JPS62297A - 多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は液体試料中の加水分解酵素の活性を測定するた
めの一体型多層分析要素に関するものである。更に詳し
くは本発明は生体液例えば血液、尿、唾液、膵液、腸液
、髄液中に含まれる加水分解酵素例えばプロテアーゼ、
アミラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ等の活性を簡易か
つ高精度に測定するのに適した一体型多層分析要素に関
するものである。

〔発明の背景」 生体液中の成分の分析には多種多様な方法が提案されて
いる。その内でも、試料溶液中において、分析しようと
する被検物質（アナライト）の量に比例した着色物質の
生成反応を進行させ、その色濃度を測定する方法は良く
知られた分析原理であり、溶液分析法（湿式法）として
のみでなく、乾式分析法にも利用されている。即ち、濾
紙等の吸収性単体に、アナライトとの接触により呈色す
る試薬を含浸させた、いわゆるｐＨ試験紙類似の形状を
した乾式の分析用シートがその例でおる。

またさらに、乾式操作を利用しながらも精度の高いアナ
ライトの定量分析を可能とする一層若しくは多層構造か
らなるシート状若しくはフィルム状の分析要素も知られ
ている。

このうち多層分析要素は、各種のものが知られており、
例えば特公昭ｌター３３１００号、特開昭≠ターｒ３ｒ
ｒｒ号、特開昭ｊｏ−ｉｓ７ｉｙコ号、特開昭！ｌ−≠
０／り７号、特開昭！２−３≠ｒｒ号、特開昭よ３−１
ｒり７り３号、特開昭ｊ３−／Ｊ１０１ｒり号などの各
公報には、支持体上に非繊維質多孔性展開層が積層され
た構成からなる多層分析要素が開示されている。

これらの多層分析要素においては、その展開層にアナラ
イトを含有する水性液体試料を点着すると水性液体試料
は、単位面積当たり均一な量を維持しながら試薬層中に
侵入し、発色反応を起こす。

そして、一定時間後にその色濃度を測定することにより
、水性液体試料中のアナライトの濃度を知ることができ
る。

上記多層分析要素を利用する分析のアナライトの代表的
な例としては、生体液、例えば血液、尿、唾液、膵液、
腸液、髄液などの中に含有されている各種の加水分解酵
素を挙けることができる。

上記加水分解酵素としては各１各様のものが知られてい
るが、多層分析要素は、その内でも高分子量の化合物を
基質とし、加水分解反応によって拡散性の低分子量化合
物を生成する酵素の分析に特に有用である。これらの加
水分解酵素の定量的分析は、臨床検査項目として重要で
あり、簡便かつ精度の高い分析方法の開発の要求が高い
。これらの加水分解酵素の例としては、プロテアーゼ、
アミラーゼ、リパーゼ、（例、トリプシン、キモトリプ
シン、ペプシンなど）、ペクチナーゼ及び各種キナーゼ
が挙げられる。

例えば、血液中に存在するアミラーゼの量の測定は、膵
機能の検査手段として臨床上極めて重要である。アミラ
ーゼは、デンプンなどのアミロース結合部分を加水分解
し、低分子量の多糖類、少糖類または単糖類を生成する
性質を有する酵素である。通常その性質、即ち酵素活性
を測定する方法により、存在量、試料液中の濃度の相対
値を算出する方法が一般的である。

従来公知のアミラーゼ活性の測定は、アミラーゼの基質
、例えばデンプン等の基質を含有する試料液を添加し、
一定条件下に一定時間反応させたのち、残存する未反応
基質或いは加水分解１ｃ、ｃつて生成した低分子量の反
応生成物と、予め加えられていた高分子量基質との量比
から、酵素活性を算出する方法によるものが通例である
。

前記の特開昭ｒ３−ｉ３ｉｏ了り号公報には著しく簡単
な操作によりアミラーゼ活性が測定できる乾式の多層分
析材料（分析要素）が記載されている。この多層分析要
素は、アミラーゼの基質、例えば、デンプンに染料のよ
うな予め検出可能な発色団を結合させた非拡散基質を含
む試薬層と、アナライト即ちアミラーゼの加水分解作用
によって拡散性となった反応生成物を受容するためのレ
ジストレイジョン層とを含む積層型の多層分析要素であ
る。この多層分析要素を用いてアミラーゼ活性を分析す
る方法では、まず、予め検出可能な発色団（染料など）
が結合された非拡散性基質が、試料液の酵素の作用によ
り加水分解され、これにより発色団を有する拡散性の低
分子量化合物が生成する。この低分子量化合物は層中を
拡散し、ついにはレジストレイジョン層に受容され固定
されるので、レジスト７４７３２層中に受容された発色
団を有する拡散性の低分子量化合物のｔｖｃ対応する色
濃度を測光定量する操作により反応生成物の量を測定す
ることができる。

前記特開昭ｊ／−ｕＯ／り７号公報は、上記特開昭ｊ　
Ｊ　−／　Ｊ　−／　Ｏｒ　９号公報に開示の分析要素
に類似の層構成を有する分析要素が開示されている。前
者は、検出層で検知される手段では本来検知できない化
学種を反応試薬層に用意し、これをアナライトの作用に
より、反応試薬層において、拡散性でかつ検知可能な化
学種に変換し、これを検出層で検出する過程を含むのに
対し、後者においては、反応試薬層中に予め検知可能な
化学種を含有させておくという相違がある。

これらの技術ＶＣあっては、検出層あるいはレジストレ
イジョン層は拡散性化字種の単なる受容をその目的とし
ており、その層内における発色反応などは想定されてい
ない。従って、反応試薬層中に残存或いは生成した検知
可能な化学種と、検出層或いはレジストレイジョン層中
に捕捉或いは受容された化学種とを明確に識別し、定量
性のある測定結果を得るためには、両層の間に色遮蔽全
目的とした光散乱性の放射ブロッキング層を設けること
が必須であった。

特開昭ｊ７−≠ｏｔｔｉり号公報には、上記の欠点を改
善した多層分析要素が記載されている。この多層分析要
素にあっては、そこに用意された基質層に含有されてい
る基質とアナライトの反応により生成する拡散性化合物
は実質的に無色であり、そして、この拡散性化合物が、
分析要素内に予め含有されていた色原体と反応し、これ
により初めて色素が形成される。この色原体は通常、基
質層に積層されて設けられている呈色層に含有された状
態で多層分析要素に予め導入されている。従って、アナ
ライトの作用を受ける前と後における基質と生成物を光
学的に識別することは極めて容易であるという特徴を有
するものである。ところが、上記開示技術において、拡
散性化合物との反応により色素を形成する色原体化合物
としてジアゾニウム化合物を使用した場合には、ジアゾ
ニウム化合物の安定性が悪く、また分解反応や望ましく
ない種々の副反応を起こすことがあるため、これにより
分析の定量性が低下する傾向があることが判明した。

〔発明の要旨〕

本発明者は生体試料中の加水分解酵素を分析するための
一体型多層分析要素における上記諸問題の解決を図り、
本発明に到達した。

本発明の目的は経時安定性が高く、分析の定量性にすぐ
れ九加水分解酵素分析用の一体型多層分析要素を提供す
ることである。

本発明は光透過性・水平透過性支持体の上に呈色層と基
質層が積層されてなる多層分析要素において、ａ）アナ
ライトの作用によりｐＨ変化によって色調変化するｐＨ
変色薬を有する拡散性化合物を生成しうる非拡散性基質
を含んでなる基質層、及び、ｂ）基質層と比較してｐＨ
単位で／、！以上具なるｐＨにに設定する非拡散性のｐ
）Ｉ緩衝剤を含んでなる呈色層よりなることを特徴とす
る加水分解酵素分析用の一体型多層分析要素を提供する
ものである。

〔発明の効果〕

本発明の多層分析要素は乾式であるため測定操作が極め
て簡便であり、測定経験の少ない人でも極めて高い精度
で測定できる。

本発明の多層分析要素はジアゾニウム塩を含有していな
いため、経時保存にすぐれており、長期間にわたって再
現性の良い測定結果が得られる。

〔発明の詳細な説明〕

本発明の多層分析要素は光透過性・水平透過性支持体の
上に呈色層と基質層とを順に積層してなる基本構成を有
するものである。

光透過性・水平透過性支持体（以下、支持体と略す）の
具体例としては、ポリ°エチレンテレフタレート、ビス
フェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、セル
ロースエステル（例えばセルロースジアセテート、セル
ローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオ
ネート等）等のポリマーからなる厚さ約ｊＯμｍから約
／ｆｌ、好ましくは約１０μｍから約３００μｍの範囲
の透明で水を実質的に透過させない支持体を挙げること
ができる。

支持体表面には必要により下塗層を設けて支持体の上に
設けらｎる呈色層と支持体との接着を強固なものにする
ことができる。また、下塗層の代わりに、支持体の表面
を物理的あるいは化学的な活性化処理を施して接着力の
向上を図ってもよい。

支持体の上には（場合によっては下ａ層等の他の層を介
して）呈色層が設けられる。

本発明の一体型多層分析要素を構成する呈色層は基質層
とｐＨ単位で１．ｊ以上異なるｐＨに設定し得る非拡散
性の高分子物質をポリマーバインダーに分散してなる層
である。

呈色層では検体中のアナライトの作用により基質層中の
基質が加水分解さｎ、その分解生成物が該呈色層に浸透
し、該層のｐＨによって著しく色調変化を生ずる。

呈色層に用いられるポリマーとしては水を吸収して膨潤
する性質を有する親水性ポリマーであることが好ましい
。親水性ポリマーの例としては、ゼラテ／（酸処理ゼラ
チン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル
化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン
等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリア
クリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン等を挙げることができる。

呈色層の乾燥膜厚は約−〜ｉｏｏμｍの範囲、好ましく
は約ｊ〜３０μｍの範囲である。また呈色層は実質的に
透明であることが好ましい。

本発明の分析要素は呈色層が非拡散性のｐＨ緩衝物質を
含有することを特徴としている。設定するｐＨは基質に
結合してｐＨ変化によって色調変化する物質（以下ｐ）
（変色薬と称する）の色調変化のｐＨ依存性による。

第１のグループではｐＨをり以上に設定し、第２のグル
ープではｐＨをμ以下に設定する。ＰＨを設定する物質
としては非拡散性の物質を用いることにより隣接層のｐ
ｌ（に影響を及ぼすことなく呈色層を目的のｐＨに設定
することができる。

第１のグループのｐＨをり以上に設定する物質としては
塩基性重合体が挙げられる。塩基性重合体の具体例は以
下に述べる式（１）〜（Ｖｌ）で表される繰りかえし単
位を有する塩基性重合体である。

＋ＣＨ２ＣＨ２ＮＨナー　　　　　　　　　（１）夏 −に：Ｈ２−Ｃ−→−（Ｉｆ） 〔式（ｎｕ：おいて Ｒ１は水素原子またはメチル基である：Ｒ２、Ｒ３は水
素原子または炭素原子数／〜≠のアルキル基である； Ｘは酸素原子または−ＮＨ−である； ｎは０．／、λ、３−または弘である〕上記式（ＩＩ）
で表される繰りかえし単位のうち、アミド類（Ｘが−Ｎ
Ｈ−）であるものは特開昭≠１−６３７１３号公報に記
載きｎでいるものである。

上記式（ｎ）で表される繰りかえし単位として用いる事
ができる具体的化合物例としては、〔（ジメチルアミノ
）エチルコアクリレート。

〔（ジメチルアミノ）エチル〕メタクリレート、〔（ジ
エチルアミノ）エチルコアクリレート、Ｎ−〔（ジメチ
ルアミノ）プロピルコアクリルアミ　　ド Ｎ−〔（ジエチルアミノ）プロピルコアクリルアミ　ド
、及び Ｎ−〔（ジメチルアミノ）エチルコアクリルアミド 等を挙げることができる。

−４−ＣＦ（２−Ｃ−＋−（ＩＩＩ） 〔式（１）において、 Ｒは水素原子またはメチル基である； Ｘは酸素原子または−ＮＨ−である； ｎは０．／、コ、３または参である〕 −＋ＣＨ２−Ｃ十（ＩＶ　） ｌ Ｘ（ＣＨ２）ｎＱ 〔式（［１）において、 Ｒ１は水素原子またはメチル基である；ＸＶｉ、酸素原
子または−ＮＨ−である；ｎｆ′ｉｏ、／、２．３また
は≠である〕Ｑは 複素環基である； Ｒ２は水５に原子または炭素原子数〜μのアルキル基で
ある〕 一←ＣＨ２−Ｃ→−（Ｖ） 〔式（Ｖ）において、 Ｒ１ハ水素原子またはメチル基である；Ｒ２は水素原子
または炭素原子数ｌ−≠のアルキル基である〕 上記式（Ｖ）で表される繰りかえし単位として用いるこ
とができる具体的化合物例としては、ｌ−アクリロイル
−≠−メチルビはラジン、ｌ−メタクリロイル−≠−メ
チルビペラジン、ｌ−アクリロイル−≠−エチルピペラ
ジン、ｌ−メタクリロイル−≠−エチルピペラジン、ｌ
−アクリロイル−≠−プロピルピペラジン、ｌ−メタク
ＩＪロイルー弘−プロビルピぼ２ジン、ｌ−アクリロイ
ル−≠−ブチルピペラジン、および ／−メタクリロイル−≠−ブチルビはラジン等が挙げら
れる。

一叶ＣＨｚ　　Ｃ−）−（Ｖｌ　） ！ 〔式（Ｍ）において、 Ｒ１は水素原子またはメチル基である；Ｘは酸素原子ま
たは−ＮＨ−である； Ｚはアニオンである： ｍは０または／である〕 上記式（Ｖｌ）で表される繰りかえし単位のうち、アミ
ド類（Ｘが−Ｎｕ−ｔ−）であるものは特開昭≠ター３
２ｔＪｊ号公報に記載されているものである。

上記式（１）〜（■）のいずれかの式で表される繰りか
えし単位を含有する重合体は単独重合体であってもよく
、共重合体であってもよい。共重合体としては、上記式
（Ｉ）〜（Ｖｌ）のいずれかの式で表さ扛る繰りかえし
単位のもからなる共重合体であってもよいし、他のモノ
マーとの共重合体でろってもよい。他の七ツマ−との共
重合体を作製する場合は、上記繰りかえし単位を少なく
とも３０モルチ含有させることが好ましい。共重合体に
用いられる他のモノマーとしては、アクリルアミド、メ
タクリルアミド、 ジアセトンアクリルアミド、 ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、 Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、 Ｎ−メチロールアクリルアミド、 アクリル酸（メタクリル酸）エステル類、ステレ／、酢
酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニルピロリド／、
アクリルアミン、およびグリシジルアクリレート（メタ
クリレート）等を挙げることができる。

本発明に用いられる塩基性重合体は「高分子合成法１ｊ
　（オーヴアーグアーガー（Ｃ，Ｇ。

Ｏｖｅｒｖｅｒｇｅｒ　　）編、湊宏訳、東京化学同人
、ｌりｔｒ年発行）あるいは「高分子合成の実験法」（
大津随行、木下雅悦共著、東京化学同人、ｌり７２年発
行）を参考にすれば容易に合成することができる。

塩基性重合体の分子量の範囲としては、分子量が低すぎ
ると重合体自身が拡散する恐れがあり、他方高すぎるも
のは親水性コロイドとの相溶性が悪くなることを考慮し
て、各重合体の種類に応じて決定する。一般には７％食
塩水を用いて３００Ｃで測定した極限粘度が０．／−ｊ
、０程度、好ましくは０，３〜２．、！程度の値となる
塩基性重合体を用いることが好ましい。

また呈色層における塩基性重合体の含有量の範囲は、含
有量が少なすぎると本発明の効果が不充分となる恐れが
アリ、他方多すぎるものは検出層を形成する塗布液にお
ける親水性ポリマーとの相溶性が悪くなることを考慮し
て決定する。一般には呈色層を構成するポリマーバイン
ダーに対して乾燥重量で約λ〜≠Ｏチの範囲、好ましく
は約ｊ〜３０％の範囲である。

第一のグループのｐＨをｊ以下に設定する物質としては
酸性重合体が挙げられる。酸性重合体としては高分子カ
ルボン酸、高分子スルホン酸、カルボン酸スルホン酸共
重会体が挙げられる。

高分子カルボン酸としては、ポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、アクリル酸共重合体、メタクリル酸共重付体
、マレイン酸共重合体が挙げられる。高分子スルホン酸
としてはポリスチレンスルホン酸、ホ＋）エチレンスル
ホン酸、スチレンスルホン酸共重奮体、ビニルスルホン
酸共重合体が挙げられる。

カルボン散単位、スルホン酸単位の含有量は約！〜１０
０モルチ、好ましくは３０〜１００モル−〇範囲である
。分子量は約３万〜ｉｏｏ万の範囲が好ましい。

酸性重合体の具体例として ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、 メチルビニルエーテルマレイン酸共重合体（／：／） メタクリル酸−アクリル酸共重合体（／：／）ポリスチ
レンスルホン酸 ポリエチレンスルホン酸 スチレン−マレイン酸共重合体（／：／）２−アクリル
アミド−λ−メチルプロパンスルホン酸重合体及びそれ
を含む共重合体 を挙げることができる。

呈色層の上に積層される基質層は、実質的に無色で、ｐ
）Ｉ変化によって色調変化するｐＨ変色薬を有し、アナ
ライトの作用により水の存在下に拡散しうる拡散性化合
物を生成することができる非拡散性ｐＨ変色薬を親水性
バインダー中に分散した層である。

本発明の要素に用いられる非拡散性基質とは分析の目的
となるアナライトの作゛用により、分子の大きさ、形状
、解離度などの物性が著しく変化し、結果として、多層
分析要素の親水性バインダ一層中での拡散性が著しく増
大する物質をいう二非拡散性基質の具体例は生体液中に
含まれる各種酵素の基質が挙げられる。これらのうち本
発明の多層分析要素が特に有効に適用できるのは、加水
分解酵素であって、その具体例としては、プロテアーゼ
、アミラーゼ、リパーゼ及びペクチナーゼが挙げられる
。これらの加水分解酵素をアナライトとする場合、本発
明に用いられる非拡散性基質としてはそれぞれの加水分
解酵素の基質、即ち蛋白質、アミロース、グリセリドま
たはペクチンに実質的に無色のｐＨ変色薬を結合させた
ものが用いられる。

ＰＨ変変色上基質層のｐＨでは実質的に無色で、呈色層
のｐＨで呈色するものが好ましいが、基質層のｐＨで着
色していても、呈色層のｐＨで明瞭に識別可能な色調変
化するものも用いることができる。

ｐＨ変化によって色調変化する変色薬としてはｐＨ指示
薬が良く知られている。

変色薬の第一のグループはアルカリ性で色調変化するも
のであり、具体例として、 フェノールフタレイン、 チモールフタレイン、 Ｏ−クレゾールフタレイン、 チモールブルー、 ニュートラルレッド、 フェノールレッド クレゾールレッド ブロムフェノールブルー、 ブロムチモールブルー ｐ−キシレノールブルー、 メタクレゾールパープル、 ブロムクレゾールパープル が挙げられる。

第二のグループは酸性で色調変化するもので、トリフェ
ニルメタン系染料、 スピロピラン系染料、 キサンチン系染料、 フルオラン系染料 等のロイコ染料があり、特に感圧紙で用いているロイコ
染料がよく、その具体例として ｌ−メチルアミノーｔージエチルアミノフルオラン、 λ−エチルアミノ−６−シエチルアミノフルオラン、 λージメチルアミノー２ーメチルアミノフルオラン、 λージメチルアミノーを一エチルアミノフルオラン が挙げられる。

第１のグループで挙げた変色薬の中で次のものは第２の
グループとしても用いることができる。

チモールブルー、 ｐ−キシレノールブルー、 メタクレゾールノ（−ブルー 基質層に含有されるｐＨ変色薬を結合した基質はアナラ
イトの作用によらないで呈色層へ拡散することは、アナ
ライトの作用によらない呈色、即ち「かぶり」を生ずる
ことを意味し、分析性能を低下させるので、確実にこれ
全防止しなければならない。

目的に応じて選択されたｐＨ変色薬を非拡散性基質に結
合させる方法は、染料業界で広く用いられている「反応
性染料」の技術が用いらｎる。

染料業界では各種天然繊維に染料化置物を物理的に吸着
させるか、或いは化学結合を形成させてより好ましい染
料状Ｂｋ得ている。この時用いられる染料が反応性染料
であり、ヴエンカタラマ／編（Ｋ．Ｖｅｎｋａｔａｒａ
ｍａｎ　　編）［合成染料化学（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｄｙｅｓ）Ｊ
第■巻にューヨーク，アカデミツクプレス社・（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　　／７７２年発行）にこの
反応性染料が詳しく述べられている。特に天然高分子で
ある多種類のセルロースや蛋白質繊維である羊毛、絹等
の分子と染料分子を結合する「連結基」については詳し
く記載されており、本発明に用いる非拡散性基賃金製造
するためにこ扛らの技術を用いることができる。即ち、
この連結基を利用して，Ｈ変色薬と非拡散性基質とを結
合し、本発明に有益な化合物を得ることができる。Ｐ　
Ｈ変色薬の基質への結合量は少ないと加水分解作用の加
水分解作用により生成するｐＨ変色薬の量が少なく検出
の鋭敏性が損なわれる。結合量が多い程検出の鋭敏性は
高くなるが、余り多くなると基質としての特性が損なわ
れる。ＰＨ変色薬をデンプンに結合する場合、デンプン
のグルコースよ〜１０Ｏ単位当たり７個の割合でｐＨｉ
色薬が結合していること、工９好−ましくけｉｏ−≠Ｏ
単位当たり１個の範囲である。

基質層を塗布にエリ形成する場合ｖｃは、基質を／ｆｎ
又は２種以上のポリマーからなるバインダー溶液中に溶
解又は分散した液を塗布、乾燥して用いる。しかしなが
ら、本発明の基質は基質自身高分子量であるのでバイン
ダーを用いずに塗布或いは含浸などの方法によっても形
成することができる。例えば、濾紙、不織布、織物生地
、編物生地、ガラス繊維濾紙、メンブランフィルタ−な
どに基質を含浸させるなどの前処理の後、呈色層上にラ
ミネート等の手段ＶＣよって積層することも可能である
。

この基質層に用いうる親水性バインダーのボリマーとし
ては各種の親水性バインダーがある。これらのうち本発
明に用いることができるものとして、七うチ／、アガロ
ース、アルギン酸ナトリウム、カルホキツメチルセルロ
ース、メチルセルロースなどの天然親水性高分子、ポリ
アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリヒドロキシ
エチルメタクリレート、アクリル酸を含むコポリマー、
マレイン酸を含むコポリマーなどの親水性合成高分子な
どがある。

これらのうちから、アナライトの特性、塗布特性などを
考慮して適当なバインダーを選択する。

例えば、プロテアーゼの分析材料用バインダーとしては
ゼラチンは不適当であり、主としてアガロースが用いら
れる。また、アナライトの分子量が大きい場合（例えば
、アミラーゼなど）には、アナライトの基質層への拡散
を実効あらしめるため、膨潤率の大きいバインダー、例
えば、ポリアクリルアミドを使用する必要がある。親水
性バインダーポリマーのうちで本発明の基質層のバイン
ダーとして特に適しているのはアガロース、ポリアクリ
ルアミド、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸を含
むコポリマーである。

基質層には非拡散性ｐＨ変色薬、親水性バインダーの他
、保存性などの諸性能の向上全目的として、界面活性剤
、ｐＨ調節用試薬、酸化防止剤、その他有機物或いは、
無機物からなる各種添加剤音訓えることができる。

基質層の膜厚は塗布層として設けるためには２〜ｊＯμ
ｍ程度、好ましくは、弘〜３０μｍの範囲が適当である
。ラミネートによる積層など塗布以外の方法による場合
の膜厚は、数十〜数百μｍの範囲で大きく変化し得る。

本発明の多層分析要素は、更に必要に応じて拡散防止、
試料の均一展開、光遮蔽、接着などを目的としたその他
の機能層を積層してなることができる。

拡散防止層の機能は、アナライトによる作用を受ける前
の非拡散性基質の他層−＼の拡散を完全に防止し、かつ
拡散性となった反応生成物（拡散性化合物）の拡散を妨
げないことにある。勿論、呈色層中の高分子ｐ）Ｔ緩衝
物質の基質層中への混入を防止する機能も有する。拡散
防止層に用いられる材料は基質層に用いられるものと同
様の親水性ポリマー類であゐ。こｎらのうち特に適当な
ポリマーは、ゼラチン、アガロース、ポリビニルアルコ
ールであって、こ扛らは非拡散性基質と生成物（拡散性
化合物）の間の拡散性の差を明確にするのに適した特性
を有している。拡散防止層中にも基質層に関して述べた
と同様各種の添加物を加えることができる。

拡散防止層はその機能から理解されるように、基質層と
呈色層との間に設けられ、通常的θ、！〜よμｍの厚さ
を有する。

本発明の多層分析要素は、基質層の上に展開層を設ける
ことができる。

本発明の展開層としては濾紙、不織布、織物生地、編物
生地、ガラス繊維濾紙、プラッシュポリマーにより形成
されるメンブランフィルタ−あるいはポリマーミクロビ
ーズ等からなる連続空隙含有多孔性層等を用いることが
好ましい。

展開層に用いることができる織物生地（織布）としては
、特開昭ｚｓ−ｉｔ≠３よ６号および特開昭３７−４ｔ
Ｊ！２号の各公報に開示の広範囲の種類の織物生地が挙
けられる。

織物生地のうちでは平織物が好ましく、絹布生地、全中
生地、ブロード生地、ボブリン生地等が好ましい。糸の
太さは２ｏＳ、１ｓｏＳ、好ましくは４ｃＯ８−／２０
Ｓ相当の範囲である。織物生地の厚さはｉｏｏ〜ｚｏｏ
μｍ、好１しくは７２０〜３１９μｍの範囲である。

編物生地としてはメリヤスが好ましく、−重アトラス編
生地、トリコット編生地、ダブルトリコット編生地、ラ
ッシェル編生地等を用いることができる。編物生地の糸
の太さはｌ１０Ｓ〜／　Ｊ−（１）Ｓ、好ましくはｔＯ
８〜／２０Ｓ相当の範囲である。

編物生地の厚さは１００−４００μｍ、好−ましくは／
ｊＯ〜≠００μｍの範囲である。

織物生地、編物生地を作る原糸としては綿、絹、羊毛等
の天然繊維の糸、ビスコースレーヨ／、キユプラ等の再
生セルロース、セルロースジアセテート、セルロースト
リアセテート等の半合成有機ポリマー、ポリアミド（ナ
イロン類）、アセタール化ポリビニルアルコール（ビニ
ロン等）、ポリアクリロニトリル、ポリエチレ／テレフ
タレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタ
ン等の合成有機ポリマーの細繊維からなる糸または単繊
維からなる糸、天然繊維と再生セルロース、半合成また
は合成有機ポリマー繊維との混合繊維からなる糸が挙げ
られる。

多孔性展開層に用いられる織物または編物生地は特開昭
ｊ７−ｊｊＪｊり号公報に開示の物理的活性化処理（好
ましくはグロー放電処理又はコロナ放電処理等）を生地
の少なくとも片面に施すか、或いは特開昭！ｊ−／６４
ｃ３ｊ６号、特開昭！７−６ｔ３ｊり号公報等に開示の
親水性ポリマー含浸等の親水化処理、又はこれらの処理
工程を逐次実施することにより織物生地又は編物生地を
親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接着力を強
化することができる。

織物又は編物生地からなる展開層を基質層又は接着層に
接着・積層するには特開昭！ｊ−／Ａ参３よ４号および
特開昭１７−４６３１９号公報等に開示の方法に従って
作製することができる。即ち、基質層又は接着層の塗布
機未乾燥のうちに、または乾燥後の層に水（または界面
活性剤を少量含む水）を実質的に均一に供給して層を膨
潤させ、ついで織物または編物生地を湿潤または膨潤し
ている層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながら接
着・積層して一体化する。

展開層がプラッシュポリマーまたはメ／ブラ／フィルタ
ーからなる場合には特公昭！Ｊ−２７６７７号公報等、
ポ゛リマーミクロビーズからなる三次元格子状構造物層
である場合には特開昭！ｊ−タｏｒｚり号公報等、濾紙
または不織布からなる場合には特開昭５７−／μｔ２！
０号公報等にそれぞれ記載の方法に従って設けることが
できる。

本発明の多層分析材料には基質層と呈色層の間に色遮蔽
層または光反射層を設けることができる。

さらに展開層と色遮蔽層または光反射層との間に展開層
を強固に接着する目的で液体試料透過性の接着層を設け
ることができる。

色遮蔽層または光反射層としては、ＴｉＯ２微粉末また
はＢ　ａ　Ｓ　０４微粉末等の白色微粉末を親水性バイ
ンダーポリマーに分散してなる厚さ約λ〜２０μｍの範
囲の層を設けることができる。

接着層としては、基質層、色遮蔽層または光反射層など
にバインダーとして用いられている液体試料透過性の親
水性ポリマーと同種のポリマーからなる厚さ約Ｏ１！〜
ｊμｍの範囲の層を設けることができる。親水性ポリマ
ー水溶液を基質層、色遮蔽層または光反射層の上に塗布
し、その後半乾きのときに、または乾燥後に接着層の表
面を水または界面活性剤を含む水で湿潤させておいて、
その表面に多孔質材料を接触させ、適尚な圧力をかけて
接着層に一様に積層することができる。また接着層の上
に多孔質層を形成しうる溶液または分散液を塗布するこ
とによっても展開層が強固に接着した多層分析要素をう
ろことができる。

本発明の要素を更に具体的、詳細に説明する為にアミラ
ーゼ活性測定用の多層分析要素を具体例として以下に詳
述する。本発明による多層分析要素の一夾施態様として
のアミラーゼ分析用多層分析要素は、アミラーゼの基質
であるアミロース結合を含む化合物、例えばデンゾ／に
ｐＨ変色薬を結合させた非拡散性基質と親水性バインダ
ーとからなる基質層、基質に結合したｐＨ変色薬をｐＨ
変化によって色調変化せしめる高分子ｐＨ緩衝剤からな
る呈色層と全透明なプラスチックフィルム上に積層塗布
した構成をしている。

デンプン分子は本来非常に大きく非拡散性であって、反
応前には呈色層の中へ拡散することはないので、ｐＨ変
色薬と高分子ｐＨ緩衝剤とは隔離された状態に保持され
ており、多層分析要素は実質的に無色である。アナライ
トたるアミラーゼを含む試料水溶液が基質層に付着する
とアミラーゼが水媒体と共に基質層に拡散、浸透する。

ついでアミラーゼの加水分解作用が進行し、デンプン分
子が切断され、低分子化されるに従い、層中の拡散性が
増加し、ｐ　［−１変色薬が結合した少糖類（拡散性化
合物）が呈色層中に拡散して行き、両層間のｐＨギャッ
プにより色調変化し、呈色する。アミラーゼの活性はデ
ンプンの加水分解速度に比例し、一方、色素形成速度は
呈色層中に拡散したｐＦ（ｆ色薬が結合した少糖類の量
に比例する。従って、一定時間内に形成され九色素の量
を測光することによって、アミラーゼ活性を知ることが
できる。

以上の如く、本発明の多層分析要素においては、色素形
成反応速度を測定し、これと予め既知量のアミラーゼを
用いて作成した検量線とから、被検液中のアミラーゼ活
性を測定する。この方法においては、被検液の適用前で
はほぼ無色であり、反応後に測光によって得られる光学
濃度値は、酵素反応の結果形成された色素量そのものに
比例する。

以下に本発明の実施例を示す。

〔塩基性重合体の合成法〕

攪拌装置金偏えたｊｌの反応容器に以下の組成の塩基性
重合体合成用溶液を入れ、窒素ガスを吹き込みながら、
ベルオキソニ硫酸カリウム／、０１を蒸留水２０ゴに溶
かしものを添加した。

塩基性重合体合成用溶液組成 Ｎ−〔（ジメチルアミノ） プロピルコアクリルアミド　　／１０　　Ｆ蒸留水　　
　　　　　　　　　　１００　　プイソプロビルアルコ
ール　　　　／！ＯＮ水酸化ナトリウム 水溶液（Ｏ，ｔＮ）　　　　　ｉｏ、Ａ　　ゴ上記溶液
の温度ｆＪ！−３０’Ｃに保ち、３時間攪拌を続けた。

反応終了後アセトニトリルを参ｌ加え、攪拌しながら温
度全−ｊ０Ｃまで下げた。

上澄みを除き蒸留水ｆ、３００ｍ１加え、沈降物を再溶
解し、再びアセトニトリルμｌ’ｒ加え、−１’ｃまで
下げ、ポリ−Ｎ−〔（ジメチルアミノ）プロピルコアク
リルアミド金沈降せしめた。蒸留水λ００ｙｔｌｆ加え
、攪拌したところ、均一液状物（溶液）７ｊ４ｆが得ら
れた。

生成した重合体量全算出するために、上記溶液２１をと
り、ｉｏｏ　０ｃで３時間熱風乾燥し、重合体の重量を
測定した結果、３６２〜であり、溶液中の重合体含有量
は、ｌＩｒ、／チとなった。また乾燥した重合体’に／
１の食塩水に溶解して溶液粘度を求めたところ、３０°
Ｃで０．２であった。

さらに生成した溶液のｐＨｅ測定したところ、１０、ｚ
の値が得られた。

〔ニュートラルレッド修飾デンプンの合成法、〕ｊ　０
０ｒｎｌの反応容器に塩化シアヌル２．ｊｆ、蒸留水ｊ
ａｔＡ’及びアセト７１０ｍ１ｆ加え、−１ｏ０ｃまで
冷却する。次に、ニュートラルレッド（３−アミノ−７
−シメチルアミンーコーメテルフエナジン塩酸塩）！、
！ｆ、蒸留水／２ｍｌ及び水酸化ナトリウムｉ、ｏｒか
らなる溶液を加え、−１００Ｃで３ｃ分攪拌し、更に室
温でλ時間攪拌全つずける。次いでアセトン２！Ｏａｔ
を加え、濾過、乾燥する。弘ｔ・の反応生成物を得た。

次に可溶性デンプン弘？、水酸化ナトリウム≠１を蒸留
水ｌ弘Ｏａｔで溶解し、上記反応生成物グ２を添加し、
室温でｉｏ時間攪拌する。

反応終了後アセトンで再沈澱して、上清液を除き、蒸留
水で再溶解し、ｐ　Ｈ７とし、凍結乾燥した。収量は弘
、３２゜ ニュートラルレッドのデンプンへの導入率はｊ３０ｎｍ
における吸光度を測定した結果、グルコース２０単位に
７個のニュートラルレッドが導入されていることが判っ
た。

〔λ−メチルアミノー６−ジニチルアミノフルオラン修
飾デンプンの合成法〕 ５００ｍ１の反応容器に塩化シアヌル≠、ｏｙ。

蒸留水ｊ　ｍｌ　、アセトンλＯゴを加え、−ｌｏ　０
ｃまで冷却して攪拌する。次に、−一メチルアミノ−６
−ヂエチルアミノフルオランｔ、ｏｙ、蒸留水２０ｍ１
、水酸化ナトリウム／、Ｏｆからなる溶液を加え、−１
００Ｃで３０分、室温で２時間攪拌する。次に、アセト
７２ｊＯｍｌｆ加え、生成物を濾過、乾燥する。収量ｔ
、λ２゜更に、デンプンと反応させるために、可溶性デ
ンプンよ？、水酸化ナトリウム参ｆを蒸留水ｌ弘０ｒｎ
ｌに溶解し、反応性フルオラン５２ｆｆ加え、室温でｉ
ｏ時間攪拌する。最後に過剰のアセトンを加えて沈澱せ
しめ、生成物を乾燥した。収量Ｊ、Ｊｔ。

反応率を測定するために得られたデンプン誘導体のＡＯ
Ｏｎｍにおける吸収を測・定し、デンプン３λユニット
当た９／分子のフルオランが導入されたことを確認した
。

（実施例１） （１）アミラーゼ活性測定用多層分析フィルムの作製 ゼラチン下塗りした無色透明ポリエチレンテレフタレー
ト（ＰＥＴ）フィルム（厚さ１ｌｒＯμＴｒＬ）の上に
呈色層（乾燥膜厚ｌλμｍ）、拡散防止層（乾燥膜厚λ
μｍ）および基質層（乾燥膜厚／コμｒｒＬ）ｔ−順次
塗布、乾燥により形成した。さらに上記二層を塗布した
面をｐ−ノニルフェノキシグリセリンＯ，コチ水溶液で
湿潤させた後、グロー放電により親水化処理したポリエ
ステルと綿の混紡布（ｉｏｏ番手の平織布；混紡比：ポ
リエチレンテレフタレート／綿＝７ｊ／２１）を圧着・
乾燥して展開層全形成させ、アミラーゼ測定用一体型多
層分析要素を作成した。

以下に呈色層、基質層の調製法を示す。

呈色層 精製水　　　　　　　　　　　　λ４ｃＯｍｌ脱イオン
ゼラチン　　　　　　　　２ｊ　１ポリ−Ｎ−〔（ジメ
チルアミノ） プロピルコアクリルアミド （塩基性重合体の合成法参照） （１０チ水溶液）　　　　　　　３ｏ　　ｙｐ−ノニル
フェノキシグリセリン （ｊチ水溶液）　　　　　　　　　ｉｔゼラチンを加熱
溶解し、溶液のｐＨｔ水酸化ナトリウムでｉｏ、ｏｖｒ
−調整し呈色層塗布液とじ九。

拡散防止層 精製水　　　　　　　　　　　　　　ｊｏ　ｄＴ　Ｉ　
Ｏ２微粉末　　　　　　　　　　ｔｏ　　ｙｐ−ノニル
フェノキシグリセリン （コ！チ水溶液）　　　　　　　ｏ、ｚｔ上記混合物を
完全にボールミル型粉砕機で粉砕し、次いでゼラチン１
０チ水溶液１００？をこれに添加しホモジナイザーで均
一に分散した。

基質層 ニュートラルレッド 修飾デンプン（合成法参照）　　　≠　ｔＨＥＰＥＳ（
Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ヒヘラシンーＮ’　−エタ
ンスルホン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　／、
！？精製水　　　　　　　　　　　　　≠２　ｄポリア
クリルアミド （ｊチ水溶液）　　　　　　　３２　ｔｐ−ノニルフェ
ノキシグリセリン （！チ水溶液）４′？ 上記混合液全溶解し、塗布液のｐＨ’に水酸化ナトリウ
ムで７．／に調整した。

（２）アミラーゼ活性の測定 ヒト膵アミラーゼｔ−７％ヒトアルブミ／生理食塩水で
段階的に希釈し、ブルースターチ法で測定したアミラー
ゼ活性が次の値のアミラーゼ標準液を作製した。

Ａ　　　タλ　ンモジ （Ｓｏｍｏｇｙｉ　）Ｕ／Ｉ％Ｉ Ｂ　　３り／ （：　　　１０１！４ｃ 塗布直後のフィルムと、４！Ｏ”ｃ７日間インクベート
したフィルムに、それぞれアミラーゼ標準液ｌＯμｌ全
点着し、ｊ７’ｃＡ分間インクベートシ、マクベス濃度
計を用いてｕ！Ｏｎｍの光で反射光学濃度全測定し、次
に示す結果を得た。

反射光学濃度値 上記結果から、本発明のアミラーゼ活性測定用フィルム
は、アミラーゼの活性に応じた発色性能を有しており、
また高温保存の場合であってもすぐれた安定性を示すこ
とが判った。

（実施例２） ｍ　　アミラーゼ活性測定用多層分析フィルムの作製 実施例１における呈色層および基質層を下記の処方に変
更した他は、実施例１と同様にしてアミラーゼ活性測定
用一体型多層分析フィルム全作製した。

呈色層 精製水　　　　　　　　　　　　／７１　　ｒｒｔｌポ
リビニルアルコール　　　　　　２０　　ｆポリアクリ
ル酸（２３％溶液）２０ｆ ｐ−ノニルフェノキ７グリセリン （ｊチ水溶液）　　　　　　　　よ　を塗布液のｐＨｔ
ｒｉ２．りであった。

基質層 λ−メチルアミノー２−ジエチル アミノフルオラン修飾デンプ／ （合成法参照）　　　　　　　≠　ｔ ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　／　、ｚｙ精製水
　　　　　　　　　　　　　≠２４ポリアクリルアミド （ｊチ水溶液）　　　　　　３２　ｔ ｐ−ノニルフェノキシグリセリン （ｊチ水溶液）　　　　　　　≠　１ 塗布液のｐＨを水酸化ナトリウムで７．／に調整した。

（２）アミラーゼ活性の測定 実施例１と同様にして次に示す結果全書た。なお、反射
光学測定はｊｌｌＯｎｍで行った。

反射光学濃度値 上記結果から、本発明のアミラーゼ活性測定用フィルム
は、アミラーゼの活性に応じた発色性能を有しており、
また高温保存の場合であってもすぐれた安定性金示すこ
とが判った。

特許出願人　富士写真フィルム株式会社手続補正書（方
側 昭和ｔｏ年ｉｏ月１Ｌｌ−日 １、事件の表示　　　　昭和ｔｏ年特願第１ＪＩ７７３
号２、発明の名称　　多層分析要素 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　　　特許出願人４、補正命令の
日付　昭和１０年２月２参日（発送日） ５、補正の対象　　明細書 ６、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし）を提出致します。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）光透過性・水平透過性支持体の上に呈色層と基質
   層がこの順に積層されてなる多層分析要素において、 ａ）被検物質の作用により、ｐＨ変化によって色調変化
   するｐＨ変色薬を有する拡散性化合物を生成しうる非拡
   散性基質を含んでなる基質層、および ｂ）基質層と比較してｐＨ単位で１．５以上異なるｐＨ
   に設定しうる非拡散性のｐＨ緩衝剤を含んでなる呈色層 であることを特徴とする多層分析要素。
2. （２）前記ｐＨ変色薬が高アルカリ側で変色するｐＨ指
   示薬であり、非拡散性のｐＨ緩衝剤が塩基性高分子であ
   る特許請求範囲第１項に記載の多層分析要素。
3. （３）前記ｐＨ変色薬が酸性側で変色するｐＨ指示薬ま
   たはフルオラン系ロイコ染料であり、非拡散性のｐＨ緩
   衝剤が高分子カルボン酸または高分子スルホン酸である
   特許請求の範囲第１項に記載の多層分析要素。
4. （４）アナライトがプロテアーゼ、アミラーゼ、リパー
   ゼ及びペクチナーゼから選ばれた一つである特許請求の
   範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の多層分析要
   素。
5. （５）前記非拡散性基質がデンプンであり、アナライト
   がアミラーゼである特許請求の範囲第１項ないし第３項
   のいずれかに記載の多層分析要素。