JPS62230801A - 低粘度で高分子量のろ過滅菌可能なヒアルロン酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 即ｌ ヒアルロン酸（ｂｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｃｌ）及
びその塩（ＩＩ＾）を目及び関節液代替液として在利に
使用できることは、広く公知である。例えばＤａｌａｚ
ｓによる米国１．１訂第４，１４１．９７：４号、及び
Ｉｆ　ｒ　ｕ　ｃ　ｋ　ｅ他、米国＃、１７（第４，５
１７，７９５号、及び−ａｒｒｅｎ、米国特許第２　、
９７５　、１０４１）を参照されたい。更に１９８３（
１’−１ｍｌ月２５日イ・ｊけ１．′ｒ詐出願番号第５
５５，２２４号及び第５５５．３１（ＬＳ、：’も参照
されたい、ヒアルロン酸又はそのＩｉａの用途は、その
殆どが高分子Ｍｒ、を必要とする。例えばＩＩｙｌａｒ
Ｌｉｌ（Ｐｂａｒｍａｃｉａ社製、１ｌａｌａｚｓ）の
ような■＾生成物は高い分子量を有するが、しかし又高
い粘度を有する。このような高粘性製品は用途によって
は、例えは手術後の癒着組織の減少には理想的であるか
も知れない、しかし、注射用Ｈ八はむしろ低粘度で、濾
過可能、特にｒ過滅菌ＬＩＴ　ｆｉｔ：でなければなら
ない、新規な抽出法が幾−ノか提案されて、低粘度１ｍ
ｌ＾が製造されているが、それは、同時に分１′−鼠も
低下している（ＳＬｅｒｉｖｅＬ社製品、口ｒａｃｋｅ
　、米国特許第４，５１７゜１９５号及び島田及び松材
、１９７５参照）、確かにこれは注射可能という点では
有利であるが、低分子Ｊｄ、であるために、大量投与が
必要である（Ｐｌ＋ａｒｍａｃｉａ製品２１ａ１対５ｔ
ｅｒｉｖｅＬ製晶５ＩＩＩｌ）。

更に５ｔｅｒｉｖｅｔ製品は濾過滅菌が出来ず、加熱滅
菌せねばならない。

低分子ｉｌｌ八から高分子ｆｆ１ｌ＋八を製造する方法
に就いては、（１！ｆ等記載がない。しかし、ｐ＋＋を
調Ｊ３することによって粘度を低下させる方法について
は、文献に記載さ）じζいる（旧ｔｒａ　ｅＬ　ｕｌ。

１９８３、旧Ｌｒａ、　ＩｔａｇｂｕｎｎＬｌ＋＋ｎ＋
　ｅＬ　ａｌ、　１９８：に及びＳｌ＋ｅｅｈａｎ　ｅ
Ｌ　ａｌ、　１９８３参１ｊｑ）、これらは粘度低下を
分子量と関連１・１けてＪ論はぜず、ｐＨによる１ｍｌ
＾分子のり通約なコンホメーション（立体配坐）変化に
よるとしている。彼らは粘度低［は恐らく規則配列−未
配列転移による分子の柔軟性の増加による乙のであろう
としている。この事は分１′か不安定であることを思わ
せるが、事実分子’ｒｒＬは低下する。Ｓｗａ旧＋（１
９６９）は、粘度減少は水酸基のイオン化により、ＩＩ
八へ−へワックス横ＪＨのランダムコイル内の分子間水
素結合が遮らｉＬるためとの、考えを提唱した。興味深
いことに、この高１）１ｍｌから起こる粘度低下現象は
＋１ｍｌ１を３．０以１ζに下りることによって、全＜
　”ｕＪ逆的になる。

実際、１＋ｌＩλ、１ノ２．５て粘弾１ｍｌのバｊかｉ
ｌｉられる（Ｇｉｔ＋Ｌ＋ｓ　ｅｔ　ａｌ、　１９６８
）、高９１ｍｌ低粘度１ｍｌ八はｄ９過滅菌が全く国・
雉であるという°１ｍｌらまた注ｌ］ずへき°（ある。

ケル層か７戸）ｂｊ模１ｊ１ｍｌ面に形成されて人」−
１゜ｄ・過か一１ｍｌ天上小川化になるのである。

へ澄Ｊ五え法 我々は、高粘度の品分＝−ｘ＋＋＾（ヒアルロン酸ナト
リウム、Ｎａ１ｌの形か都合が良い）を製造し、そして
１ｍｌへの粘度を、希望する高い平均分子量を低−１ζ
させる事なく低１ζさせる、比較的４を純なそして新規
な技術を発見した。マｉトられるＩｆ八は、狭い分子量
分布を持つ高い平均分子量（好ましくは約１．２　ｘ　
１０６以上）、低粘度（好ましくは１重量％／ｓ湾の３
７℃での粘度が約５００　ｃ／ｓ未／；１７）、超高純
度（ＩＩＬＩＩｃ又はＵｖ分光光度法て測定した蛋白質
、又はアミノ酸の皿が、１．２５好ましくは０．１　＋
ａｇ／ｍｌそして同じ方法で測定した核酸の呈が４５、
好ましくは５．０μｇ／ｍ１未満によって特徴づけられ
る。

ボ明の詳槻食３＋ｔ　１ｉｉ− 低粘度でしかも高分子量、狭い分子量分布の１ｍｌ八を
、１ｍｌΔ溶液の制御した熱処理、又は最低膿度溶ａｆ
！：高圧か真空をかけて細孔膜を通して７濾過すること
によって得ることができる。全く驚くべきことにこれら
の粘度低下技術は、上記のＩ＋１ｍｌ技ｕ：ｊとは一°
Ｃなり■」通約てはなく、しかも粘度減少によって分子
量を低下させることがない。更にここで述ｌ＼る粘度低
下技術は１ｍｌ＾鮪終製品をｌ濾過滅菌可能にするのに
たいして、Ｉｆによる粘度低下ではｄ１過可１ｊ旨な製
品は得られない、同時出願の米国特５１出願（Ｕ、Ｓ、
　ＰａＬｅｎＬ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）第５５５　
、２２４号によって得られるＩｆ八は高分子量であり、
そしてかなり狭い分子量分布を有する。しかしそのＩＭ
（＋水溶液の３７℃での粘度は通常的５００　ｃａｓを
超える。この粘度が余りに高いために、本技術に望まれ
る温和な条１’１．Ｆ、即ち約５１＋ｓｉの加圧、また
はそれに相当す−る真空十での滅菌てゼ・要な、０．２
２μの細孔σｉ過膜を通すυｉ過１条作かできない。

熱による粘度減少は、時間及びｉ１！度に正比例する。

−・定温度（好ましくは５０ないし７０“Ｃの範囲）で
の熱処理を長くすれはするほど、粘度は低下り−る。約
１２１℃にまで温度と上ＩＪると、粘度はより）、！１
期間に減少する。しかし、高すきる温度をＪＣＩｆ！ｉ
間かけるのは（１２１’（、：以」二を６０分間以上）
、カラメル化や加水分解か起こり、分子旦低下を引き起
こして望ましくない、濾過の際使用する細孔膜は平均細
孔径は約１．０μ以下、好ましくは０．５μでなければ
ならない。

下記実施例の巳は、同時出願の出願詐号第５５５．２２
４号の指示に従い、ただβ−プロピオラクトン消ｉ；ｉ
は行わずに、工業現模のバッチ法で製造したものであり
、１ｍｌ　Ｊ３よび３に示しである１ｍｌ＾はそれぞれ
沈澱させる際に巻取りを行った。

我々の１ｍｌへの非常に重要な点は、比較的高い分−１
′−量（ＰＡえは少なくとも約１，０００，０００、好
ましくは少な・くとらｔ、８ｏｏ、ｏｏｏ）に拘わらず
、人工的に低められた粘度（例えば１ソロナトリウム塩
水溶液として少なくとら約５００、好ましくは約１５０
Ｃ／３）であることである。我々の、実質的に平均分１
′・量を１・げずに枯瓜を低ドさＵるノＪ法を２種類、
実施例及び１；記の人（人中１ｍｌに断らなけれは、分
ｉ’−星はＦＩ’ＬＣ（Ｆａｓｔ　Ｉ’ｒｏＬｅｉｕ　
ＬｉｑｕｉｄＣｂｒ＋、ｎｎｕＬｏｇｒａｕｂｙ）（蛋
白質分離用高速液体クロマトグラフィ）°ζｄｌｌｌ定
、粘度はＮｕｌｌ　１％水溶液を３７“（」てａｔ１定
したものである）に示４°。

１ｍｌΔの分子−′ｕＬ及び粘度の増加は、１ｍｌ八又
はＮｕｌｌの非溶媒を含む浴中て連続的に移動し、沈澱
した１ｍｌ八またはＮｕｌｌを付着させる装置を使用す
るノＪ法て行う。る収り器（ここではワインダーと称し
ている）は、１ｍｌΔが沈澱している液状媒体に回転シ
ェアーを与え、上記移動装置を動がして沈澱しているＩ
ＩＡをそれに付着させる。ワインダーはステンレス製の
棒状物で、垂直に立っており、回転軸に取り１・１けら
れている。垂１０：軸が好ましい。回転軸はモーターで
回転し、その速度が制御λ−される。ワイングーの太さ
さ及び形は、容器の大きさ及び採取する１ｍｌ＾の呈に
よって、ぞれぞれに音うよっに変えることが出来る。筆
状で金網で出来ている回転円筒体が好ましい。このワイ
ングーを用いて、品分１′鼠、高粘度の１ｍｌ八は以下
に述べる方法で製造する。

ヒアルロン酸ナトリウム溶液を非溶媒、好ましくはエタ
ノールを含む容器の中に、細い一条の、あるいは数条の
流れとして供給する。非溶媒に接触すると生成物は直ち
に非溶媒で飽和し、長い紐状になって沈澱する。紐状物
はワイングーの回転によって移動し、それによって容器
内の非溶媒が回転移動する。沈澱ヒアルロン酸すｌ・リ
ウムの紐状物がワイングーの指状体又は垂直棒体に接触
すると、沈ｉＡ物はそれらに付着する。生成物は自己付
着、及び入面付着の傾向があるのて、ワインダニにＪ　
ｌｉｔする。この自己付着性の為に、多数の分子間水素
結合が形成され、ポリマーはより長くなり、その結果、
品分子址、及び高粘度になる。底部から排水出来る容器
を使用すれば、希釈された非溶媒を容器から取り出し、
水溶液又は緩＠溶液を必要に応じて更に導入することが
できる。こうして得られた沈澱生成物は、手を加えなく
とも自分で、容器中で再忍解する。　Ｂｒａｃｋｅがこ
のような方法に就いては何等示唆していないのは、注目
すべきである。

８１・ａｃｋｅはエタノール−１ｍｌ＾溶液は撹拌した
り、混合したりしてはならないと、縁り返し強調してい
る。

゛Ｒ閃ｄＩｋ 表１−３は熱の粘度に及ぼす効果を示したものである。

粘度は、全部Ｃａｎ＋＋ｏｎ−ＭａｎｎｉｕＨＳｅｍ１
−Ｍｌｃｒｏ　Ｖｉｚｃｏｎｅｔｅｒにより、＾ＳＴＭ
　Ｄ４４５およびＤ２５１５に記載されている方法に従
って、３７℃で１ｔｔｌ＋定し、センチスト−り（ｃ／
ｓ）て記録する。分１′量は蛋白分離用高速液体りＬ７
７トグラフイ（Ｆｌ’ＬＣ）及び１°ＳＫ　ＩＩＷ０５
Ｆ又は１°ＳＫ　ＩＩＷ　７５Ｆを用いるケルＩ）１過
（ＩＩｃｆＬ＋ａａ＋ｕｔ、　ＣＩ＋ｒｏｍａＬｏｇｒ
ｕｐｂｙ）によって１τ記の方法にしたがって測定する
。

ヒアルロン′ナトリウムの重Ｊ辻ｊυ尖ｔヱ又１鼻仕へ
置足 Ｌ」上飯 公知の標県分子輩潤定と関連イＮ１けてヒアルロン酸ナ
トリウムの重Ｍ　５Ｆ−均分１′・量を測定する液体ク
ロマトグラフィ法を提供する。。

こ見権ＩＪＩＩ− ヒアル１７ン酸ナトリウムの総ての原１・１及び／また
は完成製品に適用１ｍｌ［能である。

し幻だｉ ケル沢過（分’／ｌｆｔ分別タロマトガラフ）は分別溶
出したピークの大きさを、分子の形、密度が似ていて分
子間も分がっている物質を分析して得た、標準曲線と比
較して決定することができる。効果的ではあるが、分析
する試料と同じ程度の分子通を有する標準物質から標準
曲線を作成しなけｉｔばならない。

り用正 ４．１５器パラメーター カラム−ＦｒｕｃＬｏｇｃｌ　’Ｉ°ＳＤ　ＩＩＫ　６
５Ｆ　（ＩＥＭ　５ｃｉｅｕｃｅ） 分別範囲＝５０，０００−５，０００，０００　ＭＷ（
球状分子） カラム寸法−ゲル充填部分５０　ｃｖａ　）　２　ｃ　
ｍ高さ　　ｘ　　２．Ｏｃ＋ａ内ＩＹ 移動相−ＰｔｌＳ−１ｍｌ（配な表添付）０．２２μｍ
＋Ｉｎ：ｃ上でＺ濾過（１５０１ｍｌ１ｍｌ／１江人）
流速−２１ｍｌ１ｍｌｂｉｎ ／−ｑ−１−速度−（１，２（ｌｃ＋ａ／＋ａｉｎ検出
≧−感度−４ｘ　、０５　（ＩｓｃＯＶＹ）波長−２０
５ｎ＋＊　−２０８ｎｎ 制御器ＬＣＣ５００（１’ｂａｒｕ＋ａｃｉａ）！１．
１／定されたｆｉ　２：：パラメーターに従ってカラ１
ｍｌを操ｆｉ：するようにブロクラムが組まれている。

注入１Ｉｔ−１００１ １ｍｌ！度−カラムの温度は、室温で一定に保持するの
が、最も好都合である。操１ｍｌ゜中温度か変化すると
ベースライン が一定に保たれず、同温度での操１−結果しか利用し難
くなる。

ベースラインが定常状態に到達するまでカラムは移動相
で安定化させる。

（才１」−輩へ侃に ４．２．ａ、訂− 移動相−’ｌ’ｙｒｏＨ１ｏｂｕｌｉｎ　（Ｓｉｇｍａ
　＃’ト１００１）、分子Ｍ、（ｉ６９，０００又は相
当物及び口Ｉｕｅ　　ＤｅｘＬｒｏｎ ４　、２　、１ｍｌ　、１ｉ？ｉ　１Δ試料２５ｍ１の
メスフラスコにＴｂｙｏＦｌｌｏｂｕｌ　ｉｎ　Ｏ，０
０（ｉ　ｇｍｅｆｌり込み、貯蔵溶液を、ｉＩ！１製す
る。移動相で印の線まて希釈する。混な物を時々振って
、完全 に溶解させる。貯蔵溶液Ｌｏｃａｌをピペットで収り、
２０１のメスフラスコ に移す、拶動４Ｉで印の線まで希釈する。

１４られたｔ８液はｒｂｙｒｏＨｌｏｂｕｌ　ｉｎを１
２５μｇ／１ｍｌ１ｍｌ含んでいる。

４．２ｃ　　Ｂｌｕｅ　ＤｃｘＬｒａｎｏ、０８　ｇを
２０１のメスフラスコに＝１り込み貯蔵溶液を作製 する。移動イ（１て印の線まで希釈する。

混合物を時々撹拌しながら完全に溶 解する。（−）られな貯蔵溶液５１ｍｌ１を別のメスフ
ラスコにピペットで１反る。

印の線まで移動相で希釈する。？）ら れたン容濯はＬｌｌｕｅ　ＤｅｘＬｒａｎ　１０００　
ｌ１ｇ７ｍ１に相当する。

両方の７８液共３０１」間安定に冷蔵てきる。実験に使
用する′ｔ８液は、貯蔵溶液から毎日新たに調製する。

実験用溶液はりｔコマトゲラフにかける前に孔径０．２
２ｕのｎｖ過膜を使用してＰ通ずる。

４．２ｄ　　各のＨ−標準品３．５　Ｔａｌを取り、ラ
ベルをつけた二ｆｆｌ管に取る。制御器を注入数にセッ
トする。

４．２ｅ　　ＪｆｉＲ１ζ品両者に対する平均溶出量の
中間値（Ｖｅ）を測定する。

４．２ｆ　　そｈぞｈのＩ（ａｗｒ！：ｌ’記Ｊ（によ
って３１算する。

Ｋａｖ　　；　（Ｖｅ　　−Ｖｏ）バｖｔ　　−Ｖｏ）
Ｖｏ　　二　（Ｖｔ、０．３３＞ ＶＬ　：　ａ「２ｈ ここで ｖｅ＝溶出体ＨＩ Ｖｏ・気孔率（ケル細孔からの全排 出■） Ｖｔ・ゲル充填カラムの全容れ′Ｉ Ｋａｖ・常時溶質が拡散できる固定相 ゲル容積率 ｒ・カラムの内部半径 ｈ・カラム充填剤の高さ。

４．２Ｋ　　グラフ３作り、Ｘ−軸に標準物質のｈを、
そしてＹ−軸ににａＶを取る。標準Ｋａｖをグラフに１
０ツトし、両標 準点と交差する最適曲線を描く。か 又は 上記データ３−・次回帰線の７０グラ ムを組み込んた５１算器またＣ１コンピュータに人力す
る。

４．３−、；５ｉ：１の平均分Ｊ　−ｂｋ　［１疋４．
３ａ　　試Ｆｌが０．８０ないし１．２％のＩＩＡを含
むときは、４．４１（−０，５２ｇの試料を２０＋ｓｌ
のメスフラスコに、？１り込む。移動相で印の線上で治
釈する（１：４０の 希釈）。

４．３ｂ　　試Ｆ［か０．８０′ｘＪ以トノ１ｍｌ＾ｔ
ｋむときは、０．７８−０．８２　ｇの試ｆ４を２０１
のメスフラス＝１に計り込み、移動相で印の 線まで／ｒｉ釈する（１：２５の希釈）４．：Ｊｃ　　
試？４１ｆ１．２−２．０％以下の１ｍｌ八を合むとき
は、０．３１−０．３５　Ｈの試！：１を２０ｍ１のメ
スフラスコに計り込み、移 動相て印の線まて希釈４゛る（１：００の品釈） ４　、３　ｄ　　ｆｉｔみ立てた関係機器の条件ｔ　Ｊ
’Ｊ　ｐする。０．２μのＵ３過試Ｔ４をλむ１０００
．１を、標準化で使用したのと同じ機器 を用いて注入する。

４、：Ｊｅ　　３注入試料について、Ｖｅｐ測定し、Ｋ
ａｖをＪＦｒＪ、する。

４．３ｆ　　試料のＫａｖをブロワ１−（人力）する。

Ｘ軸から対応するＩｏＨＭ−値を求ｙ）る。

逆対数から分子−Ｍの数値を求める ５　、　Ｑ　＃４１じ匙の妥当性 ５　、　Ｉ　　ｔ＋％準試料−ＬｂｙｒｏＨＩｏｂｕｌ
ｉｎに対する値力弓、２５・−１，３９輸Ｉ／ｃｃゲル
ならば妥当である。　Ｂｌｕｅ　ＤｅｘＬｒａｎの第一
ピークに対する値は、８２−．９０　ｍｌ／ｃｃゲルに
ある（第二ピークは分子量が２　、０００　。

０００より小さい）。

５．２　　測定試料−試ｆ゛１のＶｅが標堂曲線の範囲
内にあれは結果は妥当である。

５．３　　標準試料又はより定試料にあり、対するＫａ
ｖが０．０より大きく１．０より小さければ結果は妥当
である。

５．４　　分画物１度か０．２０−０．３０　ｍｇ／ｍ
ｌ　（又はシフトが起こるのであれば）結果 は妥−当て′ある。

６、叶［ 標準曲線は、もしシステムパラメーターの変（ヒ例えば
、ゲルの収縮、新しいカラムなどで頻繁に測定するので
なＧ−Ｊれば、新しく調製した試蘂を使用して３０日毎
に作り直すべさである。

１ｍｌ０４相の配０“表 ＮａＣ１８，５［＋１ｍｌ１ Ｎａ２１ｍｌＰＯ４（無水物）　＊　０．２３３　ｇｉ
ｎＮａｌ１２ＰＯ＋、ｌ１ｚ００．０４　［＋１ｍｌ１
を１０００　ｍｌメスフラスコに加え、蒸留脱イオン水
て印の線まで希釈する。良く混合劣る。使用する際に、
０．２２　、のろ過膜をｌ）濾過する。無菌状態に保て
ば室温で１５０間安定である。

Ｉ！Ｑ、ｕならは、その代わりにＮａ２１ｍｌＰＯ，（
２水！ム）を使用する。

艮１°ζは、各バッチは解放容器中で、約６０℃の°定
温度で２０口間加熱する。この好ましい処理によ一ノて
、粘度は大きく低下（例えばハツチ１ては４４７５から
１３４へ）し、その間分子・址は一定に保たれる。”　
　　　　　ｌ　　、Ａ−、９表２に示し／ごデータはＮ
ｕｌｌの同じ　１％ｉ８　ｌ１文の３アリ＝１−１・企
、３０ないし５０℃に設定して−・定時間加熱してｉ：
（たものである。このよっなポリ÷−溶液の粘度が、３
０℃で長期間保つだけでも低下させることが出来る（３
１８から２９８へ）ことが明らかである。同じ期間、温
度を５０℃にすると粘度低下はより大きくなる（即ち３
１８ｈ・Ｉ’Ｊ１７５へ）。分子量はやはり変わらなか
った。

Ｎａ１ｌの粘度に対する品温の影響を人３に示した。１
．１％Ｎ　ａ　ＩＩ　ｉ８液をオートクレーブ中、１２
１℃１５ｐｓｉで３０分間加熱した。更に、３０分間オ
ートクレーブ処理した。表３からこれら短期間ＩΩｉ温
処理によって、粘度か大きく低下し、しかし分子量には
影響しないことを明確に示している。

熱処理は、出発物の粘度によって幾らか異なる乙のの広
範囲に亙る条１′トの丁で効果かあることが発見された
。°１￥に解放容器の中、約５５ないし８０℃の温度て
約７ないし２ｌ目間処理するのか１利である。密閉容２
を中での熱処理は粘度低下を妨りるよっである。

Ｃｊ狛に 粘度低下に濾過法を使用する場合は、細孔径、流速、ｄ
ｉ過実回数に左右される。この方法は、（ｔｈ、度か低
くなれはなる程、分１′−の形が余りに複Ｓｉｃになっ
てしまって、σコ過膜の８・■孔を通過出来な・くなっ
てしまうので、約１重量％又はそれ以上の１ｍｌ４溶液
に適用ずべきである。この濃度では、粘度は非常に高く
て、高圧、高真空又は溶液体積に対する高７１′４過面
積比の下でｌ過を実施する必要かある。細孔径が小さく
なればなる程（例えば、０．５μ）、圧力又は真空は高
くなり、粘度は低１・″する。更に粘度は、ｂ′ｉ過回
数に正比例して減少する。表４はこのｄ１過効果を示し
たものである。硝酸セル１コース製濾過股を、５−１０
インチＩＩｇの高真空Ｆに１史川する。粘度はやはり分
子量に影響なく低ドする。との２１Ｊ過材ｆ・１でも、
この１′八度減少はり能のようである。

１ｍｌ八又はＮａ１ｌが、細孔径０．２２の６・過膜を
通して（１ｍｌ過滅菌することが１！通には非常に困難
であることは！ｉ：口しなけれがならない、、ＩＩを１
ｍｌにして粘度をＦす゛た１ｍｌ八あるいはＮａＨでも
、上に述べたように、そのまま「ｌ過膜を通過すること
はない。

しかし、我々は我々の方法によって熱処理するが、また
はｆ過処理すれば０．２２μのｌ過膜を容易に通過し、
Ｅｔ柊製品として滅菌できることを発見した。我々の発
見した粘度低下法は、双方共ｐｌ＋増加の場合と同様に
、分子コンホメーションの変１ヒを引き起こす事か理論
づけられている。

高粘度を引き起こす、初めの剛直なα−へリツクス１ｍ
ｌ１ｍｌ造は加熱、あるいはｆ’過によって分−ｒ間詰
合か切断されて、柔軟になる。しかし我／ｌの方法では
、単に温度あるいは、ＩＩを低トさせたたけでは、ｐＨ
変化による粘度変化に見られるような可逆性にはならな
い。

ここに述べた本発明両りの方法によって、最終的にはｉ
Ｊｉ過滅菌可能な高分子ｎ低粘度１ｍｌ＾が製造される
。好ましい製造方法は、その概略を実施例１に説明する
。

本発明を更に説明する。しかし、本発明は、これら実施
例に何等制限されない、実施例中、部及びパーセントは
、１．＋ｆに１ｆｌｉらなけれは重数ベースである。

彩色、健。

’：ｊｉｈ＠Ｊ！！Ｌ１ ■３本出願者か同時出願している特許出願番号５５５　
、２２４号に記載しているような細Ｉ２１発酵あるいは
その外から（例えば、雄鶏のとさが、鰭帯）０．５％以
」二の濃度の１ｍｌ＾（そのらのあるいはその塩、好ま
しくはＫ又はＮａ塩）溶液を（：′ｆる。細菌からｉ：
；た１（Δが好ましい。

２、沈澱槽に巻取機を設置し、槽中の９５％エタノール
を１見拝しながら、そこへＩＩ　Ａｈｌ液を供給出来る
ようにする。

３、巻１■機を低速、又は中速で回しながら、１ｍｌ八
をエタノール浴中に加える。

４．１ｍｌ八溶液を添加し終えてから約３０分間撹拌を
続ける。

５巻１■り基土に１ｍｌ＾を沈澱さＵ゛てから、＋ｔＶ
かｌ）エタノールを抜き出す。

６、槽を７．ト射用の水（Ｗｍで満たず。右取機を回し
、ゆ−ノくりと１ｍｌ八か完全にＩンｉ解４゛るまで回
転を続ける。

７、晶型の純度、及び分〕′ｕか得られる迄、上記２−
６の操作を経つ返す。

８、粘度を減少させ、高分子量及び狭い分子量分布を維
持するために、熱処理を実施４°る。

ａ、１ｍｌ八濃度約１．２２６の請製１ｍｌ＾又はＮａ
１ｌ溶液を外套付き、そして高粘度溶液の撹 拌が可能なｈＬ拌機の有する容器に入れる。

ｂ、　好ましくは５５ないし６５℃になるように加熱３
制御する。

Ｃ０蒸発に・′ノれて、必要なたり注射水と添加し、ｒ
刀めの址を維持する。

ｄ、粘度があらかじめ設定した水準にＺ’ｌ達する、或
は１７かる迄、好ましくは１５０ｃ／ｓ以下になるまで
測定する。

９、熱処理役得られる薗剤は低粘度、高分子量で、狭い
分子量分布と、そして超高純度と有する。量刑は光、及
び熱に対しても安定である。

１０、最終製品にするために、９に述べたＩＩＡ剤を滅
菌する。好ましくは０，２２μンＩｌ過膜を通過させる
Ｊ１過滅菌で行う。加熱滅菌も可能である。

この実施例に従って製造した製品は、室温でＪえ期間（
数箇月）光りに曝してから、そして少なくとも５０℃の
温度に長期間（１２箇月）曝してから、試験を＃呆り返
した。分ｊ′り及び％へＩは処理後安定てあった。

この製品は、分析試験及びｉｎ　ｖｉνＯ評価の双方で
抗体フリーであることが判った。馬及び先の高度免疫法
（ｔ＋ｙｐｅｒｉ＋ｓｍｕ旧ｚａＬｉｏｎ）では、Ｗｅ
ｓｔ（！　ｒ　ｏ　’ｌ°ｒｕｎｓｂｌｏＬ’、：気泳
動法によ−）で検出てきる抗体は范生しなかった。ｌ東
Ｑｔ　％水性緩祉曽容？（ｉを：ｌ　１ｍｌ１ｍｌ　７
　Ｌ１間隔て、兎には０．５＋ｎｌ、馬には２．０＋ｎ
ｌ宛筋肉内注射を行った。皮膚反応試験のようなＡｒＬ
ｂｕｓ現象が兎の高度免疫法で起こり、更に上（の静脈
にマクロファージ感応性染料を注射し、その？哀この１
ｍｌ＾溶液を腹腔自注！１ｍｌシ／、：ところ員の語用
、即ち免疫反応は起こらなかった。。

ナトリウムｊムの１！ＩＣ１４Ｉ−％桜彷水溶ｌｌｋ２
ｍｌを馬の１ｍｌ；！足根骨関節、又は撓手恨骨関節の
と’：Ｊ　Ｉ”Ｊかにｌ」射したが、桜＆溶奴だｉＪを
注射した場へ・と比較して関節の腫張は起こらず、・免
疫反応は見られなか−）な。ａ（１ｍｌ定結果を表５に
掲りた。１ｍｌ八を９．０ないし１０．０　ｍＨ／＋ｎ
ｉ＠む試ｉＥｌは全部ＷＦＩ中に溶解することは、注目
さるべきである。巻取りの結果、分−ｊ′：５及び粘度
は増入り−るが、熱処理後は粘度なけか減少する。それ
故、ＩＨ＋られる製品は品分１′−景で低粘度である。

品分子址、高粘度が！ピ・要な場合には、熱処理を省略
すれば良い。β−プロピオラクトン及びγ−線滅菌を用
いることができる。

本発明の好ましい方法を用いて、表６に挙げた仕様と有
する製品を製造することが出来る。

この表では本発明による製品をｌ’ｂａｒ＋５ａｃｉａ
社、及び５ＬｅｒｉｖｅＬ社から市販されている製品と
比較した。これによって製品ｔ’ｒ性が独特である屯が
立証された。

衣−」− Ｉｆ！１ｍｌ枯）（ト」乙とぶ８３つ≦襲り鷲喝を吋ま
Ｌ１力５−ン”ｆ　、ｉ”ニーｉｓｉ；　／＞　＊乍γ
−レヨ４−り串−←小−１ 加熱１ｍｌ：ｆ加熱面　加熱後熱処理加熱後１ｍｌ八　
６１ｍｌ度　分ｊ′延　粘Ｂｃｌ：Ｊ数　分イ、−先！
１）３　　　　　ｃ／Ｓ　　　　　　　　　　　　　　
ｃ／ｓ１　４４７５　２．０ｘｌＯ’　　１３４　　　
９　　１．８ｘｌＯ’２　　９２４　１．７ｘｌＯ’　
　（ｉ８　　　７　　１．８ｘｌＯ’Ｊ　　１：１８２
　１．９ｘｌＯＩ＋１８５　　２０’　　１．８ｘｌＯ
”衣−２ ｂ−川ｊ−ｌｉ’４−ＩＬＬ　−４Ａ’、’Ｕ皓」に！
」り」ＡＪｊ７Ｌ　、７１に、枯Ｅ　ｉ’−、ＣＩ、！
　ｊ及’５−越月苅刃伊Ｌ　　　髭准スｄ冗）、′　　
ｒ良！−〇−なし　　　　　　：１ｍｌ８　　　　１．
１ｘｌＯｂ３０°ＣＩ　Ｃｈｉ月　　　　　２９８　　
　　　１．２ｘｌＯ’４（ＦＣＩ　Ｃ！Ｊ月　　　　　
　　　２４８　　　　　　　１．１ｘ１０６５０℃ＩＣ
’、ｉＪＩ　　　　　　　１７５　　　　　１．１ｘ１
０６注ｌ：最初の処理は密１別容器中で実施２、仁収り
処理はしていない 艮」− 髄町割ｌ古ｊ゛°１に文する高温へ跋艷佐仕４１　　　
　粘度（ｃ／ｓ）　　　分子景なし　　　　　　４４７
５　　　　１．７ｘｌＯ’１２１℃３０分間　　　　４
５４　　　　１．８ｘ１０６１２１“０６０分間　　　
　　９６　　　　１．８ｘｌＯ’に４゜ なし　　　　　　１２２（ｉ　　　　　１．１ｘｌＯ’
真空ｌ濾過　　　　　９９８　　　　１．１ｘｌＯ’（
１，０フイルター） １、″Ｌ空ｄＩ過　　　　　５４２　　　　１．１ｘＬ
０６（０，４５フイルター） 真空ｌｊ１過　　　　　２７９　　　　１．１ｘｌＯ’
（０，２２７，ルター） １試↑１を巻取り法にかけて、ヒアルロン酸で典型的に
（Ｉ！、八りるらのから、分子ｉｆ／粘度の関係を装え
る。。

Ｖ ９謀ｉ　Ｊ（の側、吃 ｕＷ７　　　Ｌ　　ｐ　　Ｉｔ−れＩＩ、　　１２（ｘ
１０６タルトン）　　　（ｃ／ｓ）第１回巻取り１ｉｔ
１．２　　　　　　　（ｉ５５重回巻収り後　　　　　
１．９　　　　　　　１７０第３回巻取り後　　　　２
．０　　　　　　１ｍｌ２６熟処１！ｌ！後最終製品　
　　２．０　　　　　　９０２巻収９ｒ表の粘度は０．
５重−ｂｔ％水溶液を３７℃で測定、但し熱処理後は異
なる。

六−準 試験パテメーター　ロへｙＢＥＴｙ品　Ｐｂａｒｍａｃ
ｉａ　　５ＬｅｒｉｖｅＬ八ｌ　％　　　　　０．９　
　１．１　　　０，９９　　　　　０．９３１Ｖ−均分
子：よ　＞１．８　　　　１．９　　　　１．１（ｘｌ
Ｏ’５’Ａ）ン） 分子量分７１ｊ１．８−３．５ （ｘｌＯ１′ジルトシ） 粘度（ｃ／ｓ）　　＜１５０　　　　＞１０００　　　
　１５アミノ酸 （＋ａｇ／＋ａｌ）　　　　　　＜０．１　　　　　　
　　　０．３８　　　　　　　　　　０．４７核＾（

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、本質的に純粋で、光及び熱に対して安定で、ＦＰＬ
   Ｃで少なくとも約１，２００，０００ダルトンの平均分
   子量を有し、そのナトリウム塩１重量％水溶液が、３７
   ℃で約５００センチストークス未満の非可逆性粘度を有
   し、そして０．２２ミクロンのろ過器を通してろ過殺菌
   可能なヒアルロン酸、又はその塩。 ２、光及び熱に対して安定で、 ａ）ＦＰＬＣによって測定された平均分子量が少なくと
   も１．２ｘ１０＾６ダルトンであり、ｂ）分子量分布が
   分子量約１．２ｘ１０＾６ないし４．０ｘ１０＾６の間
   に少なくとも９８％が入る本質的に単一で対称なＦＰＬ
   Ｃ分布ビークを有し、 ｃ）そのナトリウ塩１重量％水溶液の３７℃での粘度が
   約５００ｃ／ｓ未満であり、 ｄ）細孔径が０．２２ミクロンのろ過器を用いてろ過殺
   菌が可能であり、 ｅ）紫外線吸収による蛋白質含量が１ｍｌ当たり約１．
   ２５ｍｇ以下で、核酸合量が１ｍｌ当たり４５μｇ以下
   であり、そして ｆ）そのナトリウム塩１重量％水溶液２ｍｌを馬の脛骨
   足根骨関節又は撓骨手根骨関節に注射して、注射後の腫
   張を評価して、実質的に免疫反応が見られない、 事によって特徴づけられるヒアルロン酸又はその塩。 ３、ヒアロイン酸又はその塩を含有する組成物の製法で
   あって下記の段階、即ち ａ）ヒアルロン酸又はその塩を原料、例えば発酵製品、
   雄鶏のとさか又は、臍帯から得、 ｂ）分子量を少なくとも約１，３００，０００にまで増
   加させるために、特定のワインダーを使用して、ＨＡを
   沈澱させ、 ｃ）段階ｂ）の生成物を、実質的に分子量を下げる事な
   く、その粘度を非可逆的に約５００ｃ／ｓ未満に下げる
   ような条件下に加熱する、 事からなることを特徴とするヒアルロン酸又はその塩か
   ら成る粗製物の製造法。 ４、生成物を少なくとも、５０℃に加熱することを特徴
   とする、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、段階ｂ）の分子量が少なくとも約２，５００，００
   ０であり、加熱が、少なくとも５０℃で少なくとも７２
   時間行われ且つ約１５０ｃ／ｓ未満の粘度に減少するよ
   うな条件下で行われる、 の段階を有する方法である事を特徴とする特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 ６、下記の段階、即ち ａ）発酵製品、またはその他の原料からヒアルロン酸、
   またはその塩を得、 ｂ）段階ａ）のＨＡを、分子量を少なくとも１，８００
   ，０００まで増加させるために、特定のワインダーを使
   用して沈澱させ、 ｃ）段階ｂ）の生成物を、平均細孔径約１ミクロン又は
   それ以下のろ過器を使用して、約５００ｃ／ｓ以下の粘
   度を確実にするような、条件下にろ過する、 からなるヒアルロン酸又はその塩を含有して成る組成物
   の製造法。 ７、段階ｂ）のろ過器が約０．５μ未満の平均細孔径を
   有する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、それに析洗濯物が付着できる連続移動する装置を含
   む非溶媒凝固浴中へヒアロイン酸又はその塩を沈澱させ
   る事を特徴とする、ヒアルロン酸又はその塩の分子量分
   布を狭くし、そして分子量を大きくする方法。 ９、沈澱物を再溶解し、そして処理して、そのナトリウ
   ム塩の１重量％水溶液の室温で測定した粘度を約５００
   ｃ／ｓ未満に減少させることを特徴とする、特許請求の
   範囲第８項記載の方法。 １０、ＦＰＬＣで測定した分子量が、少なくとも１．１
   ｘ１０＾６ダルトンであり、１重量％の塩水溶液の粘度
   が３７℃で約５００ｃ／ｓを超える該材料の溶液を、分
   子量に実質的に影響なくして、粘度を十分下げられる温
   度で加熱することを特徴とする高分子量ヒアルロン酸又
   はその塩の粘度減少法。