅＤａｒｏｎ　ｌゴを実施同第Ｊ２及び第
１３記載のとおり活性化し、濃度３％のゲルタールアル
デヒドと反応させ、続いてこうして反応した担体を濃度
３５．５ｒＮｉ／−のヒトの免疫グロブリン０２ｍ（＝
７１１１ｇ＋と０．１　ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ６ｇ中で室
温において２時間混合する。過剰のプロティンを吸取っ
た侵１．読いてプロティン固定瀘を実施例第１３記載の
とおり測定する。こうして５ｅｐａｒｏｎ　Ｍｔ　あた
り工ｇＧ　２３．６ｍ９が固定できた。

実施例１５： 膨潤させたｓｅりａｒｏｎ　１１１ｔをアミノプロビル
トリエト中ジシランとグリシドキシプロビルトリ！）−
１［’ジシラン（東独ＶｇＢ　Ｃｈｅｍｉｅｗｅｒｋ　
Ｎ１ｊｎｃ−ｈｒｉｔｚ　　社付着媒介剤６１３０）と
の混合物と接触させ、常温において２時間振盪する。過
剰の反応剤の吸取りならびに乾燥及び後続の０．１ｍｍ
燐酸塩緩衝液ＰＨ６，８の強力な洗浄の後に担体なゲル
タールアルデヒドと反応させ続いてヒトのＩｇＧを実施
例第１４記載のとおり固定する。

５６ｐａｆｏｎ　ｌｄあたりＩｇＧ２ａ、８ＩＱが固定
できた。

ｊ自ＬｆＬ臣］ ヒトのＩｇＧを実施例第１２乃至第１５記載のとおり８
ｅｐｎ（ｏｎに固定しウサギの抗ヒト１ｇＧ抗体の単離
のために用いる◎このためにはＩｇＧを負荷された担体
なりロマトグラフィーカラムに充填しこれにヒトの工ｇ
Ｇに抗する特異性抗血清を負荷する。溶離はまずｐＨ８
−緩衝液を、続いて３ｍ　Ｋ８ＯＮ　Ｑ液をもって行な
う。）ただちに抗体フラクションを透析した後に酵素を
免疫検定及び二重ラジアル免疫拡散（Ｏｕｃｈｔｅｒｌ
ｏｎｙ技法）を用いて特異性抗体の検出を行なった。非
特異性固定の検査は対応のウサギの正常血清の塗布なら
びにポリアクリルアミド円板電気泳動及び免疫電気泳動
を用いてすべての抗体含有アラクシ１ンの試験により行
なわれる。

実施例１７： 排除容積５００００００　Ｄ、粒Ｊｊ８０乃至２０Ｑ　
ｐｍ　ならびに固形分含有−＊　６４　ｋｙ／−の粒状
セルロースＩＩをエタノール／水（１：１）ｐＨ２，５
中の５％アミノプロピルトリエトキシシラン（東独ＷＥ
Ｂ　Ｃｈｅｍｌ　−ｅｗｅｒｋ　ＮｆｆｎＣｈｒｉｔｚ
社ＮＢ　１１１４）とともに６０ｃにおいて６時間保温
し、貌いてエタノール／水５−ずつで２回、０．１ｍ＠
ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ，８５ｍずつで５回洗う。、ｉ４い
て活性化度をＧ、　Ａｔ１ｔＯｊｌｉ（Ａｎａｌ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ　１２９　（１９８３）　６０　）による
固体表面のアミノ基の測定により測定する。活性化度は
有機シランの濃度及び／又は保温時【出の選択により広
範囲にわたり変動できる。通常を工徨伏セルロー゛スー
あにリアミノ基１０乃至１５μＭｏｌ　　の特徴的な活
性化度が得られる。

一旦ｍ　ｆＪ　ｈｔロー 実施例第１７どおりの粒状セルロース５−をエタノール
／水（１：１）ｐＨ２，５中の１０％０％アミノプロピ
ルトリエトキシシランもに６００におい″ｃ６時間保温
し、続いてエタノール／水（１：１）３０−ずつで２回
乃至０．１ｍ燐酸塩緩衝液ＤＨ６，８２０−ずつで５回
洗う０こうして活性化したゲルを続いて５％ゲルタール
アルデヒドと０．１ｍ燐酸塩４＆価液ｐＨ６，ａ中で３
７℃において２時間混合し、続いて再びｇ４ｄ塩緩衝液
２０−ずつで５回洗う口 続い【プロティンの固定を単にプロティン固定量をこう
して活性化したゲルに添加して行なう。

このために粒状セルロースを０．１　ｍ燐酸塩緩衝液ｐ
Ｈ６，８中の撮度３５．５ｒＩｖ／−のヒトの免疫グロ
ブリンＧ　１０−と２時間常温において混合する。

固定されていないｌＡ部を吸取った後にプロティン固定
量を、使用したプロティン溶液と残部との蛋白質濃度差
測定により測定する。こうして粒状セルロース−あたり
ＩｇＧ　１２．９を固定し得た。

実施例１９： 粒状セルロース１−を実施例第１８記載のとおり活性化
し、濃度３％のグルタールアルデヒ・ドと。

反応させる。続いてこうして活性化した担体な濃度４１
，３ダ／ｄの　１町−ＩｇＧ　（ウサギから、酵素アル
カリホスファターゼに抗して向けられたもの）と混合し
１時間室温に保温する。過剰のプロティンを吸取り続い
て燐酸塩緩衝液５−ずつでよく洗った後に、プロティン
固定量を、標準としての使用したプロティン溶液を併せ
導きながら放射能を測定してｍ１１ｊ定する。この実験
において粒状セルロース−あたり１２５Ｊ−ＩｇＧ　１
１．４ダを固定し得た。

一大ＪＬｆｌ恕」− 粒状セルロース５ｓＩｔを″！Ａｍ例第１７のとおりエ
タノール／水（１：１）　ｐＨ２，５中の５％グリシド
オ中フジプロピルトリエトキシシラン東独ＶＥＢＣｈｅ
ｍｉｅｗｅｒｋ　Ｎｉｌｎｃｈｒｉｔｘ社ＮＢ　１１１
５　）とともに印℃において６時間保温し続いて１２０
℃においてさらに６時間加熱する。エタノール／水乃至
０．１ｍ燐酸塩＃Ｊｋｍ液２０−ずつで実施例第１８と
同様よく洗った鎌にこうして活性化した粒状セルロース
な０．　ｌ　ｍ燐酸塩緩衝液ＰＨ６，８中の一度ａｓ、
５１ｎ９／ｄのヒトの免疫グロブリンＧと常温において
２時間混合する。実施例第１８記載のとおりにして測定
したプロティ／固定量は粒状セルロース−あたり７．２
■であった。

実施例２１： 粒状セルロース５−を実施例第１７のとおり５％メルカ
プトグプロルトリメトキシシラン（西独５ｅｒｖａ社）
とともにエタノール／水（１：１）中で０℃において４
時間保温し、続いてエタノール／水５ｄずつで　回０．
１　ｍ燐酸°塩緩衝液ｐＨ６，８５Ｆｎ９ずつで５回洗
う。続いてセルロースを製造者の報告によると予めＮ−
スクシンイＺジル−５−（Ｚ−ピリジルジチオ）プロビ
オナート（スエーデｙ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社８ＤＰＤ
）をもって活性化しであるヒトのＩｇＧＩＯｒＩ９をも
って置換する。反応の際に遊離するピリジン−２−チオ
ンは３４３　ｎｍにおいて光度針により追求できる。

こうして固定したこのＩｇＧはウサギの抗ヒトＩｇＧ抗
体の回収及び単離に使用できる。親和力クロマトグラフ
ィーの終了俣はジスルフィド橋かけを介して同定された
工ｇＧはメルカプトエタノール又はジチオトレイトール
（５ＱｍＭ）により再び分離されて、活性化されたマト
リクスが改めて配位子を固定するのに利用できるように
することができる。

実施例２２： 粒状セルロース５−を実施例ｇ１７のとおりアミノプロ
ピルトリエト中ジシランとグリシドキシプロビルトリエ
トキシシラン（東独ＶＩＢＣｈｅｍｉｅｗｅｒｋ　Ｎｌ
ｊｎｃｈｒＩｔｚ社付着媒介剤６１’３０）との混合物
と接触させ、常温において２時間損盪する。

過剰の反応剤を吸取り、真空中で乾燥させ、続いて０．
１　ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ６，ｓでよく洗った後、担体な
３％ゲルタールアルデヒドと反応させ続いて実施例第１
９記載のとおり１２５Ｊ−工ｇＧを固定する。粒状セル
ロース−あたり１２５Ｊ−ＩｇＧ　２６．４ダを固定し
得た。

医産且Ａユ 実施例第１９及び第ｎのとおり１２５．−工頗と反応さ
せた粒状セルロースをジオキサン含有のＰＢＢ緩衝液ｐ
Ｈ７，４２０−ずつで３回洗い、続いて固定された放射
能を測定する。粒状セルロース上に残っているプロティ
ンの量は１１．４ダ／−（実施例第１９）及びｚｓ、６
ｙｎ９／ｄｃ実施例第２２）であって不変である。

」ＯＩシエニ 実施例第１９．４及び２において用いられた免疫グロブ
リンＧがウサギを酵素アルカリホスファターゼでの免疫
化によって得られた。従って１２５Ｊ　−ＩｇＧを対応
の抗体活性を活用しながら＃素アルカリホスファターゼ
の精製及び単離のため使用することが可能である。この
ためｎ−ブタノール抽出により予備精製したアルカリホ
スファターゼを央４例第１９のとおり　１２５．−　工
ρと反応させた粒状セルロースに固定し続いてトリエチ
ルアミンｐＨ１１，４をもって溶離する。こうしてｆｌ
Ｅした酵素は比活性１０００ＩＵ、４呼であり、歩留り
は約８０％で、ポリアクリルアミド電気泳動において随
伴プロティンは検出不能である。

夾崖贋至ユ ヒトの先便グ薗プリンＧを実施例第１８記載のとお・す
、粒状セルロースに固定しウサギの抗と）　　ＩｇＧ抗
体の単一に用いる。このためにＩｇＧで負荷された担体
はクロマトグラフィーカラムに充填し、これにヒトのＩ
ｇＧに抗する特異性抗血清を負荷する。＃陥はまず、Ｐ
Ｂ８−緩衝液を、続いて３ｍ　Ｋ８ＯＮ　浴液をもって
行なわれる。

抗体フラクションをただちに透析した後に、％異性抗体
の検出を酵素免反検定ならびに二重ラジアル免疫拡散（
０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎ３Ｆ技法）をもって行なった。特
異性固定の検査は対応のウナギの正常血清の塗布ならび
にすべての抗体含有クラクションのポリアクリルアミド
円板磁気泳動でのテストによって行なわれる。

］Ｏ１１互上 平担セルロース担体（ワットマン紙５６０及びＦＮ　４
紙）実施例第１９及び第加記載のとおり３％アミノプロ
ピルトリエトキシシラン又はグリンドΦシブロバルシラ
ンをもって活性化し、続いて０．１ｍ　　燐酸塩緩衝液
ｐＨ６，８中の濃度１０μＩ／ｘｔ及’ｃ％１００ｐＶ
ｄ　　　Ｊ−１ニド血清７／Ｅ／プｉ　ｙ　（””Ｊ−
ＨＥＩＡと反応させる。よく洗った後に、プロティン固
定量を、標準を併せ導きながらの放射能測定により、測
定する◎ここで得られた結果が表１にまとめである。

表　　　１ 固定された　１３１Ｊ　−Ｈ８Ａ ＦＮ　４　　１９２ｒｓＦｄ　　１０３６ｒ＆Ａｄ　　
７５４Ｍ　　３４３ｒｅｄワツト嘴ン５８０　６１ｊｉ
ン−４８６蝙レー　　　１５闇し鋪　　　７６−実施例
２７： 実施例第かにおいて”Ｊ−Ｈ８Ａを負荷した紙担体を続
いて酵素免疫試、Ｉ裟に用いる。このためにはこれらの
担体の特定の面積を、なお遊離の反応基がある場合には
予めエタノ−ルア建／でブロックした後に、適宜に希釈
したウナギの抗Ｅトーアルプミン抗血清をもって置換し
室温において１夜保温する。固定されなかった抗体を除
くため３回洗った後に、紙徂体をヤギの抗つナギエρ接
合体（酵素：アルカリホスファターゼ）とともに３７０
において４時間保温し改めて３回洗う。酵素活性はジェ
タノールアミン緩衝液ｍ９．８　ｏｄｄ　中の４−二ト
ロフェニルホスファトの加水分解及び４０５ｎｍにおけ
る酵素生成物の光度測定によって測定される。

ｍ口り二 平坦なセルロース担体（ワットマン５６０、フィルトラ
フ１３８９　、フィルトラフ３９０、ＦＮ３）を実施例
第４に賊のとおりア建ノプロビルトリエトキシシツンと
グリシド中ジプロピルトリエトキシシランとの混合物を
もって活性化し゛、続い”Ｃ０，１ｍ燐酸塩ｍｕｍ　ｐ
ｇ　６．８中ノ２　ｆｆｆｌノｌａ［）１２５、　＋　
Ｉｎ（Ｉ＃素）アルカリホスファターゼに抗して向けら
れたもの）とともに保温する・ＰＳＢ緩衝液で３回洗っ
た後にプロティン固定量を放射能測定により測定する。

その銑に平担なセル党−ス担体な改めてＰＢｉ９−緩衝
液で１０回洗い、プロティン固定量を再び、標準を併せ
導きながら放射能測定により測定する。ｉ＆臘にセルロ
ース担体な４週間の期間くわたって何回もＭＣｌ−グリ
シン緩衝液ｐＨ２，２，３ｍ　ＫＢＣＮ、炭酸塩−水素
炭酸塩−緩衝液ＯＨ１０及びジオキサ７９％含有のＰＢ
Ｓ−緩衝液で洗い、改めてプロティン固定量測定にかけ
る。

結果は；、Ａ２に示しである。

表　　２ 固定された１２５Ｊ　−ＩｇＧ 本発明による紙状マトリクスを備えている平坦担体はさ
まざまな礒度の、　　Ｊで放射能標識を施こしであるヒ
トの免疫グロブリンＧ及び緩衝系と混合して３７℃にお
いて１６時間保温する。

Ｔｗｅｅｎ　２００．９５％含有のＰＢＳ−緩衝液ｐＨ
７，４で３回洗った後に、過剰の反応基がなお残ってい
る場合には１ｍエタノールアミン溶液をもってブロック
する。改めて上記ＰＢ８−緩衝液で洗った後にプロティ
ン固定量を放射能測定により求める。可能な脱着を測定
するため就いて試料を改めてＰＢＳ−緩衝液で７回洗う
。こうして負荷された平坦担体を次に免疫反応性測定の
ためウサギの抗ヒトＩｇｆ）と酵素アルカリホスファタ
ーゼとからなる接合体と混合しヱ温に１夜保温する。改
めて洗った後にアルカリ−ホスファターゼの酵素活性な
ジェタノールアミン緩衝液ｐＨ９，８０，５−中の４−
二トロフェニルホス７１トの加水分解とｔｎ　Ｎ＠ＯＨ
又はＩｎ　ＥＤＴＡを用いて停止した後に４０５ｎｍに
おいて酵素生成物の光度計による測定とによって測定す
る。酵素免疫試験を実施した後に平坦担体をＰＢＳ−緩
衝液０．５−ずつで２回洗い、続いて多重測定において
下記の解離試薬のうちの１種と４℃において１時間混合
する。

１）ＰＢＳ−緩砺液、２ｍＮａｃｌ、ジオキサン５％含
有　、２）　１ｍ　ＫｓＣＮ　、　　３）　３ｍ　Ｋｓ
ＣＮ　、　４）　４．５ｕｎ　Ｍｇｃｌ　　、５）　１
　ｍ　ＮａＪ　、　　６）　ＨＣ’−グリシン緩衝液ｐ
Ｈ２，８これらの薬剤すべてにより、結合された抗原−
抗体−複合体が分離すれてヒトの工ｇＧを負荷された平
坦担体が改めて酵素免疫検定に使用され得ようになる。

遣ｍ乱二 本発明による平坦成形体ＣＦ＝５６−）を実施例＠ｎ記
載のとおり活性化し、ヒトの因子■を負荷する。これら
の担体をポリスチロール微量滴定板又はポリスチロール
小管中へ移し、続いて？−■抗体測定のため（Ｗ、　５
ｃｈ８５ｓｌｅｒ、　Ｍ、８ｔ−ｅｐａｎａｕｓｋａｓ
　Ｃｈｒ　ＤｉｔｔｒｉｃｈＨ，Ｈｅ１ｎｅ　：　Ａｃ
ｔａ　ｂ　−１ｏ１　ｍｅｄ　ｇｅｒｍ　４１（１９８
２）　２６３　；　Ｗ、　ＳｃＭｓｓｌｅｒＭ、　５ｔ
ｅｐａｎａｕｓｋａ＠Ｃｈｒ　Ｄｉｔｔｒｉｃｈ　：　
Ａｃｔｉ　ｂｌｏｌｍｅｄ　ｇｅｒｍ　４１　　（１９
８２）　６９５）記述の方法で酵素免疫検定を実施する
。このため成形体を、測定すべき血しようと過剰に存在
しているウナギの抗ヒト−因子■抗体とからなる保温混
合物と混合し３７℃において６時間保温する。

改めてＰＢＳ−ｄｉ液ｐＨ７，４（Ｔｗｅｅｎ　２００
．０５％含有のもの）で洗った後、ヒツジの抗ウナギＩ
ｇＧと酵素アルカリホスファターゼとからなる接合体２
００μｔを加えて数時間の保温及び後続の洗浄の後に酵
素活性を実施例第９記載のとおり測定する。結合された
抗体の分離は実施例第四にあげた解離試薬のうちの１ｌ
ａｌをもって行なわれて因子■を負荷した担体が改めて
免疫検定に使用し得るようにする。

実施例３１： 本発明による紙状マトリクスを備えた平坦担体に実施例
第９記載のとおりヒトの因子■を負荷する。この担体は
以下において（モノクコ−ナル）抗体についてのスクリ
ーニング調査のためのモデルとして役立つ。この平坦担
体ではとくに単純に形成される洗浄工程の実施後に、調
査すべき及び測定すべき物質を適宜な塗布へうで点状に
塗布する。我々の場合においてはこのために適したウナ
ギの抗ヒト因子■血清の乃至負の対照としてのウナギ血
清の希釈物が抗体源として役立った。３７℃における４
乃至６時間の保温後に平坦担体を改めて洗い、酵素ペル
オキシダーゼと組合せたヒツジの抗ウサギＩｇＧととも
に３７℃において４時間又は室温において１夜保温し改
めて数回洗い、酵素活性を適宜な検出システムたト、ｔ
ｊ？　４　ｍｕ　ｏ−フェニレンジアミン及び１．５　
ｍＭ　Ｈ２Ｏ。を用い生成する着色の目視評価によって
測定する。陽性の着色は明かに抗体を示唆する。

実施例３２： 羽 心臓の筋肉からの膜漢中に含まれている　Ｐで標識しで
あるホスホプロティンを、燐酸塩緩衝しであるドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動系
中においてＷｅｂｅｒほか（Ｋ、　Ｗｅｂｅｒ　、　Ｊ
、　Ｐｒｉｎｇｌｅ　、Ｍ、　０ｓｂｏｒｎ　＋Ｍｅｔ
ｈ　１３：ｎｚｙｍｏｌ　２６　（１９７２）　３）に
従って分離する。

電気泳動終了直後、分離したプロティンを、本発明によ
り活性化した紙上で、トリエタノールアミ、ンと酪酸と
を含んでいる伝達系中においてＫｙｌｌｓｅ−Ａｎｄｅ
ｒｌｅｎ　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　
Ｍｅｔｈ　１０（１９８４）　２ｏ３）に従って免疫プ
ロッティングを施こす。プロッティングの後にはゼラチ
ン０．１％及びＴｗｅｅｎ　Ｏ，Ｏｓ％含有の燐酸塩緩
衝した生理的食塩水中に浸し、続いて第１のウナギ抗血
清とともに保温し、続いて抗ウナギ免疫グロブリンーワ
サビダイコンペルオキシダーゼ接合体とともに保温し最
後に指示薬反応を行なう。ペルオキシダーゼ接合体の代
りにアルカリホスファターゼ接合体も使用でき同じ成果
が得られる。

実施例３３： さまざまな型の筋肉細朧の細胞内膜のプロティンをドデ
シル硫酸塩ポリアクリルアミド−グル電気泳動系中にお
いてＬａｅｒｒｍｌｌ　（Ｕ、に、　Ｉ４ｅｍｍ−１１
Ｎａｔｕｌ　２２７　（１９７０）　６８０）　ＶＣ従
’）　テ分ｍ　−ｒる。電気泳Ｍｅ、ゲルを２５ｍＭ　
）　！ｊエタノールアミンーヒドロクロリドｐＨ８，４
、０，１％ドデシル硫酸ナトリウムからなる緩衝液中に
おいてｍ乃至ω分間浸よする。その直後に実施例第３２
記載のとおり免役プロッティングを行なう。

代理人弁理士　衛　藤　　　　侑 外１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒドロキシル基含有の天然及び合成のポリマ固体表
   面の活性化の方法において、ヒドロキシル基を式 （ＸＲ＾１＿（ｎ＾１））＿ｎＳｉＲ＿４＿−＿ｎ（
   I ）（式中Ｘはアミノ−、カルボニル−、カルボキシ−
   、エポキシ−、イソシアノ−、ジアゾ−、イソチオシア
   ノ−、ニトロソ−、スルフヒドリル又はハロカルボニル
   −基、Ｒ＾１はアルキル−１アルキルフェニル−又はフ
   ェ ニル基、Ｒはアルコキシ−、フェノキシ −１又はハロゲン基であり、ｎ＾１は０乃至２０の値、
   ｎは１乃至３の値である）の有機シランと反応させるこ
   と又は反応を少なくとも２種の式 I の有機シランをも
   つて混合物中において又は順次に液相又は気相において
   行なうこと及び引続いて場合によつてさらに同種又は異
   種二官能反応剤をもつて処理を行なうことを特徴とする
   方法。 ２　式 I の化合物とヒドロキシル基との反応は有機溶
   媒、溶媒混合物、水溶液又は水と有機溶媒との混合物の
   中において行なわれることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３　気相においてエーロゾルを用いて又は大気圧より低
   い圧においてヒドロキシル基の反応が行なわれることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４　ポリマが成形体として存在していることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１乃至３項記載の方法。 ５　成形体は球面状、繊維状又は角形であることを特徴
   とする特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６　成形体は球形であることを特徴とすることを特徴と
   する特許請求の範囲第４項記載の方法。 ７　成形体は充填、織成により又は結合剤によつて集成
   してカラム充填物又は平坦材料としてあることを特徴と
   する特許請求の範囲第４乃至６項記載の方法。 ８　成形体はフィルム又はラツカとして他の担体上に存
   在可能である薄層となつていることを特徴とする特許請
   求の範囲第４項記載の方法。 ９　ＯＨ−基含有の有機高分子（特許請求の範囲第１乃
   至８項記櫨の方法に従つて作られたもの）からなる活性
   化したポリマ成形体において、ポリマ固体の表面には一
   般式 （−Ｏ−）＿４＿−＿ｎＳｉ（Ｒ＾１＿（ｎ＾１）Ｘ）
   ＿ｎ（IV）（式中Ｒ＾１はアルキル−、アルキルフェニ
   ル又はフェニル基、Ｘはアミノ−、カルボニル−、カル
   ボキシ−、エポキシ−、イソシアノ−、ジアゾ−、イソ
   チオシアノ−、ニトロソ−、スルフヒドリル−又はハロ
   カルボニル−基であり、ｎ＾１は０乃至２０の値またｎ
   は１乃至３の値である）の基団及びＯＨ−基がありＯＨ
   基対基団IVの比率は１：９乃至９：１であることを特徴
   とするポリマ固体。 １０　ポリマ固体は球面状、繊維状又は角形であること
   を特徴とする特許請求の範囲第９項記載の活性化したポ
   リマ固体。 １１　ポリマ固体は結合された及び充填された状態にお
   いて圧倒的に二次元の拡りがあることを特徴とする特許
   請求の範囲第９及び１０項記載の活性化したポリマ固体
   。 １２　結合したポリマ固体は不織布、紙、箔、フィルム
   又はラツカであることを特徴とする特許請求の範囲第１
   １項記載の活性化したポリマ固体。