JPH0585527B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0585527B2 JPH0585527B2 JP58039837A JP3983783A JPH0585527B2 JP H0585527 B2 JPH0585527 B2 JP H0585527B2 JP 58039837 A JP58039837 A JP 58039837A JP 3983783 A JP3983783 A JP 3983783A JP H0585527 B2 JPH0585527 B2 JP H0585527B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- crosslinked
- hbs antigen
- gel
- hepatitis
- sulfate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
本発明はＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（以下、
HBs抗原と略称する）の精製法、さらに詳しく
は架橋ポリサツカライドを硫酸エステル化して得
られる架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用い
てカラムクロマトグラフイーによりHBs抗原を
高度に精製する方法に関する。 発明の技術的背景と産業上の利用分野 Ｂ型肝炎は主として血液を介して感染する
DNA型の核酸を持つ直径42nmのウイルスによつ
て引き起こされる。このＢ型肝炎ウイルスは急性
肝炎を引き起こすだけでなく、ウイルスの持続感
染により慢性肝炎、肝硬変、また恐らく肝細胞ガ
ンをも引き起こす。Ｂ型肝炎は世界中に広く分布
し、全く自覚症状なしに長い間ウイルスを保持し
ている潜在的ウイルス保菌者（以下単にキヤリア
という）も非常に多く存在する。そのウイルスの
キヤリアは日本人の総人口の２〜３％、すなわち
200〜300万人いると言われ、東南アジア・アフリ
カではその住民の10〜15％に達しており、世界中
では約２億人がこのウイルスのキヤリアであると
推定されている。 Ｂ型肝炎を予防するには、通常高度に精製した
HBs抗原を不活化してＢ型肝炎ワクチンとして
用いる方法が有効であり、このようなＢ型肝炎ワ
クチンは医療従事者等のＢ型肝炎に感染する危険
性が高い人々をＢ型肝炎の感染から守るだけでな
く、キヤリアの新しい発生を防ぎ、最終的には地
上からＢ型肝炎を消滅させることも期待される。 ところでこのHBs抗原は３種類のＢ型肝炎ウ
イルス関連粒子、すなわち直径42nmで核酸を含
有する直径27nmのコアを内部に持つＢ型肝炎ウ
イルスそのものであるデイン（Dane）粒子、核
酸を含まない直径22nmで長さ数十〜数百nmの桿
状粒子、および直径22nmの小型球型粒子の表面
に保有されており、このHBs抗原に対する抗体
が該Ｂ型肝炎ウイルスの防御抗体となり、かかる
作用機構を利用してＢ型肝炎ワクチンとして用い
られる。 従来技術 このようなＢ型肝炎ワクチンを製造するには、
Ｂ型肝炎ウイルスキヤリアの血漿、遺伝子操作技
術を利用した組換え体の培養物や培養上澄などか
らHBs抗原を高度に精製する必要がある。この
HBs抗原の精製には一般にその操作上高度の熟
練を要し、それが工業的規模でのワクチンの製造
を阻害する大きな原因となつている。 現在HBs抗原の最も一般的な精製法として知
られているものに密度勾配遠心法〔Vyas.G.N
等、J.Immunology，108，1114（1972）；
Hirshman S.Z，Proceeding of National
Academy of Science USA，71，3345（1974）〕
があるが、この方法には多量の塩化セシウムおよ
び庶糖を必要とするほか、超遠心機ならびに精製
段階およびその規模に応じて各種のローターを必
要とし、多量の経費がかかる欠点を有する。 また抗原抗体反応を利用したアフイニテイーク
ロマトグラフイーによりHBs抗原を精製する方
法〔Houwem.B等，Journal of Immunological
Method，８，185（1975）〕も提案されており、
この方法は精製効率がきわめて良好である反面、
工業的規模で行なう場合にはクロマトグラフイー
ゲル用HBs抗体を得るために大量のHBs抗体陽
性人血清が必要であるうえ、さらにHBs抗体を
精製し、シアノゲンブロマイドなどを用いてゲル
マトリツクスに結合させアフイニテイーゲルを作
らなくてはならない。またこのアフイニテイーゲ
ルを用いたカラムクロマトグラフイーでは、
HBs抗体とゲルとの結合が比較的弱いために
HBs抗体およびHBs抗体−抗原反応物が溶出時
に脱離する恐れがある。これらがワクチンに混入
した場合には自己免疫疾患や、腎臓病を引き起こ
す恐れがある。 また他の方法として、スルホン基を有する多糖
類のデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘ
パリンなどをシアノゲンブロマイドを用いてセフ
アロースCL−4B（スウエーデン・フアルマシア
社製）あるいはセフアロースCL−6B（同上）に
結合させてアフイニテイーゲルとし、これを用い
てHBs抗原を精製する方法が提案されているが
〔M.Andersson等，Vox Sang，41，91〜97
（1981）；米国特許第4138287号；特開昭52−
114018〕、そのようなアフイニテイーゲルはその
製造工程が複雑であり、またシアノゲンブロマイ
ドを取り扱うことには危険が伴ない、工業的規模
での製造には問題がある。またデキストラン硫
酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリンなどは高価で
あるうえに、これらの化合物をセフアロースなど
の担体ゲルに結合させるには限界があり、均一な
品質のアフイニテイーゲルおよび高度精製度をも
たらすゲルは得がたい。さらにシアノゲンブロマ
イドを用いた結合は、その結合が比較的弱いの
で、スルホン基を有する多糖類が脱離し、精製
HBs抗原に混入する恐れもある。 発明の目的 本発明者等は、カラムクロマトグラフイーによ
り、より簡単により安価にHBs抗原を精製する
方法を見い出すべく種々研究を重ねた結果、架橋
ポリサツカライドを硫酸エステル化して得られる
架橋ポリサツカライド硫酸エステルがHBs抗原
と特異的に親和性を有することを見い出し、この
架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用いて血清
および血漿などの生化学物質からHBs抗原を精
製すると、きわめて高い精製度かつ高収率で、し
かもきわめて簡単に目的とする高度精製HBs抗
原が得られることを知り、本発明を完成するに至
つた。すなわち本発明はＢ型肝炎ワクチンの工業
的な製造に有用なHBs抗原の改良精製法を提供
するものであり、架橋ポリサツカライド硫酸エス
テルを用いカラムクロマトグラフイーによる
HBs抗原の高度精製法を提供するものである。 発明の構成および効果 本発明はＢ型肝炎ウイルスキヤリアの血清また
は血漿、遺伝子操作を利用した組換え体の培養物
や培養上澄液などのHBs抗原含有液をカラムク
ロマトグラフイーによりHBs抗原を分離精製す
る方法において、クロマトグラフイー用ゲルとし
て架橋ポリサツカライドを硫酸エステル化して得
られる架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用い
ることを特徴とする。 本発明で用いられる架橋ポリサツカライド硫酸
エステルとは、デキストラン、セルロース類、ア
ガロースなどのポリサツカライドを、例えばエピ
クロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒ
ドリン、エチレングリコールビスエポキシプロピ
ルエーテル等の架橋剤で架橋して得られる架橋ポ
リサツカライドを硫酸エステル化して得られるも
のである。架橋ポリサツカライドはすでに市販さ
れており例えば、架橋デキストランとしてセフア
デツクスＧ−10、Ｇ−25、Ｇ−50、Ｇ−100（フア
ルマシア社製）などがあり、架橋アガロースとし
てセフアローズCL−2B、CL−4B、CL−6B（フ
アルマシア社製）などがあり、架橋セルロースと
してセルロフアインGCL−25、GCL−90（チツソ
社製）などがある。これらのゲルを例えばピリジ
ンなどの有機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無
水硫酸などを作用させることにより所望の架橋ポ
リサツカライド硫酸エステルが得られる。 この架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用い
てカラムクロマトグラフイーによつてHBs抗原
を精製するには通常のカラムクロマトグラフイー
で採用される操作が適用されるが、例えばカラム
に該架橋ポリサツカライド硫酸エステル（好まし
くは球状粒子に成形したゲル）を充填し、これを
イオン強度が0.001〜1.0程度である適当な緩衝
液、例えばマツキルベン（McIlvaine′s）緩衝液
（PH5.0）あるいは0.01Mリン酸緩衝食塩水（PH
7.2）、0.1M食塩を含むクエン酸緩衝液（PH7.2）
などで平衡化したのちに、カラムにHBs抗原含
有液を通してHBs抗原を吸着させ、上記平衡化
に用いた緩衝液にて洗浄する。このあとイオン強
度が0.1〜5.0程度で、そのイオン強度が上記平衡
化、洗浄時に用いた緩衝液のイオン強度より大で
ある適当な緩衝液（PH５〜10）、例えば0.6M食塩
を含むマツキルベン緩衝液（PH４〜８）、0.6M食
塩を含むリン酸緩衝液（PH６〜９）などにて溶出
することにより、高度に精製されたHBs抗原が
得られる。 本発明の精製法によれば、用いる架橋ポリサツ
カライド硫酸エステルは架橋ポリサツカライドの
マトリツクスに直接スルホン基が結合しており、
このためスルホン基含量も高く、HBs抗原の特
異的吸着能にすぐれ、HBs抗原の精製度は数十
倍に及び、しかもカラムクロマトグラフイーによ
るHBs抗原の回収率は90％以上100％近くに達す
る。この方法は工業的規模においても簡単な操作
で行ないうるうえ、特別の高価な試薬も必要とせ
ず、きわめて安価にHBs抗原の工業的精製を行
なうことができ、ゲルの安定性にもすぐれ、しか
も得られる製品に従来法におけるような抗原抗体
反応物などの不純物が混入する恐れのない利点を
合わせ有する。本発明の方法は従来の技術である
超遠心分離あるいはイオン交換クロマトグラフイ
ーと組み合わせることも可能であり、その際は従
来の結果に比して非常にすぐれた結果を得ること
が出来る。 実施例 つぎに参考例および実施例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。 参考例 １ ０℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスＧ−50（フアルマシア社製）7.5gを加え、
撹拌下65〜70℃にて４時間保持する。反応終了
後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中
和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食
塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エス
テルを得る。 参考例 ２ 前記参考例１と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、エピクロルヒド
リン架橋セルロースゲルであるセルロフアイン
GCL−25（チツソ社製）の乾燥物7.5gを加え、65
〜70℃にて４時間反応させる。反応終了後、冷却
し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。
ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充
分に洗浄して架橋セルロース硫酸エステル7.2gを
得る。 参考例 ３ 前記参考例１と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、エピクロルヒド
リン架橋アガロースゲルであるセフアロースCL
−6B（フアルマシア社製）のピリジン包含体30ml
を加え、65〜70℃にて４時間反応させる。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄して架橋アガロース硫酸エス
テル23mlを得る。 実施例 １ 前記参考例１と同様にして得られた架橋デキス
トラン硫酸エステルをカラム（26.4mmφ×182mm）
に充填し、これを0.05M塩化ナトリウムを含む
0.027Mマツキルベン緩衝液（PH7.41）で平衡化
する。このカラムにHBs抗原陽性人血清〔HBs
抗原力価１：16000RPHA（逆受身血球凝集反
応）、蛋白質含量70.0mg／ml（ローリー法）、比活
性（RPHA／蛋白質含量）229〕3.0mlを通液した
のち、上記緩衝液で充分に洗浄し、ついで0.6M
塩化ナトリウムを含む0.027Mマツキルベン緩衝
液（PH7.38）で溶出して、溶出画分43.2mlを得
る。 この溶出画分のHBs抗原力価は１：
1024RPHA、蛋白質含量0.41mg／mlで比活性
2.498であつた。HBs抗原の回収率は92.2％で、
精製度（溶出画分の比活性／原料血清の比活性）
は10.9倍に達した。 実施例 ２ 前記参考例３と同様にして得られた架橋アガロ
ース硫酸エステルゲルをカラム（26.4mmφ×47.0
mm）に充填し、0.05M塩化ナトリウムを含む
0.027Mクエン酸緩衝液（PH7.36）で平衡化した
のち、HBs抗原陽性人血清〔HBs抗原力価１：
32000RPHA、蛋白質含量70.0mg／ml、比活性
457〕0.5mlを通したのち、上記緩衝液で充分洗浄
する。通過液および洗浄流出液（計10.75ml）の
HBs抗原力価は32RPHA、蛋白質含量1118mg／
ml、比活性28.7であつた。ついで0.6M塩化ナト
リウムを含む0.027Mクエン酸緩衝液（PH7.23）
で溶出して溶出画分8.00mlを得る。この溶出画分
のHBs抗原力価2048RPHA、蛋白質含量0.217
mg／ml、比活性9437.8で、HBs抗原の回収率は
85.2％であり、精製度は16.0倍に達した。 実施例 ３ 前記参考例２と同様にして得られた架橋セルロ
ース硫酸エステルをカラム（26.4mmφ×105mm）
に充填し、これに0.05M塩化ナトリウムを含む
0.027Mクエン酸緩衝液（PH7.39）を通し平衡化
する。このカラムにHBs抗原陽性人血漿20mlを
上記緩衝液で倍量に希釈したものを通液する。そ
の後、上記緩衝液で充分に洗浄する。ついで
0.6M塩化ナトリウムを含む0.027Mクエン酸緩衝
液（PH7.39）で溶出する。この結果を第１表に示
す。 第１表に示すように、HBs抗原は溶出画分に
ほぼ回収され、比活性および精製度は共に約17倍
に上昇した。
HBs抗原と略称する）の精製法、さらに詳しく
は架橋ポリサツカライドを硫酸エステル化して得
られる架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用い
てカラムクロマトグラフイーによりHBs抗原を
高度に精製する方法に関する。 発明の技術的背景と産業上の利用分野 Ｂ型肝炎は主として血液を介して感染する
DNA型の核酸を持つ直径42nmのウイルスによつ
て引き起こされる。このＢ型肝炎ウイルスは急性
肝炎を引き起こすだけでなく、ウイルスの持続感
染により慢性肝炎、肝硬変、また恐らく肝細胞ガ
ンをも引き起こす。Ｂ型肝炎は世界中に広く分布
し、全く自覚症状なしに長い間ウイルスを保持し
ている潜在的ウイルス保菌者（以下単にキヤリア
という）も非常に多く存在する。そのウイルスの
キヤリアは日本人の総人口の２〜３％、すなわち
200〜300万人いると言われ、東南アジア・アフリ
カではその住民の10〜15％に達しており、世界中
では約２億人がこのウイルスのキヤリアであると
推定されている。 Ｂ型肝炎を予防するには、通常高度に精製した
HBs抗原を不活化してＢ型肝炎ワクチンとして
用いる方法が有効であり、このようなＢ型肝炎ワ
クチンは医療従事者等のＢ型肝炎に感染する危険
性が高い人々をＢ型肝炎の感染から守るだけでな
く、キヤリアの新しい発生を防ぎ、最終的には地
上からＢ型肝炎を消滅させることも期待される。 ところでこのHBs抗原は３種類のＢ型肝炎ウ
イルス関連粒子、すなわち直径42nmで核酸を含
有する直径27nmのコアを内部に持つＢ型肝炎ウ
イルスそのものであるデイン（Dane）粒子、核
酸を含まない直径22nmで長さ数十〜数百nmの桿
状粒子、および直径22nmの小型球型粒子の表面
に保有されており、このHBs抗原に対する抗体
が該Ｂ型肝炎ウイルスの防御抗体となり、かかる
作用機構を利用してＢ型肝炎ワクチンとして用い
られる。 従来技術 このようなＢ型肝炎ワクチンを製造するには、
Ｂ型肝炎ウイルスキヤリアの血漿、遺伝子操作技
術を利用した組換え体の培養物や培養上澄などか
らHBs抗原を高度に精製する必要がある。この
HBs抗原の精製には一般にその操作上高度の熟
練を要し、それが工業的規模でのワクチンの製造
を阻害する大きな原因となつている。 現在HBs抗原の最も一般的な精製法として知
られているものに密度勾配遠心法〔Vyas.G.N
等、J.Immunology，108，1114（1972）；
Hirshman S.Z，Proceeding of National
Academy of Science USA，71，3345（1974）〕
があるが、この方法には多量の塩化セシウムおよ
び庶糖を必要とするほか、超遠心機ならびに精製
段階およびその規模に応じて各種のローターを必
要とし、多量の経費がかかる欠点を有する。 また抗原抗体反応を利用したアフイニテイーク
ロマトグラフイーによりHBs抗原を精製する方
法〔Houwem.B等，Journal of Immunological
Method，８，185（1975）〕も提案されており、
この方法は精製効率がきわめて良好である反面、
工業的規模で行なう場合にはクロマトグラフイー
ゲル用HBs抗体を得るために大量のHBs抗体陽
性人血清が必要であるうえ、さらにHBs抗体を
精製し、シアノゲンブロマイドなどを用いてゲル
マトリツクスに結合させアフイニテイーゲルを作
らなくてはならない。またこのアフイニテイーゲ
ルを用いたカラムクロマトグラフイーでは、
HBs抗体とゲルとの結合が比較的弱いために
HBs抗体およびHBs抗体−抗原反応物が溶出時
に脱離する恐れがある。これらがワクチンに混入
した場合には自己免疫疾患や、腎臓病を引き起こ
す恐れがある。 また他の方法として、スルホン基を有する多糖
類のデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘ
パリンなどをシアノゲンブロマイドを用いてセフ
アロースCL−4B（スウエーデン・フアルマシア
社製）あるいはセフアロースCL−6B（同上）に
結合させてアフイニテイーゲルとし、これを用い
てHBs抗原を精製する方法が提案されているが
〔M.Andersson等，Vox Sang，41，91〜97
（1981）；米国特許第4138287号；特開昭52−
114018〕、そのようなアフイニテイーゲルはその
製造工程が複雑であり、またシアノゲンブロマイ
ドを取り扱うことには危険が伴ない、工業的規模
での製造には問題がある。またデキストラン硫
酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリンなどは高価で
あるうえに、これらの化合物をセフアロースなど
の担体ゲルに結合させるには限界があり、均一な
品質のアフイニテイーゲルおよび高度精製度をも
たらすゲルは得がたい。さらにシアノゲンブロマ
イドを用いた結合は、その結合が比較的弱いの
で、スルホン基を有する多糖類が脱離し、精製
HBs抗原に混入する恐れもある。 発明の目的 本発明者等は、カラムクロマトグラフイーによ
り、より簡単により安価にHBs抗原を精製する
方法を見い出すべく種々研究を重ねた結果、架橋
ポリサツカライドを硫酸エステル化して得られる
架橋ポリサツカライド硫酸エステルがHBs抗原
と特異的に親和性を有することを見い出し、この
架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用いて血清
および血漿などの生化学物質からHBs抗原を精
製すると、きわめて高い精製度かつ高収率で、し
かもきわめて簡単に目的とする高度精製HBs抗
原が得られることを知り、本発明を完成するに至
つた。すなわち本発明はＢ型肝炎ワクチンの工業
的な製造に有用なHBs抗原の改良精製法を提供
するものであり、架橋ポリサツカライド硫酸エス
テルを用いカラムクロマトグラフイーによる
HBs抗原の高度精製法を提供するものである。 発明の構成および効果 本発明はＢ型肝炎ウイルスキヤリアの血清また
は血漿、遺伝子操作を利用した組換え体の培養物
や培養上澄液などのHBs抗原含有液をカラムク
ロマトグラフイーによりHBs抗原を分離精製す
る方法において、クロマトグラフイー用ゲルとし
て架橋ポリサツカライドを硫酸エステル化して得
られる架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用い
ることを特徴とする。 本発明で用いられる架橋ポリサツカライド硫酸
エステルとは、デキストラン、セルロース類、ア
ガロースなどのポリサツカライドを、例えばエピ
クロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒ
ドリン、エチレングリコールビスエポキシプロピ
ルエーテル等の架橋剤で架橋して得られる架橋ポ
リサツカライドを硫酸エステル化して得られるも
のである。架橋ポリサツカライドはすでに市販さ
れており例えば、架橋デキストランとしてセフア
デツクスＧ−10、Ｇ−25、Ｇ−50、Ｇ−100（フア
ルマシア社製）などがあり、架橋アガロースとし
てセフアローズCL−2B、CL−4B、CL−6B（フ
アルマシア社製）などがあり、架橋セルロースと
してセルロフアインGCL−25、GCL−90（チツソ
社製）などがある。これらのゲルを例えばピリジ
ンなどの有機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無
水硫酸などを作用させることにより所望の架橋ポ
リサツカライド硫酸エステルが得られる。 この架橋ポリサツカライド硫酸エステルを用い
てカラムクロマトグラフイーによつてHBs抗原
を精製するには通常のカラムクロマトグラフイー
で採用される操作が適用されるが、例えばカラム
に該架橋ポリサツカライド硫酸エステル（好まし
くは球状粒子に成形したゲル）を充填し、これを
イオン強度が0.001〜1.0程度である適当な緩衝
液、例えばマツキルベン（McIlvaine′s）緩衝液
（PH5.0）あるいは0.01Mリン酸緩衝食塩水（PH
7.2）、0.1M食塩を含むクエン酸緩衝液（PH7.2）
などで平衡化したのちに、カラムにHBs抗原含
有液を通してHBs抗原を吸着させ、上記平衡化
に用いた緩衝液にて洗浄する。このあとイオン強
度が0.1〜5.0程度で、そのイオン強度が上記平衡
化、洗浄時に用いた緩衝液のイオン強度より大で
ある適当な緩衝液（PH５〜10）、例えば0.6M食塩
を含むマツキルベン緩衝液（PH４〜８）、0.6M食
塩を含むリン酸緩衝液（PH６〜９）などにて溶出
することにより、高度に精製されたHBs抗原が
得られる。 本発明の精製法によれば、用いる架橋ポリサツ
カライド硫酸エステルは架橋ポリサツカライドの
マトリツクスに直接スルホン基が結合しており、
このためスルホン基含量も高く、HBs抗原の特
異的吸着能にすぐれ、HBs抗原の精製度は数十
倍に及び、しかもカラムクロマトグラフイーによ
るHBs抗原の回収率は90％以上100％近くに達す
る。この方法は工業的規模においても簡単な操作
で行ないうるうえ、特別の高価な試薬も必要とせ
ず、きわめて安価にHBs抗原の工業的精製を行
なうことができ、ゲルの安定性にもすぐれ、しか
も得られる製品に従来法におけるような抗原抗体
反応物などの不純物が混入する恐れのない利点を
合わせ有する。本発明の方法は従来の技術である
超遠心分離あるいはイオン交換クロマトグラフイ
ーと組み合わせることも可能であり、その際は従
来の結果に比して非常にすぐれた結果を得ること
が出来る。 実施例 つぎに参考例および実施例を挙げて本発明をさ
らに具体的に説明する。 参考例 １ ０℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスＧ−50（フアルマシア社製）7.5gを加え、
撹拌下65〜70℃にて４時間保持する。反応終了
後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中
和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食
塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エス
テルを得る。 参考例 ２ 前記参考例１と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、エピクロルヒド
リン架橋セルロースゲルであるセルロフアイン
GCL−25（チツソ社製）の乾燥物7.5gを加え、65
〜70℃にて４時間反応させる。反応終了後、冷却
し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。
ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充
分に洗浄して架橋セルロース硫酸エステル7.2gを
得る。 参考例 ３ 前記参考例１と同様にして調製したピリジン−
クロルスルホン酸混液210mlに、エピクロルヒド
リン架橋アガロースゲルであるセフアロースCL
−6B（フアルマシア社製）のピリジン包含体30ml
を加え、65〜70℃にて４時間反応させる。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄して架橋アガロース硫酸エス
テル23mlを得る。 実施例 １ 前記参考例１と同様にして得られた架橋デキス
トラン硫酸エステルをカラム（26.4mmφ×182mm）
に充填し、これを0.05M塩化ナトリウムを含む
0.027Mマツキルベン緩衝液（PH7.41）で平衡化
する。このカラムにHBs抗原陽性人血清〔HBs
抗原力価１：16000RPHA（逆受身血球凝集反
応）、蛋白質含量70.0mg／ml（ローリー法）、比活
性（RPHA／蛋白質含量）229〕3.0mlを通液した
のち、上記緩衝液で充分に洗浄し、ついで0.6M
塩化ナトリウムを含む0.027Mマツキルベン緩衝
液（PH7.38）で溶出して、溶出画分43.2mlを得
る。 この溶出画分のHBs抗原力価は１：
1024RPHA、蛋白質含量0.41mg／mlで比活性
2.498であつた。HBs抗原の回収率は92.2％で、
精製度（溶出画分の比活性／原料血清の比活性）
は10.9倍に達した。 実施例 ２ 前記参考例３と同様にして得られた架橋アガロ
ース硫酸エステルゲルをカラム（26.4mmφ×47.0
mm）に充填し、0.05M塩化ナトリウムを含む
0.027Mクエン酸緩衝液（PH7.36）で平衡化した
のち、HBs抗原陽性人血清〔HBs抗原力価１：
32000RPHA、蛋白質含量70.0mg／ml、比活性
457〕0.5mlを通したのち、上記緩衝液で充分洗浄
する。通過液および洗浄流出液（計10.75ml）の
HBs抗原力価は32RPHA、蛋白質含量1118mg／
ml、比活性28.7であつた。ついで0.6M塩化ナト
リウムを含む0.027Mクエン酸緩衝液（PH7.23）
で溶出して溶出画分8.00mlを得る。この溶出画分
のHBs抗原力価2048RPHA、蛋白質含量0.217
mg／ml、比活性9437.8で、HBs抗原の回収率は
85.2％であり、精製度は16.0倍に達した。 実施例 ３ 前記参考例２と同様にして得られた架橋セルロ
ース硫酸エステルをカラム（26.4mmφ×105mm）
に充填し、これに0.05M塩化ナトリウムを含む
0.027Mクエン酸緩衝液（PH7.39）を通し平衡化
する。このカラムにHBs抗原陽性人血漿20mlを
上記緩衝液で倍量に希釈したものを通液する。そ
の後、上記緩衝液で充分に洗浄する。ついで
0.6M塩化ナトリウムを含む0.027Mクエン酸緩衝
液（PH7.39）で溶出する。この結果を第１表に示
す。 第１表に示すように、HBs抗原は溶出画分に
ほぼ回収され、比活性および精製度は共に約17倍
に上昇した。
【表】
なお、上記精製したHBs抗原の一部を超遠心
分析した。すなわち、日立70P−72超遠心機およ
びRPS40Tローターを用い、塩化セシウム密度勾
配を作り、これにサンプルをのせ、40000rpmで
15時間遠心したところ、このHBs抗原はρ＝1.2
付近に鋭いピークを示した。これは精製された
HBs抗原が単一のものであることを示すもので
ある。 比較例 １ 架橋セルロースゲルであるセルロフアイン
GCL−25をカラム（26.4mmφ×120mm）に充填し、
これを0.05M塩化ナトリウムを含む0.027Mクエ
ン酸緩衝液（PH7.40）で平衡化する。このカラム
に実施例３で用いたHBs抗原陽性人血漿と同一
ロツトの血漿20.0mlを上記緩衝液で２倍に希釈し
て通液し、同緩衝液でカラムを充分に洗浄する。
ついで0.6M塩化ナトリウムを含む0.027Mクエン
酸緩衝液（PH7.40）で溶出した。HBs抗原の98.2
％は素通り画分に回収され、また蛋白質もほぼ完
全に（96.7％）素通り液に回収された。溶出画分
に吸光度のピークは観察されず、またHBs抗原
価は１：２以下（RPHA）であり、HBs抗原は
全く精製出来なかつた。 実施例 ４ 参考例３と同様にして調製した架橋セルロース
硫酸エステルをカラム（26.4mmφ×125mm）に充
填し、0.01Mリン酸緩衝食塩液（PH7.20）で平衡
化する。HBs抗原陽性人血清を硫安塩析後、密
度勾配ゾーナル遠心機（日立70P−72）を用いて
精製（日立RPZ−35−Ｔローター使用、庶糖密
度勾配10〜45％ｗ／ｗ、30000rpm、20時間およ
び日立RPZ−48Tローター使用、庶糖密度20〜50
％ｗ／ｗ、42000rpm、20時間）したのちに
0.01Mリン酸緩衝食塩液に透析したHBs抗原含有
液40ml（HBs抗原力価１：32000RPHA、免疫電
気交差法で正常人血清陽性）を上記カラムに通液
する。0.01Mリン酸緩衝食塩液（PH7.20）で洗浄
後、0.6M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩
衝食塩液（PH7.20）で溶出し、溶出画分12.0mlを
得た。この溶出液はHBs抗原力価１：102400で
免疫電気交差法でHBs抗原以外の血漿蛋白は検
出されず、HBs抗原はほぼ完全に精製され、回
収率は96.0％であつた。
分析した。すなわち、日立70P−72超遠心機およ
びRPS40Tローターを用い、塩化セシウム密度勾
配を作り、これにサンプルをのせ、40000rpmで
15時間遠心したところ、このHBs抗原はρ＝1.2
付近に鋭いピークを示した。これは精製された
HBs抗原が単一のものであることを示すもので
ある。 比較例 １ 架橋セルロースゲルであるセルロフアイン
GCL−25をカラム（26.4mmφ×120mm）に充填し、
これを0.05M塩化ナトリウムを含む0.027Mクエ
ン酸緩衝液（PH7.40）で平衡化する。このカラム
に実施例３で用いたHBs抗原陽性人血漿と同一
ロツトの血漿20.0mlを上記緩衝液で２倍に希釈し
て通液し、同緩衝液でカラムを充分に洗浄する。
ついで0.6M塩化ナトリウムを含む0.027Mクエン
酸緩衝液（PH7.40）で溶出した。HBs抗原の98.2
％は素通り画分に回収され、また蛋白質もほぼ完
全に（96.7％）素通り液に回収された。溶出画分
に吸光度のピークは観察されず、またHBs抗原
価は１：２以下（RPHA）であり、HBs抗原は
全く精製出来なかつた。 実施例 ４ 参考例３と同様にして調製した架橋セルロース
硫酸エステルをカラム（26.4mmφ×125mm）に充
填し、0.01Mリン酸緩衝食塩液（PH7.20）で平衡
化する。HBs抗原陽性人血清を硫安塩析後、密
度勾配ゾーナル遠心機（日立70P−72）を用いて
精製（日立RPZ−35−Ｔローター使用、庶糖密
度勾配10〜45％ｗ／ｗ、30000rpm、20時間およ
び日立RPZ−48Tローター使用、庶糖密度20〜50
％ｗ／ｗ、42000rpm、20時間）したのちに
0.01Mリン酸緩衝食塩液に透析したHBs抗原含有
液40ml（HBs抗原力価１：32000RPHA、免疫電
気交差法で正常人血清陽性）を上記カラムに通液
する。0.01Mリン酸緩衝食塩液（PH7.20）で洗浄
後、0.6M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩
衝食塩液（PH7.20）で溶出し、溶出画分12.0mlを
得た。この溶出液はHBs抗原力価１：102400で
免疫電気交差法でHBs抗原以外の血漿蛋白は検
出されず、HBs抗原はほぼ完全に精製され、回
収率は96.0％であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原含有液をカラムク
ロマトグラフイーにかけて精製Ｂ型肝炎ウイルス
表面抗原を得る方法において、クロマトグラフイ
ー用ゲルとして、ポリサツカライドをエピクロル
ヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒドリン
およびエチレングリコールビスエポキシプロピル
エーテルから選ばれる架橋剤で架橋して得られる
架橋ポリサツカライドゲルを有機溶媒中で硫酸化
剤と反応させて得られる架橋ポリサツカライドゲ
ル硫酸エステルを用いることを特徴とするＢ型肝
炎ウイルス表面抗原の精製方法。 ２ 架橋ポリサツカライド硫酸エステルが、架橋
セルロース硫酸エステルおよび架橋アガロース硫
酸エステルおよび架橋デキストラン硫酸エステル
から選ばれる１種であり、これらは、それぞれ、
セルロース、アガロースおよびデキストランをエ
ピクロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロム
ヒドリンおよびエチレングリコールビスエポキシ
プロピルエーテルから選ばれる架橋剤で架橋して
得られる架橋セルロースゲル、架橋アガロースゲ
ルおよび架橋デキストランゲルを有機溶媒中で硫
酸化剤と反応させて得られるものである前記１項
記載の方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3983783A JPS59164727A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法 |
| US06/586,702 US4515714A (en) | 1983-03-09 | 1984-03-06 | Method for purification of hepatitis B virus surface antigen |
| CA000449009A CA1216790A (en) | 1983-03-09 | 1984-03-07 | Method for purification of hepatitis b virus surface antigen |
| EP84102501A EP0118885B1 (en) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Method for purification of hepatitis b virus surface antigen |
| AT84102501T ATE38152T1 (de) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Verfahren zur reinigung des hepatitis-b-virusoberfl|chenantigens. |
| DE8484102501T DE3474775D1 (en) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | Method for purification of hepatitis b virus surface antigen |
| KR1019840001160A KR880002586B1 (ko) | 1983-03-09 | 1984-03-08 | B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법 |
| SG88/89A SG8889G (en) | 1983-03-09 | 1989-02-14 | Method for purification of hepatitis b virus surface antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3983783A JPS59164727A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59164727A JPS59164727A (ja) | 1984-09-17 |
| JPH0585527B2 true JPH0585527B2 (ja) | 1993-12-07 |
Family
ID=12564073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3983783A Granted JPS59164727A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59164727A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE420977B (sv) * | 1976-03-18 | 1981-11-16 | Kabi Ab | Forfarande for rening och isolering av hepatitvirus for vaccinframstellning |
-
1983
- 1983-03-09 JP JP3983783A patent/JPS59164727A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59164727A (ja) | 1984-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR880002586B1 (ko) | B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법 | |
| JPH01311028A (ja) | 肝炎蛋白質の精製 | |
| JPS6230752B2 (ja) | ||
| JPH0724723B2 (ja) | 硫酸化された非炭水化物ゲルマトリツクス吸着剤 | |
| JPH0450294B2 (ja) | ||
| US5639857A (en) | Ultrapurification of factor IX and other vitamin k-dependent proteins | |
| US5055557A (en) | Ultrapurification of factor IX and other vitamin K-dependent proteins | |
| RU2122430C1 (ru) | Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита b, содержащего пре s2 пептид, из рекомбинантных клеток дрожжей, вакцина для иммунизации против гепатита b | |
| AU641119B2 (en) | Ultrapurification of factor IX and other vitamin K-dependent proteins | |
| JP2511500B2 (ja) | 胎盤組織タンパク質ｐｐ▲下４▼の精製法 | |
| JPS6176422A (ja) | 百日ぜきコンポ−ネントワクチンおよび百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンの製造方法 | |
| JPH0423751B2 (ja) | ||
| JPS6154451A (ja) | 群特異性を有するアフイニテイクロマトグラフイ用ゲルおよびその製法 | |
| JPH0585527B2 (ja) | ||
| JPH0235726B2 (ja) | ||
| JP2839712B2 (ja) | 第▲ｉｘ▼因子の精製 | |
| KR890001069B1 (ko) | B형 간염 항원의 정제방법 | |
| KR100251015B1 (ko) | B형간염표면항원의정제방법 | |
| EP0170162B1 (en) | Method for the purification of leukocytosis-promoting factor haemagglutinin | |
| KR0159716B1 (ko) | B형 간염 표면 항원의 정제방법 | |
| WO1991013976A1 (fr) | Procede pour la production d'un activateur plasminogene de tissus purifie ou de ses derives | |
| JP2627186B2 (ja) | レトロウイルスの精製方法 | |
| JPH0574599B2 (ja) | ||
| KR100538823B1 (ko) | 비형간염 바이러스 표면항원, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 진단용 제제 | |
| JPS5810522A (ja) | 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン３の精製法 |