JPS6230752B2 - - Google Patents
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- JPS6230752B2 JPS6230752B2 JP59167324A JP16732484A JPS6230752B2 JP S6230752 B2 JPS6230752 B2 JP S6230752B2 JP 59167324 A JP59167324 A JP 59167324A JP 16732484 A JP16732484 A JP 16732484A JP S6230752 B2 JPS6230752 B2 JP S6230752B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
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Description
本発明はインフルエンザウイルスの精製方法、
さらに詳しくは、セルロースまたは架橋ポリサツ
カライドを硫酸エステル化して得られるセルロー
ス硫酸エステルまたは架橋ポリサツカライド硫酸
エステルを用いて、クロマトグラフイによりイン
フルエンザウイルスを高度に精製する方法に関す
る。 発明の技術的背景と産業上の利用分野 インフルエンザはひとたび流行するとその伝播
速度が極めて速く、大流行をおこすおそれのある
伝染病である。 古くは、1830年、1847年、1889年と十数年ごと
に世界的流行があり、特に1918〜1921年のいわゆ
る「スペインかぜ」と1957年の「アジアかぜ」が
最も大きな流行として知られている。特に「スペ
インかぜ」はマドリツドにおいてしようけつをき
わめて全世界において６憶人の患者と2000万人を
超す死者を出し、わが国においても患者数約2400
万人で死者39万人であつたと記録されている。 インフルエンザによるわが国での死亡率は、過
去20年間の統計によれば人口10万人に対し、0.3
〜8.5人程度であるが、インフルエンザの大流行
の際に合併症をおこして死亡する率はインフルエ
ンザを死因とする統計的数字の何倍かに達するも
のと推定される。 このような恐しい大流行をもたらすインフルエ
ンザの予防には、現在のところワクチンによる予
防接種以外に方法はない。この要請に応じ得るワ
クチンは、現在精製ウイルスをエーテルで処理し
脂質を除いたものが提供されている。しかし、構
成蛋白中の感染防御抗原であるHA
（Hemagglutinin）蛋白の割合は30％程度であ
り、また感染防御に補佐的に作用するといわれる
NA（Neuraminidase）蛋白は２〜３％程度であ
る。すなわち、HAおよびNAの２つの糖蛋白質
がインフルエンザウイルスの主免性成分であつ
て、他のウイルス蛋白、核酸および脂質を含む他
のすべての成分は免疫誘導に必須ではないといわ
れている。 このような非必須物質がインフルエンザワクチ
ンの中に存在すると、望ましくない副作用の原因
となり、ワクチンの投与量が制限され、達成され
る免疫レベルにも限界がある。 本発明はインフルエンザワクチンの製造に適し
た安全なインフルエンザウイルスの精製方法、殊
に、インフルエンザワクチンのうち特に感染防御
機能の高いインフルエンザウイルス表在抗原の新
規な精製方法を提供するものである。 従来技術 インフルエンザワクチンを製造するには、たと
えば、ふ化鶏卵にウイルスを接種培養して得た感
染尿膜腔液などから、まずインフルエンザウイル
スまたはその抗原を精製する必要がある。 現在、インフルエンザウイルスの最も一般的に
採用されている精製法の例は、下記ワクチン製造
工程図に示すように、低速遠心分離によつて得ら
れる上清を連続流入処理のできる蔗糖密度勾配遠
心法にかける方法である。
さらに詳しくは、セルロースまたは架橋ポリサツ
カライドを硫酸エステル化して得られるセルロー
ス硫酸エステルまたは架橋ポリサツカライド硫酸
エステルを用いて、クロマトグラフイによりイン
フルエンザウイルスを高度に精製する方法に関す
る。 発明の技術的背景と産業上の利用分野 インフルエンザはひとたび流行するとその伝播
速度が極めて速く、大流行をおこすおそれのある
伝染病である。 古くは、1830年、1847年、1889年と十数年ごと
に世界的流行があり、特に1918〜1921年のいわゆ
る「スペインかぜ」と1957年の「アジアかぜ」が
最も大きな流行として知られている。特に「スペ
インかぜ」はマドリツドにおいてしようけつをき
わめて全世界において６憶人の患者と2000万人を
超す死者を出し、わが国においても患者数約2400
万人で死者39万人であつたと記録されている。 インフルエンザによるわが国での死亡率は、過
去20年間の統計によれば人口10万人に対し、0.3
〜8.5人程度であるが、インフルエンザの大流行
の際に合併症をおこして死亡する率はインフルエ
ンザを死因とする統計的数字の何倍かに達するも
のと推定される。 このような恐しい大流行をもたらすインフルエ
ンザの予防には、現在のところワクチンによる予
防接種以外に方法はない。この要請に応じ得るワ
クチンは、現在精製ウイルスをエーテルで処理し
脂質を除いたものが提供されている。しかし、構
成蛋白中の感染防御抗原であるHA
（Hemagglutinin）蛋白の割合は30％程度であ
り、また感染防御に補佐的に作用するといわれる
NA（Neuraminidase）蛋白は２〜３％程度であ
る。すなわち、HAおよびNAの２つの糖蛋白質
がインフルエンザウイルスの主免性成分であつ
て、他のウイルス蛋白、核酸および脂質を含む他
のすべての成分は免疫誘導に必須ではないといわ
れている。 このような非必須物質がインフルエンザワクチ
ンの中に存在すると、望ましくない副作用の原因
となり、ワクチンの投与量が制限され、達成され
る免疫レベルにも限界がある。 本発明はインフルエンザワクチンの製造に適し
た安全なインフルエンザウイルスの精製方法、殊
に、インフルエンザワクチンのうち特に感染防御
機能の高いインフルエンザウイルス表在抗原の新
規な精製方法を提供するものである。 従来技術 インフルエンザワクチンを製造するには、たと
えば、ふ化鶏卵にウイルスを接種培養して得た感
染尿膜腔液などから、まずインフルエンザウイル
スまたはその抗原を精製する必要がある。 現在、インフルエンザウイルスの最も一般的に
採用されている精製法の例は、下記ワクチン製造
工程図に示すように、低速遠心分離によつて得ら
れる上清を連続流入処理のできる蔗糖密度勾配遠
心法にかける方法である。
【表】
最終バルク
↓
小分製品
しかしながら、尿膜腔液をそのまま密度勾配遠
心にかけると、密度勾配液層をこわしてしまう。
そのため、通常、原料の感染尿膜腔液を硫酸バリ
ウムで処理し、ウイルスを硫酸バリウムの表面で
吸着遊離して予備精製したウイルス液を密度勾配
遠心器にかけ精製する。この硫酸バリウム法によ
る予備精製は処理する尿膜腔液が大量であるため
操作が非常に煩雑であり、使用した後の硫酸バリ
ウムの処理が困難である。その他、限外過によ
る濃縮、高速遠心による分離精製法があるが、常
に十脂に余る工程を経なければならず、そのため
操作がきわめて煩雑で、大量処理には適していな
い。 発明の目的 本発明者等は、カラムクロマトグラフイまたは
バツチ法を用いて、より簡単に、より安価にイン
フルエンザウイルスおよびインフルエンザウイル
ス表在抗原を精製する方法を見い出すべく種々研
究を重ねた結果、一定重合度を有するセルロース
または架橋ポリサツカライド硫酸をエステル化し
て得られるセルロース硫酸エステルまたは架橋ポ
リサツカライド硫酸エステルがインフルエンザウ
イルスおよびインフルエンザウイルス表在抗原と
特異的に親和性を有することを見い出し、この知
見にもとづいて、これら硫酸エステル類のゲルを
用いて、感染尿膜腔液あるいは濃縮ウイルス液、
さらにはエーテル処理ワクチンを精製処理するこ
とにより、きわめて高い精製度かつ高収率で、し
かも、きわめて簡単に目的とする精製インフルエ
ンザウイルスや精製インフルエンザウイルス表在
抗原が得られることを知り、本発明を完成するに
至つた。すなわち、本発明はインフルエンザワク
チンの工業的な製造に有用なインフルエンザウイ
ルスおよびその表在抗原の改良精製法を提供する
ものであり、セルロース硫酸エステルゲルまたは
架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルを用い、
吸着クロマトグラフイによるインフルエンザウイ
ルスあるいはインフルエンザウイルス表在抗原の
高度精製法を提供するものである。 発明の構成および効果 本発明はインフルエンザウイルスおよびインフ
ルエンザウイルス表在抗原含有液、さらにウイル
スをエーテル等で処理したインフルエンザウイル
スならびにウイルス表在抗原含有液をクロマトグ
ラフイまたはバツチ法により、インフルエンザウ
イルスまたはインフルエンザウイルス表在抗原を
分離精製する方法において、クロマトグラフイ用
ゲルまたは吸着用ゲルとして、一定重合度を有す
るセルロースまたは架橋ポリサツカライドを硫酸
エステル化して得られるセルロース硫酸エステル
または架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用い
ることを特徴とする。本発明で用いられるセルロ
ース硫酸エステルは、セルロースを硫酸エステル
化して得られるのであるが、好ましくは結晶セル
ロースあるいは、結晶領域および非結晶領域から
なるセルロースを硫酸エステル化したものが良
い。この場合、得られたセルロース硫酸エステル
は原料の形状を保持し、物理的安定性にすぐれ、
クロマトグラフイ用ゲルまたは吸着用ゲルとして
好適である。これらの原料セルロース類はすでに
市販されており、例えばセルロフアインGC−
15、同GH−25、同GC−100、同GC−200（チツ
ソ社製）、アビセル（旭化成工業社製）などがあ
る。これらのゲルを例えばピリジンなどの有機溶
媒の存在下クロルスルホン酸、無水硫酸などを作
用させることにより所望のセルロース硫酸エステ
ルが得られる。 架橋ポリサツカライド硫酸エステルとは、デキ
ストラン、セルロース類、アガロースなどのポリ
サツカライドを、例えばエピクロルヒドリン、ジ
クロルヒドリン、ジブロムヒドリン、エチレング
リコールビスエポキシプロピルエーテル等の架橋
剤で架橋して得られる架橋ポリサツカライドを硫
酸エステル化して得られるものである。架橋ポリ
サツカライドはすでに市販されており、例えば架
橋デキストランとしてセフアデツクスＧ−10、Ｇ
−25、Ｇ−50、Ｇ−100（フアルマシア社製）な
どがあり、架橋アガロースとしてセフアロース
CL−2B、CL−4B、CL−6B（フアルマシア社
製）などがあり、架橋セルロースとしてセルロフ
アインGCL−25、GCL−90（チツソ社製）など
がある。これらのゲルを例えばピリジンなどの有
機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無水硫酸など
を作用させることにより所望の架橋ポリサツカラ
イド硫酸エステルが得られる。 これらのセルロース硫酸エステルまたは架橋ポ
リサツカライド硫酸エステルを用いてカラムクロ
マトグラフイによつてインフルエンザウイルスま
たはインフルエンザウイルス表在抗原を精製する
には通常のカラムクロマトグラフイで採用される
操作が適用されるが、例えばカラムに該セルロー
ス硫酸エステルまたは架橋ポリサツカライド硫酸
エステル（好ましくは球状粒子に成形したゲル）
を充填し、これをイオン強度が0.001〜2.0程度で
ある適当な緩衝液、例えば0.01Mリン酸緩衝食塩
水（PH7.4）、0.1M食塩を含むクエン酸緩衝液
（PH7.2）などで平衡化したのち、カラムにインフ
ルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス
表在抗原含有液を通してインフルエンザウイルス
またはインフルエンザウイルス表在抗原を吸着さ
せ、上記平衡化に用いた緩衝液またはそのイオン
強度が上記平衡化、洗浄時に用いた緩衝液のイオ
ン強度より大（イオン強度0.001〜5.0程度）であ
る適当な緩衝液（PH〜10）、例えば0.2M食塩を含
むリン酸緩衝液（PH６〜９）にて洗浄する。この
あと、イオン強度が平衡化または洗浄時に用いた
緩衝液のイオン強度よりも大である適当な緩衝
液、例えば1.0M食塩を含むリン酸緩衝液（PH６
〜９）、1.5M食塩を含むリン酸緩衝液（PH６〜
９）などにて溶出することにより、高度に精製さ
れたインフルエンザウイルスまたはインフルエン
ザウイルス表在抗原が得られる。本発明の精製法
によれば、用いるセルロース硫酸エステルまたは
架橋ポリサツカライド硫酸エステルはセルロース
または架橋ポリサツカライドのマトリツクスに直
接スルホン基が結合しており、このためスルホン
基含量も高く、インフルエンザウイルスまたはイ
ンフルエンザウイルス表在抗原の特異的吸着能に
すぐれ、その精製度は数倍〜数十倍に及び、しか
もインフルエンザウイルスまたはインフルエンザ
ウイルス表在抗原の回収率も良好である。 さらに、インフルエンザウイルスワクチンの精
製において、今後ワクチン中のHAとNAの比率
を高めることが要望されるが、本発明によるセル
ロース硫酸エステルまたは架橋ポリサツカライド
硫酸エステルを用いる方法では、条件の選択によ
りHAおよびNAの特異的吸着能にもすぐれてい
るため、インフルエンザウイルス表在抗原の濃縮
回収にも有用である。 本発明の精製法は、ヒトインフルエンザウイル
スのＡ型あるいはＢ型、さらにサブタイプのどの
ようなものにも適用できる。また、ウマ、ブタ、
ニワトリ、七面鳥、カモなどの動物や鳥類由来の
インフルエンザウイルスにも適用できる。しか
も、精製処理対象としても、インフルエンザウイ
ルス感染尿膜腔液または細胞培養液のみならず、
ワクチン製造工程におけるどの段階においても本
発明の精製処理を行なうことができ、一旦濃縮を
進めた濃縮液を対象とすることもできる。またイ
ンフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイ
ルス表在抗原は天然のもののみならず、遺伝子組
換え技術を利用した組換え体の培養物より得られ
るものであつても同様に適用でき、きわめて汎用
性のすぐれた精製方法である。 本発明の精製法はカラムクロマトグラフイのみ
ならずバツチ法にも同様に適用でき、工業的規模
においても簡単な操作で行ないうるうえ、特別の
高価な試薬も必要とせず、きわめて安価にインフ
ルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス
表在抗原の工業的精製を行なうことができ、ゲル
の安定性にもすぐれ、しかも得られる製品には従
来法におけるような抗原抗体反応物などの不純物
が混入する恐れのない利点を合わせ有する。本発
明の方法は従来の技術である超遠心分離あるいは
イオン交換クロマトグラフイと組み合わせること
も可能であり、その際は従来の結果に比して非常
にすぐれた結果を得ることができる。 実施例 つぎに参考例および実施例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。 参考例 １ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中に結
晶セルロースであるクロマトグラフイ用アビセル
（旭化成工業社製）80ｇを加え、攪拌下65〜70℃
にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、10％
水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲル
を過分離し、0.01Mリン酸緩食塩液で充分に洗
浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。 参考例 ２ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にセ
ルロフアインGC−15（チツソ社製）80ｇを加
え、攪拌下65〜70℃にて３時間保持する。反応終
了後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液を加
えて中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸
緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エス
テルゲルを得る。 参考例 ３ ０℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスＧ−50（フアルマシア社製）7.5ｇを加
え、攪拌下65〜70℃にて４時間保持する。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エ
ステルゲルを得る。 参考例 ４ 前記参考例３と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋セルロース
ゲルであるセルロフアインGCL−25（チツソ社
製）の乾燥物7.5ｇを加え、65〜70℃にて４時間
反応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリ
ウム水溶液を加えて中和する。ゲルを過分離
し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄して架
橋セルロース硫酸エステルゲル7.2ｇを得る。 参考例 ５ 前記参考例３と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋アガロース
ゲルであるセフアロースCL−6B（フアルマシア
社製）のピリジン包含体30mlを加え、65〜70℃に
て４時間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸
化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルを
過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
して架橋アガロース硫酸エステルゲル23mlを得
る。 実施例 １ 前記参考例２で得られたセルロース硫酸エステ
ルゲルをカラム（５cmφ×17cm）に充填し、これ
に0.14M塩化ナトリウムを含む0.010Mリン酸緩衝
液（PH7.4）を通液し平衡化する。このカラムに
11日令のふ化鶏卵に接種培養（34℃、48時間）し
たＡ／フイリピン（H3N2）タイプインフルエンザ
ウイルス感染尿膜腔液［ウイルス量77CCA
（chick cell agglutination＝鶏赤血球凝集反応に
より測定したウイルス量の単位）、蛋白質窒素量
377μｇ／ml（ローリー法）、比活性（CCA／
TCA−Ｎ）0.20（比活性とは、トリクロル酢酸
を用いて沈殿させた蛋白質窒素量を比色定量し、
その値（TCA−Ｎ）とウイルス量（CCA）との
比で蛋白質窒素量当りのウイルス（抗原）量を示
す）］4200mlを通液する。その後に0.19M塩化ナ
トリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液2500mlを通し
て洗浄する。ついで、1.49M塩化ナトリウムを含
む0.010Mリン酸緩衝液で溶出し、溶出画分170ml
を得る。その後、4.99M塩化ナトリウムを含む
0.01Mリン酸緩衝液でゲルを溶出洗浄する。 この結果を第１表に示す。
↓
小分製品
しかしながら、尿膜腔液をそのまま密度勾配遠
心にかけると、密度勾配液層をこわしてしまう。
そのため、通常、原料の感染尿膜腔液を硫酸バリ
ウムで処理し、ウイルスを硫酸バリウムの表面で
吸着遊離して予備精製したウイルス液を密度勾配
遠心器にかけ精製する。この硫酸バリウム法によ
る予備精製は処理する尿膜腔液が大量であるため
操作が非常に煩雑であり、使用した後の硫酸バリ
ウムの処理が困難である。その他、限外過によ
る濃縮、高速遠心による分離精製法があるが、常
に十脂に余る工程を経なければならず、そのため
操作がきわめて煩雑で、大量処理には適していな
い。 発明の目的 本発明者等は、カラムクロマトグラフイまたは
バツチ法を用いて、より簡単に、より安価にイン
フルエンザウイルスおよびインフルエンザウイル
ス表在抗原を精製する方法を見い出すべく種々研
究を重ねた結果、一定重合度を有するセルロース
または架橋ポリサツカライド硫酸をエステル化し
て得られるセルロース硫酸エステルまたは架橋ポ
リサツカライド硫酸エステルがインフルエンザウ
イルスおよびインフルエンザウイルス表在抗原と
特異的に親和性を有することを見い出し、この知
見にもとづいて、これら硫酸エステル類のゲルを
用いて、感染尿膜腔液あるいは濃縮ウイルス液、
さらにはエーテル処理ワクチンを精製処理するこ
とにより、きわめて高い精製度かつ高収率で、し
かも、きわめて簡単に目的とする精製インフルエ
ンザウイルスや精製インフルエンザウイルス表在
抗原が得られることを知り、本発明を完成するに
至つた。すなわち、本発明はインフルエンザワク
チンの工業的な製造に有用なインフルエンザウイ
ルスおよびその表在抗原の改良精製法を提供する
ものであり、セルロース硫酸エステルゲルまたは
架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルを用い、
吸着クロマトグラフイによるインフルエンザウイ
ルスあるいはインフルエンザウイルス表在抗原の
高度精製法を提供するものである。 発明の構成および効果 本発明はインフルエンザウイルスおよびインフ
ルエンザウイルス表在抗原含有液、さらにウイル
スをエーテル等で処理したインフルエンザウイル
スならびにウイルス表在抗原含有液をクロマトグ
ラフイまたはバツチ法により、インフルエンザウ
イルスまたはインフルエンザウイルス表在抗原を
分離精製する方法において、クロマトグラフイ用
ゲルまたは吸着用ゲルとして、一定重合度を有す
るセルロースまたは架橋ポリサツカライドを硫酸
エステル化して得られるセルロース硫酸エステル
または架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用い
ることを特徴とする。本発明で用いられるセルロ
ース硫酸エステルは、セルロースを硫酸エステル
化して得られるのであるが、好ましくは結晶セル
ロースあるいは、結晶領域および非結晶領域から
なるセルロースを硫酸エステル化したものが良
い。この場合、得られたセルロース硫酸エステル
は原料の形状を保持し、物理的安定性にすぐれ、
クロマトグラフイ用ゲルまたは吸着用ゲルとして
好適である。これらの原料セルロース類はすでに
市販されており、例えばセルロフアインGC−
15、同GH−25、同GC−100、同GC−200（チツ
ソ社製）、アビセル（旭化成工業社製）などがあ
る。これらのゲルを例えばピリジンなどの有機溶
媒の存在下クロルスルホン酸、無水硫酸などを作
用させることにより所望のセルロース硫酸エステ
ルが得られる。 架橋ポリサツカライド硫酸エステルとは、デキ
ストラン、セルロース類、アガロースなどのポリ
サツカライドを、例えばエピクロルヒドリン、ジ
クロルヒドリン、ジブロムヒドリン、エチレング
リコールビスエポキシプロピルエーテル等の架橋
剤で架橋して得られる架橋ポリサツカライドを硫
酸エステル化して得られるものである。架橋ポリ
サツカライドはすでに市販されており、例えば架
橋デキストランとしてセフアデツクスＧ−10、Ｇ
−25、Ｇ−50、Ｇ−100（フアルマシア社製）な
どがあり、架橋アガロースとしてセフアロース
CL−2B、CL−4B、CL−6B（フアルマシア社
製）などがあり、架橋セルロースとしてセルロフ
アインGCL−25、GCL−90（チツソ社製）など
がある。これらのゲルを例えばピリジンなどの有
機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無水硫酸など
を作用させることにより所望の架橋ポリサツカラ
イド硫酸エステルが得られる。 これらのセルロース硫酸エステルまたは架橋ポ
リサツカライド硫酸エステルを用いてカラムクロ
マトグラフイによつてインフルエンザウイルスま
たはインフルエンザウイルス表在抗原を精製する
には通常のカラムクロマトグラフイで採用される
操作が適用されるが、例えばカラムに該セルロー
ス硫酸エステルまたは架橋ポリサツカライド硫酸
エステル（好ましくは球状粒子に成形したゲル）
を充填し、これをイオン強度が0.001〜2.0程度で
ある適当な緩衝液、例えば0.01Mリン酸緩衝食塩
水（PH7.4）、0.1M食塩を含むクエン酸緩衝液
（PH7.2）などで平衡化したのち、カラムにインフ
ルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス
表在抗原含有液を通してインフルエンザウイルス
またはインフルエンザウイルス表在抗原を吸着さ
せ、上記平衡化に用いた緩衝液またはそのイオン
強度が上記平衡化、洗浄時に用いた緩衝液のイオ
ン強度より大（イオン強度0.001〜5.0程度）であ
る適当な緩衝液（PH〜10）、例えば0.2M食塩を含
むリン酸緩衝液（PH６〜９）にて洗浄する。この
あと、イオン強度が平衡化または洗浄時に用いた
緩衝液のイオン強度よりも大である適当な緩衝
液、例えば1.0M食塩を含むリン酸緩衝液（PH６
〜９）、1.5M食塩を含むリン酸緩衝液（PH６〜
９）などにて溶出することにより、高度に精製さ
れたインフルエンザウイルスまたはインフルエン
ザウイルス表在抗原が得られる。本発明の精製法
によれば、用いるセルロース硫酸エステルまたは
架橋ポリサツカライド硫酸エステルはセルロース
または架橋ポリサツカライドのマトリツクスに直
接スルホン基が結合しており、このためスルホン
基含量も高く、インフルエンザウイルスまたはイ
ンフルエンザウイルス表在抗原の特異的吸着能に
すぐれ、その精製度は数倍〜数十倍に及び、しか
もインフルエンザウイルスまたはインフルエンザ
ウイルス表在抗原の回収率も良好である。 さらに、インフルエンザウイルスワクチンの精
製において、今後ワクチン中のHAとNAの比率
を高めることが要望されるが、本発明によるセル
ロース硫酸エステルまたは架橋ポリサツカライド
硫酸エステルを用いる方法では、条件の選択によ
りHAおよびNAの特異的吸着能にもすぐれてい
るため、インフルエンザウイルス表在抗原の濃縮
回収にも有用である。 本発明の精製法は、ヒトインフルエンザウイル
スのＡ型あるいはＢ型、さらにサブタイプのどの
ようなものにも適用できる。また、ウマ、ブタ、
ニワトリ、七面鳥、カモなどの動物や鳥類由来の
インフルエンザウイルスにも適用できる。しか
も、精製処理対象としても、インフルエンザウイ
ルス感染尿膜腔液または細胞培養液のみならず、
ワクチン製造工程におけるどの段階においても本
発明の精製処理を行なうことができ、一旦濃縮を
進めた濃縮液を対象とすることもできる。またイ
ンフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイ
ルス表在抗原は天然のもののみならず、遺伝子組
換え技術を利用した組換え体の培養物より得られ
るものであつても同様に適用でき、きわめて汎用
性のすぐれた精製方法である。 本発明の精製法はカラムクロマトグラフイのみ
ならずバツチ法にも同様に適用でき、工業的規模
においても簡単な操作で行ないうるうえ、特別の
高価な試薬も必要とせず、きわめて安価にインフ
ルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス
表在抗原の工業的精製を行なうことができ、ゲル
の安定性にもすぐれ、しかも得られる製品には従
来法におけるような抗原抗体反応物などの不純物
が混入する恐れのない利点を合わせ有する。本発
明の方法は従来の技術である超遠心分離あるいは
イオン交換クロマトグラフイと組み合わせること
も可能であり、その際は従来の結果に比して非常
にすぐれた結果を得ることができる。 実施例 つぎに参考例および実施例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。 参考例 １ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中に結
晶セルロースであるクロマトグラフイ用アビセル
（旭化成工業社製）80ｇを加え、攪拌下65〜70℃
にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、10％
水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲル
を過分離し、0.01Mリン酸緩食塩液で充分に洗
浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。 参考例 ２ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117ｇを滴下し混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にセ
ルロフアインGC−15（チツソ社製）80ｇを加
え、攪拌下65〜70℃にて３時間保持する。反応終
了後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液を加
えて中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸
緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エス
テルゲルを得る。 参考例 ３ ０℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスＧ−50（フアルマシア社製）7.5ｇを加
え、攪拌下65〜70℃にて４時間保持する。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エ
ステルゲルを得る。 参考例 ４ 前記参考例３と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋セルロース
ゲルであるセルロフアインGCL−25（チツソ社
製）の乾燥物7.5ｇを加え、65〜70℃にて４時間
反応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリ
ウム水溶液を加えて中和する。ゲルを過分離
し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄して架
橋セルロース硫酸エステルゲル7.2ｇを得る。 参考例 ５ 前記参考例３と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、架橋アガロース
ゲルであるセフアロースCL−6B（フアルマシア
社製）のピリジン包含体30mlを加え、65〜70℃に
て４時間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸
化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルを
過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄
して架橋アガロース硫酸エステルゲル23mlを得
る。 実施例 １ 前記参考例２で得られたセルロース硫酸エステ
ルゲルをカラム（５cmφ×17cm）に充填し、これ
に0.14M塩化ナトリウムを含む0.010Mリン酸緩衝
液（PH7.4）を通液し平衡化する。このカラムに
11日令のふ化鶏卵に接種培養（34℃、48時間）し
たＡ／フイリピン（H3N2）タイプインフルエンザ
ウイルス感染尿膜腔液［ウイルス量77CCA
（chick cell agglutination＝鶏赤血球凝集反応に
より測定したウイルス量の単位）、蛋白質窒素量
377μｇ／ml（ローリー法）、比活性（CCA／
TCA−Ｎ）0.20（比活性とは、トリクロル酢酸
を用いて沈殿させた蛋白質窒素量を比色定量し、
その値（TCA−Ｎ）とウイルス量（CCA）との
比で蛋白質窒素量当りのウイルス（抗原）量を示
す）］4200mlを通液する。その後に0.19M塩化ナ
トリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液2500mlを通し
て洗浄する。ついで、1.49M塩化ナトリウムを含
む0.010Mリン酸緩衝液で溶出し、溶出画分170ml
を得る。その後、4.99M塩化ナトリウムを含む
0.01Mリン酸緩衝液でゲルを溶出洗浄する。 この結果を第１表に示す。
【表】
第１表に示すように、インフルエンザウイルス
は溶出画分にほゞ回収され、精製度は約20倍に達
した。 実施例 ２ 前記参考例２で得られたセルロース硫酸エステ
ルゲルをカラム（５cmφ×７cm）に充填し、これ
に0.04M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.4）を通液し平衡化する。このカラムに
0.04M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.4）と等しくなるように調製したＢ／シンガ
ポールタイプインフルエンザウイルスエーテル処
理ワクチン（精製ウイルスをエーテルで処理し、
脂質をとり除いたもので、感染防御抗原である
HA蛋白やNA蛋白の他に、他のウイルス蛋白や
核酸を含む）450mlを通液する。その後に0.04M
塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液500ml
を通して洗浄する。ついで1.94M塩化ナトリウム
を含む0.01Mリン酸緩衝液で溶出し、溶出画分
130mlを得る。さらに4.99M塩化ナトリウムを含
む0.01Mリン酸緩衝液でゲルを溶出洗浄する。こ
の結果を第２表に示す。
は溶出画分にほゞ回収され、精製度は約20倍に達
した。 実施例 ２ 前記参考例２で得られたセルロース硫酸エステ
ルゲルをカラム（５cmφ×７cm）に充填し、これ
に0.04M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.4）を通液し平衡化する。このカラムに
0.04M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.4）と等しくなるように調製したＢ／シンガ
ポールタイプインフルエンザウイルスエーテル処
理ワクチン（精製ウイルスをエーテルで処理し、
脂質をとり除いたもので、感染防御抗原である
HA蛋白やNA蛋白の他に、他のウイルス蛋白や
核酸を含む）450mlを通液する。その後に0.04M
塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液500ml
を通して洗浄する。ついで1.94M塩化ナトリウム
を含む0.01Mリン酸緩衝液で溶出し、溶出画分
130mlを得る。さらに4.99M塩化ナトリウムを含
む0.01Mリン酸緩衝液でゲルを溶出洗浄する。こ
の結果を第２表に示す。
【表】
第２表に示すように、インフルエンザウイルス
表在抗原は溶出画分にほぼ回収され、精製度は約
2.5倍に達した。 実施例 ３ 前記参考例３と同様にして得られた架橋デキス
トラン硫酸エステルをカラム（25mmφ×100mm）
に充填し、これを0.14M塩化ナトリウムを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.4）で平衡化する。こ
のカラムにＡ／態本（H1N1）タイプインフルエン
ザウイルス感染尿膜腔液50mlを通液する。その
後、0.14M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩
衝液100mlにて洗浄し、ついで1.49M塩化ナトリ
ウムを含む0.01Mリン酸緩衝液で溶出し、溶出画
分30mlを得る。その後、4.99M塩化ナトリウムを
含む0.01Mリン酸緩衝液でゲルを溶出洗浄する。
その結果を第３表に示す。
表在抗原は溶出画分にほぼ回収され、精製度は約
2.5倍に達した。 実施例 ３ 前記参考例３と同様にして得られた架橋デキス
トラン硫酸エステルをカラム（25mmφ×100mm）
に充填し、これを0.14M塩化ナトリウムを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.4）で平衡化する。こ
のカラムにＡ／態本（H1N1）タイプインフルエン
ザウイルス感染尿膜腔液50mlを通液する。その
後、0.14M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩
衝液100mlにて洗浄し、ついで1.49M塩化ナトリ
ウムを含む0.01Mリン酸緩衝液で溶出し、溶出画
分30mlを得る。その後、4.99M塩化ナトリウムを
含む0.01Mリン酸緩衝液でゲルを溶出洗浄する。
その結果を第３表に示す。
【表】
実施例 ４
前記参考例５と同様にして得られた架橋アガロ
ース硫酸エステルゲルをカラム（25mmφ×100
mm）に充填し、0.14M塩化ナトリウムを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.4）で平衡化したの
ち、Ａ／石川（H3N2）タイプインフルエンザウイ
ルス感染尿膜腔液150mlを通液する。この後、実
施例３と同様に処理して溶出画分50mlを得る。そ
の後、4.99M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸
緩衝液でゲルを溶出洗浄する。その結果を第４表
に示す。
ース硫酸エステルゲルをカラム（25mmφ×100
mm）に充填し、0.14M塩化ナトリウムを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.4）で平衡化したの
ち、Ａ／石川（H3N2）タイプインフルエンザウイ
ルス感染尿膜腔液150mlを通液する。この後、実
施例３と同様に処理して溶出画分50mlを得る。そ
の後、4.99M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸
緩衝液でゲルを溶出洗浄する。その結果を第４表
に示す。
【表】
実施例 ５
前記参考例２で得られたセルロース硫酸エステ
ルゲルをカラム（５cmφ×７cm）に充填し、
0.14M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.4）で平衡化したのち、Ａ／マイアミ
（H3N8）タイプウマインフルエンザウイルス感染
尿膜腔液300mlを通液する。その後、0.14M塩化
ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液で溶出し、
溶出画分50mlを得る。その後、4.99M塩化ナトリ
ウムを含む0.01Mリン酸緩衝液でゲルを溶出洗浄
する。その結果を第５表に示す。
ルゲルをカラム（５cmφ×７cm）に充填し、
0.14M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.4）で平衡化したのち、Ａ／マイアミ
（H3N8）タイプウマインフルエンザウイルス感染
尿膜腔液300mlを通液する。その後、0.14M塩化
ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液で溶出し、
溶出画分50mlを得る。その後、4.99M塩化ナトリ
ウムを含む0.01Mリン酸緩衝液でゲルを溶出洗浄
する。その結果を第５表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ インフルエンザウイルス含有液をカラムクロ
マトグラフイにかけて精製インフルエンザウイル
スを得る方法において、クロマトグラフイ用ゲル
としてセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサ
ツカライド硫酸エステルを用いることを特徴とす
るインフルエンザウイルスの精製方法。 ２ インフルエンザウイルスがインフルエンザウ
イルスおよび／またはインフルエンザウイルス表
在抗原である前記第１項記載の方法。 ３ インフルエンザウイルスがヒト、動物または
鳥類由来のものである前記第１項記載の方法。 ４ インフルエンザウイルスがふ化鶏卵の感染尿
膜腔液もしくは細胞培養液より得られるものであ
る前記第１項記載の方法。 ５ インフルエンザウイルスが遺伝子組換え体を
利用して培養されたウイルスである前記第１項記
載の方法。 ６ セルロース硫酸エステルが、結晶セルロース
または結晶領域および非結晶領域からなるセルロ
ースの硫酸エステル体である前記第１項記載の方
法。 ７ 架橋ポリサツカライド硫酸エステルが架橋セ
ルロース硫酸エステルおよび架橋アガーロス硫酸
エステルおよび架橋デキストラン硫酸エステルか
ら選ばれる１種である前記第１項記載の方法。 ８ 架橋セルロース硫酸エステルがエピクロルヒ
ドリン架橋セルロース硫酸エステルである前記第
７項記載の方法。 ９ 架橋アガロース硫酸エステルがエピクロルヒ
ドリン架橋アガロース硫酸エステルである前記第
７項記載の方法。 １０ 架橋デキストラン硫酸エステルがエピクロ
ルヒドリン架橋デキストラン硫酸エステルである
前記第７項記載の方法。 １１ クロマトグラフイ法がカラムクロマトグラ
フイまたはバツチ法である前記第１項記載の方
法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59167324A JPS6147186A (ja) | 1984-08-09 | 1984-08-09 | インフルエンザウイルスの精製方法 |
| EP85110012A EP0171086B1 (en) | 1984-08-09 | 1985-08-08 | A method for purification of influenza virus |
| CA000488281A CA1251399A (en) | 1984-08-09 | 1985-08-08 | Method for purification of influenza virus |
| AT85110012T ATE54468T1 (de) | 1984-08-09 | 1985-08-08 | Verfahren zur reinigung des influenzavirus. |
| DE8585110012T DE3578613D1 (de) | 1984-08-09 | 1985-08-08 | Verfahren zur reinigung des influenzavirus. |
| KR1019850005760A KR920009733B1 (ko) | 1984-08-09 | 1985-08-09 | 인플루엔자 바이러스의 정제방법 |
| US06/764,128 US4724210A (en) | 1984-08-09 | 1985-08-09 | Method for purification of influenza virus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59167324A JPS6147186A (ja) | 1984-08-09 | 1984-08-09 | インフルエンザウイルスの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6147186A JPS6147186A (ja) | 1986-03-07 |
| JPS6230752B2 true JPS6230752B2 (ja) | 1987-07-03 |
Family
ID=15847633
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59167324A Granted JPS6147186A (ja) | 1984-08-09 | 1984-08-09 | インフルエンザウイルスの精製方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4724210A (ja) |
| EP (1) | EP0171086B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6147186A (ja) |
| KR (1) | KR920009733B1 (ja) |
| AT (1) | ATE54468T1 (ja) |
| CA (1) | CA1251399A (ja) |
| DE (1) | DE3578613D1 (ja) |
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