JPS6232899A - 癌胚抗原の製造方法及び同方法により製造された癌胚抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒトの結ｌ１ｉＰｓ癌細胞系からヨウ素化品
質をもった癌胚抗原（ＣＥ　Ａ）を製造する方法および
同方法によって製造された癌胚抗原に関する。

「従来の技術」 癌胚抗原は、ゴールド（Ｇｏｌｄ）及びフリートマン（
Ｆｒｅｅｄｍａｎ）によってジャーナル・イン曇エクス
ベリメンタル・メティスン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、
）、１２１巻、４３９ページ（１９６５年）に最初に記
載された、癌胎児糖蛋白質である。癌胚抗原はヒト胎児
の胃腸管に通常存在するが、胎児が成長するにしたがい
、そこでの生産は減少する。癌胚抗原は大人の血清中に
も見られ、特に胃腸管、乳房、肺、卵巣及び膵臓に腫瘍
を有する患者の場合、高濃度になる。高い癌胚抗原濃度
はある種の悪性でない腫瘍、炎症性疾患及び慢性肺疾患
にも関連があるとされて来た。

このようなことが他の試験を併用しないで癌を確実に診
断するための独立した試験として癌胚抗原検定法を用い
ることを妨げて来たが、これらの検定法は癌と診断され
た患者の連続的監視にうまく用いられている。癌胚抗原
検定法の臨床例に関しては結腸直腸癌患者の追跡管理に
おけるものが最も多く報告されている。この検定法は、
他の消止器系器官並びに肺、乳房及び前立腺に発現して
いる腺癌を有する患者並びに肺、食道及び尿生殖路の表
皮癌患者の癌胚抗原濃度の連続的監視にも有用であるご
とが示されて米た。

このような標識の潜在的重要性が、種々の検定法を開発
し、かつ検定キット類を商業的に製造することを促した
。血漿癌胚抗原検定の重要性は次の場合に生じる。

（１）　術後の患者の監視−永続的に上昇する又は高い
癌胚抗原濃度は腫瘍の除去が不完全であるか、又は腫瘍
の転移を示唆し、一方、低下する癌胚抗原濃度は切除が
成功したことを示唆する。一般に、高い癌胚抗原濃度は
思わしくない予後と結びつけて考えられる。

（２）　長期的な抗腫瘍薬又は放射線治療における効果
の監視−癌胚抗原濃度が滴下して来ている場合は治療効
果が上って来ていることを示唆する。

（３）　局所的又は離れた部位（転移）における悪性疾
患の状態の判定−高い癌胚抗原濃度が、疾病の進行を示
す他の臨床的証拠が現われる数カ月も前に現われる、腫
瘍再発を示す唯一の徴候であることがよくあった。

（４）　転移の放射線免疫検定−標識した抗癌胚抗原−
ＩｇＧが、腫瘍部位の特定及び転移の早期発見のために
、生体内で用いられる。

癌胚抗原の基準濃度が患者に設定された後、定期的な癌
胚抗原の検定が疾患の経過を監視する手助けとなる。次
いで、癌胚抗原値は患者の臨床的所見から得られる情報
と組合せて使用される。

癌胚抗原の放射線免疫検定（ＲＩＡ）／エリザ（Ｅ　Ｌ
　Ｉ　ＳＡ）診断キット類が多くの会社から販売されて
来ており、そのようなキット類は癌胚抗原を検知する能
力においてほぼ同じである。しかしながら、それれらは
多くの欠点のために不利を免れない０例えば、その一つ
がヒトの肝転移部及びポリクローン抗癌胚抗原抗体から
単離された癌胚抗原である試薬類の不均質性及び標準化
の欠如のために、絶対値が互いに比較できない、さらに
、ヒト由来の組織（即ち肝転移部）が必ず入手できると
は限らないので、そのようなキットの供給がしばしば遅
れる。

癌胚抗原検定試薬の標準化が臨床研究のために重要であ
る。これは、（ｉ）高い特異性、純度及び再現性の抗体
、即ち、（放射線免疫検定及び癌胚抗原精製においても
使用できる〕モノクローン抗体を使用するか、又は（ｉ
ｉ）異質転移癌胚抗原を１組織培養で培養された細胞系
から精製された細胞系癌胚抗原から成る非常に均質で、
再現性があり、かつ均一な物質と交換するかによって達
成される。これにより、癌胚抗原の検定の長期一貫性が
もたらされる。以下に明らかになるように。

本発明の方法はオプション（ｉｉ）に関スル。

細胞が組織培養で培養される場合に培地に分泌される細
胞表面成分は、木質的に無限量で、再現性の抗原の容易
に入手可能な供給源となる。このような方法による抗原
の商業的生産の必要条件は、 （ａ）　　製品の一定収穫をもたらす大規模で長期的な
培養、 （ｂ）　　大量の培養物の処理を包含する精製手順、及
び （Ｃ）　　免疫学的及び物理化学特性に関する製品の適
性の確認、である。

いくつかの癌胚抗原生産細胞系が文献［特に、ライポビ
ッッ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）等のキャンサー・リサーチ
（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　、　３６巻、４５６２ペ
ージ（１９７６年）参照］に報告された。これらの細胞
系は、癌胚抗原の生産を包含するいくつかのパラメータ
ーに従って分類することができる。（放射線免疫検定／
エリサキット類によって試験されるような）癌胚抗原の
生産は細胞系の性質、並びに、２１８間単層培養につき
８〜７５００川ｇ／１０”細胞の範囲である最大値に定
常期においてなる生長期に依存することがわかった。

免疫活性物質（癌胚抗原）を単離しかつ識別することが
、癌胚抗原放射性免疫検定／エリサキット類の標準抗原
として細胞系癌胚抗原を用いるために必要な、通常の方
法で多量の細胞を長期的に培養することの困難さによっ
て妨げられた。アポットΦラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔ
ｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、臨床検定の標準物
質として使用される癌胚抗原が細胞系から単離されたと
コマーシャルパンフレットで報告した最初で、かつ唯一
の会社であった。しかし、このパンフレットは培養及び
精製手順について詳細を報告していない。

小さな容積中に大きな細胞生長表面積を与えることによ
る、固定依存性細胞の培養（中空繊維、微粒子担体培養
等）の最近改良された形態の一つ［クアラＬ／　７．　
（Ｑｕａｒａｌｅｓ）等、インΦビトロ（ＩｎＶｉｔｒ
ｏ）、１６巻、１１３ページ（１９８０年）］を適用す
ることが単層培地での大規模細胞培養に伴う直面する複
雑性を克服することになると思われる。微粒子担体培養
系［ロイベニ−（Ｒｅｕｖｅｎｙ）等、ディベロップメ
ンタル・バイオロジー・スタンダーズ（Ｄｅｖ、　Ｂｉ
ｏｌ、　５ｔａｎｄａｒｄｓ）　、　５０巻、１１５〜
１２３ページ（１９８２年）］において、細胞は、例え
ば、スピンナーフラスコ中でゆっくり攪拌しながら、培
地中に浮遊した小さな固体粒子上に繁殖させられる。こ
の系は種々の細胞系の培養にうまく使用される。（癌胚
抗原放射線免疫検定法によって検定されるような）ｌｉ
’！’胚抗原生産性細胞系がサイトデックス（Ｃｙｔｏ
ｄｅｘ）　−１微粒子担体［７７一−ｙシア社（Ｐｈａ
ｒＩＩａｃｉａ）製］上及びペロリ皿内で生長すると微
粒子担体に関するファーマシア社の小冊子にページ（Ｐ
ａｇｅ）等によって報告された。この培養は大規模では
できず、生産された抗原は精製されなかった。微粒子担
体系が、確立されている癌胚抗原生産性細胞系［ヤニフ
（Ｙａ旧マ）等、エクスベリメンタル・セル拳バイオロ
ジー（Ｅ！ｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、４６巻、２
２０〜２３０ページ（１９７８年）」の軟寒天中での希
釈及び培養に引続き単離されるサブクローン、即ちＨｕ
ＣＣＬ−１４Ａの大規模な長期的培養に本出願人によっ
て適用された。、を出願人は生産された抗原の精製法を
見出し、かつ免疫活性及び物理化学特性の点から転移癌
胚抗原と同一であることを確かめた。

微粒子担体上での細胞系の生長に適用するには、癌胚抗
原の最大生長及び最大分泌の両方を考慮して、最適な微
粒子担体を選択することが必要であった。この選択は固
定培地で行なわれた。市販の担体並びに本出願人によっ
て開発された円筒状の微粒子担体に対して検討を行なっ
た。その結果、生産された癌胚抗原の量はほぼ同じであ
ったけれども、細胞がビーズ状微粒子担体の外側に集塊
として生長するので、ビーズ状微粒子担体は長期の細胞
生長を維持できないということがわかった０円筒状の硬
質セルロース微粒子担体はこの担体を閉じこめる集塊内
で細胞生長を維持することがわかった。攪拌しながら、
例えば、スピンナーフラスコ内における液体培地内で試
験した場合。

本発明に従えば、ある種のセルロース微粒子担体が最も
適しており、高い細胞密度（従って、高い癌胚抗原濃度
）及び均質な浮遊培地となる集塊を形成することがわか
った。癌胚抗原濃度が細胞の生長にしたがい増加し、１
５日後までに（１リツトルの培地当たり０．２〜０．８
ｍｇの範囲内で）最大となった。単層培養と比較して、
癌胚抗原濃度が低下せず、しかも少なくとも５０％の生
存偉力で３力月にわたって一足のままであった。

微粒子担体／撹拌培地培養系の利点は次の通りである。

（１）　癌胚抗原を、長期間にわたって連続して操作し
ながら、液体培地から収穫することができる。

（２）　曝気及び癌胚抗原分泌変更遺伝子のような種々
の環境要因を細胞生長及び癌胚抗原分泌に対するそれら
の効果に関して監視及び制御することができる。

（３）　系を大きくすることができる。

培養物から癌胚抗原を精製するにあたり、その目的は低
い比活性の大量の培養物を容易に処理できる方法である
べきである。ヒトの肝転移部から得られる癌胚抗原の精
製に通常使用される方法の殆どは、過塩素酸（ＰＣＡ）
抽出、二回のゲル濾過及び調製用電気泳動から成る、イ
ムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
、９＠、６１３ページ（１，９７２年）にクルペイ（Ｋ
ｒｕｐｅｙ）等によって記載された方法に基づいている
。次いで、いくつかのグループが、ポリクローンか又は
モノクローン抗体であるかに基づいて、イオン交換カラ
ム又はアフィニティークロマトグラフィーを用いて、上
記方法を改良した。これらの改良は大量で低い比活性の
試料（即ち、培養物）から癌胚抗原を迅速かつ選択的に
精製することを可能にする。

本発明の実施態様に従って、本出願人は、上記の方法に
基づいているが、好ましくはＰＣＡ及び硫酸アンモニウ
ム抽出並びにモノクローン抗癌胚抗原抗体によるアフィ
ニティークロマトグラフィーを利用する細胞系癌胚抗原
の精製法を開発した。精製係数は１６，７００程度であ
り。

３５〜４５％の収率でヨウ素化品質をもった癌胚抗原を
精製する（下記、表Ａ参照）。精製された抗原は均一で
、すぐに利用でき、かつ再現性のあるものである。従っ
て、その特性が確定されている標準転移癌胚抗原に匹敵
するならば、臨床用キットの標準物質として使用するの
に理想的に適している。

癌胚抗原の公知の機能のいずれかの欠如及びその異質な
物理化学特性のために、新規な癌胚抗原物質は推奨され
ている物理化学及び免疫学基準、即ち、 （１）　転移癌胚抗原と同様に、ドデシル硫酸すトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）による１８０．０００〜２００，０００の見掛は重
量平均分子量（ＭＷ）を有する単一拡散成分の有無； （２）　精製された抗原が、予め識別された抗血清を用
いて、公知の標準癌胚抗原での二重免疫拡散分析と同一
の反応を与えること： （３）　　１２’、■標識された癌胚抗原が確定されて
いる抗血清と特徴的な結合曲線（第１図）を与えること
； （４）　抗原が、他の癌胚抗原物質と同様な癌胚抗原の
癌胚抗原放射線免疫検定／エリサ活性を与えること； （５）　抗原が、特徴的で、かなり一定の炭水化物組成
及び連鎖分析値を有する、４０〜６０％の炭水化物及び
単一のポリペプチド鎖から成る糖蛋白質であること（表
１及び２）； の組合せによって評価される。

本発明の実施態様に従って製造された細胞系癌胚抗原物
質は上記の基準を満たすことがわかった。従って、この
製品は上記目的に特に適している。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、上記推奨されている基準によって、転
移癌胚抗原と見分けがつかず、従って重版のキットの転
移癌胚抗原の代替物として使用できる癌胚抗原物質を製
造することであると強調できる。（いくらかの構造的差
異が転移癌胚抗原と細胞系癌胚抗原との間並びに別個の
バッチの転移癌胚抗原間に必ず見られる）　転移癌胚抗
原に勝る細胞系癌胚抗原の利点は均質性、再現性及び容
易な入手可能性である。

細胞系の長期間培養の適用、粗癌胚抗原の大規模生産、
便利で、効果的で、かつ再現性のある方法による生成物
の精製並びに細胞系癌胚抗原の転移癌胚抗原との同一性
の確認が（本出願人によって克服された）関連する問題
点であった。

［問題点を解決するための手段］ 従って１本発明は、前述の目的を達成するため、 癌胚抗原生産性細胞系を単層培地中で培養し；少なくと
も一回の追加の培養工程において、前記培地を連続的に
攪拌しながら、前記細胞系を微粒子担体上でさらに培養
し； 前記細胞系によって分泌された所望の癌胚抗原を含有す
る培地を収穫し；及び ヨウ素化品質をもった製品が得られるまで前記癌胚抗原
を精製する： 各工程から成ることを特徴とする癌胚抗原を製造する方
法を提供する。

また本発明は、上述の方法により製造された確立癌胚抗
原物質の免疫活性と同様な免疫活性、大体において約１
８０，０００〜２００，０００の分子量及び次の重量％
組成分析値：蛋白質４５．２±２．３％；Ｎ−７セチル
グルコサミン１９．１±０．９５％；マンノース６．６
±０．３３％；フコース７．８±０．３８％；ガラクト
ース９．３±０．４７％；及びシアル酸１２．３±０．
６２％を有する癌胚抗原を提供する。

［作用］ 本発明の方法は、回分式又は連続的に実施できる。少な
くとも追加の培養及び単離工程を連続操作の一部として
実施するのが好ましい、収穫工程を培養物の部分にだけ
実施し、かつ回収される該培養物が同量の新鮮な培地に
よって置換えられ、所望の生成物の連続的成長及び生産
を維持するのが特に好ましい、この収穫工程は数日の間
隔で周期的に繰返されるのが最も好ましい。

微粒子担体はセルロースから得られる微粒子担体である
のが好ましく、また微粒子担体は硬質で、円筒状か又は
球状であるのが好ましい。

前記単層培養工程に関し、この工程を３〜５日間、即ち
全面生長が達成されるまで実施することができる。いか
なる適切な培地も使用できるが、本発明の目的のために
は、ＲＰＭＩ　Ｎｏ、１６４０を使用するのが好ましい
、前記培地は、例えばネオマイシン、ペニシリン、スト
レプトマイシン及びゲンタマイシンから成る群から選択
される抗生物質をさらに含有しうる。その上、前記培地
は、前記ＲＰＭＩ　　Ｎｏ、１６４０ｃ７）約１０％の
割合で存在するのが好ましい胎児ウシ血清（ＦＢＳ）も
さらに含有しうる。前記培地のｐＨは約７．２に調整す
るのが好ましく、かつこの工程の適切な操作温度は３７
±５℃、好ましくは約３７℃である。

前記単層培養工程は大気中に通常存在するよりも多い量
の二酸化炭素を有する雰囲気中で実施するのが適してい
る。前記雰囲気は１例えば、約５〜１０％の二酸化炭素
を含有する圧縮空気でありうる。

単層培養に引続き、所望の細胞をトリプシン化溶液、例
えば、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて表面培養容器
から回収しうる。

前記少なくとも一回の追加の培養工程に関し、この工程
を（例えば）３〜１０日間、即ち全面生長が達成される
まで、実施しうる。この少なくとも一回の追加の培養工
程の培地は本発明の目的のために適したいかなる培地で
あってもよいが、ＲＰＭＩ　　Ｎｏ、１６４０から成る
のが好ましく、かつ胎児ウシ血清もさらに含有するのが
好ましい。前記胎児ウシ血清は、例えば、前記ＲＰＭＩ
Ｎｏ、１６４０の約１０％の割合で少なくとも最初は存
在する。前記培地に適したｐＨは約７．２である。適切
な操作温度は３７±５℃、好ましくは約３７℃である。

培地は二酸化炭素と空気の混合ガスで曝気することがで
きる。

本発明の方法の一実施態様において、前記少なくとも一
回の追加の培養工程が、前記工程の二回目の処理量が前
記工程の最初の処理量の約整数倍（例えば、約５〜１０
倍）であるような少なくとも二回の連続工程から成る。

前記精製工程は過塩素酸を用いる抽出と不溶分を除去す
ることから成りうる。この抽出に引続き、濃縮及び脱塩
を実施する。濃縮及び脱塩に引続き、硫酸アンモニウム
処理を行ない、それによって沈殿した非癌胚抗原蛋白質
を除去する。！酸アンモニウム処理に引続き、ざらに濃
縮及び脱塩を実施する０本発明の方法の一実施態様にお
いて、精製工程は追加工程の限外濾過及び遠心分離に引
続きただちに実施される。

精製工程自体をアフィニティークロマトグラフィー、さ
らに好ましくは、モノクローン抗癌胚抗原抗体を担持し
たセファロースカラムでのアフィニティークロマトグラ
フィによって実施する。この操作に適した温度は約４℃
である。

本発明に従えば、大体において約ＩＥｉ０，０００〜２
００．０００の分子量及び次の重量％組成分析値：蛋白
質４５．２±２．３％；Ｎ−アセチルグルコサミン１９
．１±０．９５％；マンノース６．６±０．３３％；フ
コース７．６±０．３８％；ガラクトース９．３±０．
４７％；及びシアル酸１２．３±０．６２％を有し、確
立されている癌胚抗原物質と同様な免疫活性を持った癌
胚抗原も提供される。

［実施例］ Ｌ−葦思」 癌胚抗原を結腸腺癌患者から得られた確立されている細
胞系から得た細胞によって本発明に従って製造する。適
切な細胞系は、例えば、寄託番号ＡＴＣＣＧＣＬ　２２
９　ＬｏＶｏ　　、　　ＡＴＣＣＣＣＬ　２３３５Ｗ１
１１６　　、ＡＴＣＣＣＣＬ　２３５５Ｗ８３７及びＡ
ＴＣＩＩＩ：　ＣＣＬ　２３８　ＳＷ　１４１？でアメ
リカンｅタイプ・カルシチャー拳コレクション（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ）に寄託されているもの並びにエクスペリメン
タル・セル・バイオロジー、４６巻、２２０〜２３０ペ
ージ（１９７８年）にヤニブ（Ｙａｎｉマ）等によって
記載されたものである０本発明の実施態様において好ま
しい細胞系は、この生菌試料がイスラエル国、ネス・ジ
オナ郵便局私書箱１９号のイスラエル生物学研究所（Ｉ
ｓｒａｅｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ）から一般に入手できるＨ
ｕＣＣＬ−１４Ａと言える。これらの細胞は固定依存性
細胞であり、固体表面に付着している時だけ生長する。

Ｉｌ、　　　ｉ　　　スト・りの″。

細胞を所望の重版単層培養容器（例えば、Ｔ−フラスコ
、ルー瓶又は他の単層培養容器）中で生長させる。１０
０ｃ＋ｓ２の表面積当たり、少なくとも５ｘ１０６の細
胞の接種が必要である。培地は１０４０部のＲＰＭＩ　
　Ｎａ、１６４０．２００部の炭酸水素ナトリウム及び
８部のネオマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン
、ゲンタマイシン又は他の抗生物質から成る。水酸化ナ
トリウムでｐＨ７，２にし、１０％胎児ウシ血清を追加
する。

培地を炭酸ガス培養器（５〜１０％の二酸化炭素を含有
する圧縮空気）中で３７℃に保持する。

３〜５日培養した後、細胞の全面生長が観察された時に
、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液［塩化ナトリウム８
．０、塩化カリウム０．４．グルコース１．０、炭酸水
素ナトリウム０．５８、トリプシン（１：　３００）０
．５及びＥＤＴＡｏ、２ｇ／ｊｌコのようなトリプシン
化溶液を用いて表面培養容器から回収する。上澄み液の
デカンテーション後、各１００１の単層培地に０．２１
のトリプシン化溶液を加える。

細胞を１０１のＲＰＭＩ　　Ｎｏ、１６４０及び追加の
１０％胎児ウシ血清とともに５０ｔｊの円錐形遠心分離
管に入れる。管を１０分間５００ｇで遠心分離に処し、
上澄み液をデカンテーションする。細胞沈殿物を以後の
操作のために保持する。

各細胞沈殿物に、１Ｏｆ酸ｊのＲＰＭＩ　　Ｎｏ、１６
４０培地及び追加の２０％胎児ウシ血清を加える。

細胞濃度を２〜５ｘ１０ｂＭＢ胞／ｌｌＬｉニ希釈する
。

この細胞懸濁液に、ジメチルスルホキシドを最終濃度１
０．７％（マ／マ）まで加える。３〜４社ずつ分けた細
胞懸濁液を使用に供するまで一７０℃又は液体窒素中で
凍結しておく、凍結は、温度が−５〜−１０℃になるま
で、約１”０部分の冷却速度で最初はゆっくりと行ない
、次いで急速冷凍する。

ＩＩｌ、　　ｉ　　　ストークの ストックから細胞を培養するために、ストックの入って
いる管を３７°Ｃの水浴で急速に解凍する。解凍した細
胞懸濁液に、１０％胎児ウシ血清を追加された５〜７−
の予め加温（３７℃　）したＲＰＭＩ　　Ｎｏ、１６４
０を加える。細胞懸濁液を１０分間５００ｇで遠心分離
し、上澄み液をデカンテーションし、次いで各細胞沈殿
物を１０％胎児ウシ血清を追加された１０１０−ｌ５の
ＲＰ１４ＩＮｏ、１６４０中に再懸濁させる。細胞懸濁
液を表面積７５ｃ＋ｓ２のＴ−フラスコ中に接種する。

培地の容積を同じ培地で２５−に調整する０次いで、培
地を３日間、即ち全面生長になるまでＣＯ２下３７℃で
培養する。上澄み液を毎日新鮮な培地と交換する。培養
物を微粒子担体培養系の癌胚抗原生産系を製造するため
に使用する。

ｒｖ、　　　癌　　　　　　−、 癌胚抗原生産系において、細胞をスビンナーフ９１＝Ｉ
ｃｌ＝Ｉｔ’エエ、□ワ、ツー、。１ｏ１１あ４、つ、
□わ□□、よ、□□　　　　　：る。　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１□ （１）　癌胚抗原生産用微粒子担体　　　　　　　　　
　　　　　　１数種の微粒子担体を癌胚抗原生産性細胞
の生長及び癌胚抗原の分泌の観点から最適の担体を選択
するために試験した。試験した微粒子担体はファーマシ
ア社製のｒ　Ｃｙｔｏｄｅｘ−Ｉ　Ｊ及びｒｃｙｔｏｄ
ｅ！−３４，フロー・ラボラトリーズ社（ＦＩＯＩＩ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製のｒＳｕｐｅｒＢｅａｄ
ｓＪ　、ヌンク社（Ｎｕｎｃ）製のｒ　Ｂｉｏｓｉｌｏ
ｎ」並びにワットマン社（ｌｄｈ６ｔｍａｎ）製のｒＤ
Ｅ−５２Ｊ及びｒＤＥ−５３Ｊであった。ＤＥ−５３が
細胞生長及び癌胚抗原分泌の両方の点で最良であるのが
わかった。ＤＥ−５３は２　　ｍｅｑ／　ｇ　（乾燥物
）の交換容量を有する微細、硬質及び円筒状のＤＥＡＥ
−セルロース陰イオン交換体である。このＤＥ−５３を
使用する前に予め脚間させた。

（２）　微粒子担体の予ｍ膨潤 １５ｇのＤＥ−５３に、１ｏｏａｊのｐＨ７，２のリン
酸塩緩衝液（ＰＢＳ）を加えた。この緩衝液は８．０ｇ
／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｇ／ｌの塩化カリウム、
１．１５ｇ／ｌのリン酸水素二ナトリウム及び０．２ｇ
／ｌのリン酸二水素カリウムを含んでいた。ＤＥ−５３
を再懸濁し、その後沈降させ、この工程を二度繰返した
。懸濁液のｐＨを各回７．２に調整した。懸濁液の容量
をリン酸＃１緩衝液で１００ｄにした。この懸濁液を予
めシリコーン塗布した瓶中、１２１℃の蒸気で２０分間
滅菌した。滅菌したＤＢ−５３懸濁液を使用するまで４
℃で保存した。

（３）　癌胚抗原生産系の増殖 これは次の通りに段階的に行なった。

工程１・・・単層培地における細胞の増殖この工程を重
数のｉ層培養用容器１例えばＴ−フラスコ（表面ａ２５
．７５．１５０ｃｍ２）。

ルー瓶（表面積２００ｃ■ｌ）又は他の単層培養用容器
中で行なった。そのような全ての容器中の最初の細胞濃
度は約１ｘ１０５細胞／ｃ１１２であり、生長培地は、
表面積１００ｃ１１２当たり２５ｆ酸１の量で添加され
た１０％胎児ウシ血清を追加したＲＰＭＩ　　Ｎｏ、１
６４０であった。細胞源はストックから解凍された単層
又は微粒子担体培養細胞のいずれであってもよい、培地
は、３〜５日間、即ち全面生長が達成されるまで、炭酸
ガス下３７°Ｃで培養した。

固体表面からの細胞の回収を培地の０．２ｄ／ｄの量の
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液でトリプシン化することによ
って行なう、トリプシン化した細胞懸′ｓＪ液の１　ｍ
ｌ／ｄの１０％胎児ウシ血清を追加したＲＰＭＩ　　Ｎ
ｏ、１６４０培地を添加し、この懸濁液を１０分間５０
０ｇで遠心分離した。上澄み液をデカンテーションし、
残留細胞沈殿物を、次の増殖工程の癌胚抗原を生産する
ための、細胞を培養するための種細胞として後の操作の
ために保存した。

工程２・・・１リツトルの微粒子担体撹拌式培養容器中
での細胞の増殖 微粒子担体の懸濁液（７Ｉｌｊ）を加え、最終培地容量
を１００１にする。それぞれ１５０〜２００ｃａ＋２の
表面積を有する５〜１０個のフラスコから回収したトリ
プシン化細胞を１リットル微粒子担体培養の種細胞とし
て使用する。最初の生長培地は１０％胎児ウシ血清を追
加したＲＰＭＩ　　Ｈａ。

１６４０培地である。微粒子担体培地を３０〜５０　ｒ
、ｐ、ｍ、の速度での連続磁気攪拌下に培養した。（こ
れらの条件の下に、細胞が微粒子担体内での多層生長し
て、微粒子担体と細胞との集塊を形成することがわかっ
た）。細胞を、核を計数するす７７オード（Ｓａｎｆｏ
ｒｄ）法［Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｉｎ５ｔ、、１１巻、７
７３ページ（１９５１年）］を用いて、毎日計数した。

この目的のために、細胞を３７℃に予め加温した１、０
ｇ／ｌのクリスタルバイオレット及び４２．０ｇ／ｌの
クエン酸を含有する溶液で微粒子担体／細胞集塊を処理
することによって回収し、同温度で１時間培養する。こ
の懸濁液を細胞から核を遊離するために十分に混合した
。計数された核の数が微粒子担体培地中の細胞の数を示
した。ｉ胚抗原の検定のために、培地の毎日の攪拌を停
止し、微粒子担体を沈降させ、上澄み試料を回収した。

工程３・・・３〜１０日後に、微粒子担体上に細胞が全
面生長し、次いで、癌胚抗原生産培地を増量して、スピ
ンナーフラスコ中６〜８リットルの微粒子担体培地にし
た。６〜８リツトルの微粒子担体培地にするために、各
１リツトルの二つから四つの微粒子担体培地を一緒にし
た。この所望の容量を１０％胎児ウシ血清を追加された
ＲＰＭＩＮｏ、１６４０培地を加えることによって達成
した。必要量の新しい予４ａ膨潤させた微粒子担体も加
えた。この培地を０．５〜２リットル／分の速度で５％
炭酸ガスと圧縮空気との混合ガスで底部から曝気した。

培地を３０〜６０　ｒ、ｐ、ｍ、で６！１気撹拌した。

細胞の計数を毎日行ない、微粒子担体上に細胞の全面生
長が達成した後、上澄み液を癌胚抗原の検定及び精製の
ために収穫した。

上澄み液を収穫するために、微粒子担体培地を３０〜６
０分間攪拌せずに培養し、細胞／微粒子担体集塊を沈殿
させ、集塊を含まない上澄み液の３０〜６０％を収穫し
た。粗癌胚抗原を含む上澄み液を後の操作（例えば、濃
縮及び精製）に必要となるまで一２０℃で保存した。収
穫した上澄み液に相当する量の新鮮な生長用培地を培養
容器中に加え、細胞生長を続行した。６リツトル容器に
おける収穫は２〜３日毎に行なう。

培地が古くなり、全面生長がほぼ達成されると、追加し
た生長用培地の胎児ウシ血清は２％に低下する。微粒子
担体細胞培養における典型的な細胞数は、（生産の規模
を問わず）、初期細胞濃度において１〜２ｘ１０５細胞
／１１ｊであり、全面生長時において３〜４ｘ１０６細
胞／Ｉｌｊである。

（４）　　Ｐ、胚抗原の精製 これは次の工程に従って行なわれた。

工程１・・・−２０°Ｃで凍結させた培養上澄み液の形
態の粗癌胚抗原を４．２２又は３７°Ｃで解凍してから
一緒にして３０〜１００リツトルのバッジにした。容器
中に入れられたこのバッチに、過塩素酸を１モルの濃度
まで添加し、この溶液を２０分間十分に混合した。非特
異性蛋白質は沈殿したが、癌胚抗原は溶液に溶解したま
まであった。

工程２・・・工程１の精製物を５０００ｇで連続的に遠
心分離し、沈殿物を捨て、上澄み液を回収した。上澄み
液のｐＨを水酸化アンモニウムで７．０に調整した。

工程３・・・癌胚抗原を、１００．０００ダルトン用の
膜を用い、４°Ｃで回分式又は連続的に限外濾過するこ
とによって上記中和した上澄み液から濃縮した。

粗癌胚抗原が２〜４リツトルの量に濃縮された時に、こ
の工程を終了した。

工程４・・・濃縮した粗癌胚抗原の脱塩をイオン交換水
を用いて、閉鎖系で行なった。溶液の伝導率が１０　ｐ
Ｍｈｏになった時に、脱塩を終了した。この濃縮脱塩癌
胚抗原の量は２〜４リツトルであった。

工程５・・・不要の非特異性蛋白質の沈殿を合計癌胚抗
原の３１５　ｇ／１．まで硫酸アンモニウムを連続的に
添加することによって行なった。塩が全て溶解するまで
、磁気撹拌を行なったａｆｌＡ縮硫酸全硫酸することに
よって溶液をｐＨ２に酸性化した。

磁気攪拌を４℃で１４〜２０時間続け１次いで、混合液
を４℃において３０分間５０００ｇで遠心分離した。不
要の蛋白質を含む沈殿物を除去し、所望の癌胚抗原を含
有する上澄み液を保存した。

工程６・・・癌胚抗原を、ｔｏｏ、ｏｏｏダルトン用の
膜を用い、４°Ｃで１４〜１８時間回分式に限外濾過す
ることによって上澄み液から濃縮した。

工程７・・・濃縮癌胚抗原の脱塩を４℃においてリン酸
塩緩衝液で行なった。溶液の伝導率がリン酸塩緩衝液の
伝導率と同じになった時に、脱塩を終了した。この工程
の所要時間は１４〜１８時間であった。工程５〜７を終
了した後の癌胚抗原溶液の量は約１リツトルであった。

後の操作まで、この溶液を一２０℃で保存した。

工程８・・・モノクローン抗癌胚抗原アフィニティーク
ロマトグラフィーカラムで処理する前の癌胚抗原の精製 凍結癌胚抗原を４℃で解凍し、残留沈殿物を４℃におい
て３０分間５０００ｇで遠心分離することによって除去
し、生成物を、１００，０００ダルトン用の膜を用いて
１４〜１８時間４℃において回分式に限外濾過にかけ、
最後に、３０分間ｔｏ　、ｏｏ。

ｇで遠心分離にかけて、残留沈殿物を除去する。

工程９・・・モノクローン抗体の生産 ハイプリドーマ細胞分泌モノクローン抗癌胚抗原抗体を
、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスティン（旧１ｓ
ｔｅｉｎ）による細胞融合法［ネーチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）　、　２５６巻、４９６〜４９７ページ（１９７５
年）］によって生産した。二つのモノクロ−抗体をアフ
ィニティー精製操作用に選択した。以前は、他の細胞系
からのモノクローン抗体が癌胚抗原精製に同様に使用さ
れた［例えば、口ジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）等、Ｂｒ、
　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　、　４４巻、３７１ページ（１
９８１年）及びビュフェガー（Ｂｕｃｈｅｇｇｅｒ）等
、プロテインズ・アンド拳リレーティド・サブジェクツ
（Ｐｒｏｔｅｉｎ、ｓ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄＳｕｂ
ｊｅｃｔｓ）、　（編者：ピータース（Ｐｅｅｔｅｒｓ
）、ブリュッセル）、２８巻、５１１ページ（１９８０
年）参照コ。

工程１０・・・マウスのハイブリトーチの生長及びモノ
クローン抗体の単離 ハイブリドーマ細胞の注射予定日の少なくとも７日前に
、ＢａＡｂ／ｃマウスに０．５ａＪ（７）免疫抑制物質
であるブリスタン、即ち２，８，１０．１４−テトラメ
チルペンタデカンを腹腔内注射した０次いで、ハイブリ
ドーマ細胞（１０ら〜ｉｏ’細胞／マウス）をｎａｚｂ
／ｃマウスの、富抗体腹水液を発生する腹腔内に注射し
た。細胞を注射した７〜１５日後、マウスはかなりの腹
部腫脹を示したので、腹水液を１８．８ｘ　１．５滅菌
針を用いて試験管に取出した。引続き、腹水液を凝固さ
せ、ガラスウールを介して１遇することによってフィブ
リンから分離して透明な液にする。

工程１１・・・ｆ白質−Ａ−セファロースでのアフィニ
ティー分離 蛋白質−八−セファロース　ＣＬ４Ｂ（ウプサラのファ
ーマシア社製）を０．０２％のアジ化ナトリウムを含有
するｐＨ８，０の０．０５Ｍトリス／Ｑ、１５Ｍ塩化ナ
トリウム溶液（緩衝液「ａ」）中で膨潤させる。この樹
脂を小径のカラム、即ち底部にグラスウールを詰めた１
０膜ノのシリンジに充填する。腹水液を４℃で１〜２時
間時間緩衝液封して透析する。透析物を１０，０００ｇ
で遠心分離して、変性蛋白質を沈殿させる。上澄み液を
上記カラム（約５０ｍｇ抗体容量）に供給し、結合しな
い蛋白質を緩衝液ａで洗浄する（紫外線モニターを使用
して上記溶離を確認することができる）、結合蛋白質の
分画を次の勾配溶離用展開液を用いて溶離する。初期勾
配溶離用緩衝液ｒｂＪは０．０２％のアジ化ナトリウム
を含有する０、１Ｍトリス１０．１５Ｍ塩化ナトリウム
溶液から成り、１Ｍ酢酸を滴下してｐＨ２にする。最終
勾配溶離用緩衝液ｒｃＪは０．０２％のアジ化ナトリウ
ムを含有するＰＨ３の０．１Ｍ酢酸／酢酸ナトリウム十
〇、１５Ｍ塩化ナトリウム溶液から成る。各１００１Ｉ
Ｉｊの緩衝液ａ及びｂを利用する。それぞれ２ｔｊの分
画を中和用の０．４１のｐＨ８のＩＭ）リスを含有する
試験管中に溶離する。ＩｇＧ２ｂサブクラスのものであ
るモノクローン抗癌胚抗原抗体は３番目の分画に入って
いる。カラムを緩衝液Ｃで洗浄することによって再生し
、次いで、緩衝液ａで再平衡させる。

工程１２・・・モノクローン抗癌胚抗原抗体をセファロ
ースに担持したアフィニティーカラムの調製上記で精製
したモノクローン抗癌胚抗原抗体を濃縮してから、「ア
ミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　Ｊ　ＵＭ　−３０膜を用いて
限外濾過容器中で混合緩衝液（ｐＨ８，３の０．１Ｍ炭
酸水素ナトリウム１０．５　Ｍ塩化ナトリウム）に対し
て透析する。臭化シアンで活性化したセファロース　４
Ｂ（ファーマシア社製）３ｇを２００１の１Ｍ塩酸中で
１５分間処理して膨潤させ、１０００ｇで７分間遠心分
離し、混合緩衝液で洗浄してから、１０．！１ｏａｆの
膨潤樹脂を含めて最終的に２０−にする、これに、５０
〜１００■ｇの混合緩衝液中の精製モノクローン抗癌胚
抗原抗体を添加し、容量をそれで４５膜ｍに調整する。

この試験管内の調整液を室温で２時間回転攪拌機（ｈｅ
ａｄｏｖｅｒ　ｅｎｄ　ｒｏｔａｔｏｒ）を用いてゆっ
くり混合する。

上記樹脂をｉｏｏｏｇで７分間遠心分離する。

光学密度（ＯＤ）を２８０ｎｍで測定し、蛋白質含有量
（９０％以上のモノクローン抗癌胚抗原抗体が樹脂に結
合されたままであるべきである）を決定した。モノクロ
ーン抗癌胚抗原抗体を結合しない反応基の反応を防ぐた
めに、樹脂沈殿物を室温で２時間４０ｄのｐＨ８のグリ
シン緩衝液中に懸濁させる。樹脂に非共宥結合的に付着
したモノクローン抗癌胚抗原抗体を除去するために、樹
脂を０．５Ｍの塩化ナトリウムを含有する５０−のｐＨ
４の０．１Ｍ酢酸塩緩衝液で洗浄し、引続き５０ｄの混
合緩衝液で洗浄する。この工程を５回繰返す。

工程１３・・・癌胚抗原の７フイニテイー精製１０ｍｇ
の癌胚抗原を含有するリン酸塩緩衝溶液をｌｏｏｍｊに
濃縮する。４°Ｃで２４〜２８時間回転攪拌しながら、
この溶液をモノクローン抗癌胚抗原抗体を担持したセフ
ァロースで培養し、この樹脂をカラム（１ｘ１５ｃｍ）
に入れ、蛋白質がそれ以上溶離しなくなるまで、比例ポ
ンプを用いて、リン酸塩緩衝液、０，５Ｍ塩化ナトリウ
ム及び０．０２％アジ化ナトリウムで洗浄する０次いで
、カラムを０．５Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ２
，５の０．０２５Ｍクリシン−塩酩緩衝液で溶離する。

（下記Ｖｉｉｉにおいてエリザ法によって測定した）癌
胚抗原を含有する各１．６ａｊの分画を０．４ｍ１のｐ
Ｈ８の１Ｍグリシン緩衝液を含む試験管に集める。

（５）　癌胚抗原物質の分析 Ａ、　癌胚抗原のヨウ素化 癌胚抗原をグリーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）等の
方法Ｃバイオケミカル舎ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｊ。

８９巻、１１４ページ（１９７３年）〕の改良法によっ
て標識した。引続き、細いガラス被覆された金属棒を備
えた小径（１ｘ３ｃ■）の共栓付瓶に、次の各成分、即
ち２５μのｐ）１７．４の０．２５Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、１０〜２０ｕｊの癌胚抗原０．４％炭酸水素ナ
トリウム溶液（５ルｇの癌胚抗原を含有する）、１０μ
のキャリヤーなし”　Ｉ　　（１ｍＣｉ）　［アメルシ
ャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製］及び１５μの０．０１
％クロラミンＴを溶解したばかりの水溶液、を添加した
。室温で６分間攪拌した後、反応を１０１Ｌｊの０．１
％亜硫醜水素ナトリウム溶液によって終了させた。１分
後、５０μのヨウ化カリウム水溶液（１６，６膳ｇ／ｄ
）と１３０μのｐＨ７，７の０．２５Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液を加え１次いでヨウ素化された癌胚抗原を、１
０−の使捨てピペット内に充填され、かつｐＨ７，４の
０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液及び２％血清アルブ
ミンで平衡にされた微細なセファデックスＧ−２５カラ
ムでゲル濾過することによって遊離ヨウ化物から分離し
た。０．５ｔＪの溶離試料を０、ｌａｊの２％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を含有する試験管にそれぞ
れ入れた。放射性蛋白質を含有する試験管の溶液を集め
、０．２％ウシ血清アルブミン反応用緩衝液で約１０’
ｃｐ■／１に希釈してから、０．５ｄずつ分けて凍結貯
蔵した。標識された癌胚抗原の比活性は３０〜６０Ｃｉ
／ｕ−ｇの範囲であった。結合活性は６ｉＪｌまで安定
のままであった。

Ｂ、　細胞系癌胚抗原の識別 癌胚抗原物質を上記［従来の技術］において述べた基準
に従って識別する。癌胚抗原のアミノ酸組成及び癌胚抗
原の全組成をそれぞれ下記の表１及び表２に示す。

（ｉ）　　アミノ酸分析をＤ−５００型プロネツクス（
Ｐｒｏｎｅｔ）分析装置を用いて、スティン（Ｓｔｅ　
ｉｎ）及びモーア（Ｍｏｏ　ｒｅ）の方法に従って実施
した。試料をそれぞれ減圧試験管内で１１０℃において
２１時間６ＮｔＪｌ酸を用いて加水分解した。この際、
内部標準物としてノイロイシンを添加した。

（１１）　　全炭水化物含有量をフェノール／硫酸法に
よって４１１定した。

友−」 癌胚抗原（ＣＥ　Ａ）のアミノ酸組成（モル％）Ｌ主ヱ
ｊ　　見旦人ユＳ１工　見旦へＡ産胞五工ＡＳＰ　　　
　　１３．５　　　　１３．ＩＴＨＲ８，５９８，２６ ＳＥＲ１０，２６１０，７２ ＧＬＵ　　　　　１０．２６　　　１０．５３ＰＲＯ７
，６１７，３７ ＧＬＹ　　　　　　５．８９　　　　６．９２ＡＬＡ　
　　　　　６．２１　　　　６．３８０．５Ｃｙｓｔ、
　　　　　ｌ　、　９０　　　　１　、３５ＶＡＬ　　
　　　　６　、７７　　　　６　、２７ＭＥＴ　　　　
　　１．２　　　　　０．９ＩＬＥ　　　　　　３．２
　　　　　３．２ＬＥＵ　　　　　　７．４　　　　　
７．４ＴＹＲ３，５０４，Ｉ ＰＨＥ　　　　　　２．２１　　　　２．５４ＨＩＳ　
　　　　　Ｌ、７７　　　　１．７ＬＬＹＳ　　　　　
　６．６　　　　　４．ＩＡＲＧ　　　　　　４．３　
　　　．３．７９注）　　０．５Ｃｙｓｔ、及びメチオ
ニンは、過ギ酸で酸化した後それぞれシスティン酸及び
メチオニンスルホンとして測定した。

人−ヱ 癌胚抗原（ＣＥＡ）の組成（重量％） φ二人ユ見丑ｌ　旦１厭胞】工 蛋白質　　　　　４７　、７　　　　４５　、２炭水化
物− Ｎ−ＡＧＡ”　　　２６．６　　　　１９．１マンノー
ス　　　　５．９　　　　　６．６フコース　　　　　
７．５　　　　　７．６ガラクトース　　１０．４　　
　　　９．３シアル酸　　　　　２．０　　　　１２．
３（ｉｉｉ）　　アミノ糖を、７７ウコネツト（Ｆａｕ
ｃａｎｎｅｔ）等の方法［アナリティカル・バイオケミ
ストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、　９１
巻、４０３ページ（１９７８年）］に従って１６０℃で
３時間４Ｎ塩酸を用いて加水分解した後、アミノ酸分析
によって測定した。

（ｉマ）　中性糖分析は、試料を１００℃で２時間２Ｎ
トリフルオロ酢酸で加水分解した後実施した。糖を、リ
ー（Ｌｅｅ）によって記載された方法［メソッド番イン
・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ。

Ｅｎｚｙ＋ｎｏ１．）　、　２８巻、６３ページ（１９
７２年）］と同様の条件下に硼酸塩緩衝液中での陰イオ
ン交換クロマトグラフィーによって測定した。

（Ｖ）　　　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気ｈｖＪ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）　をｔ＜イオ
ラッド社（ＢｉｏＲａｄ）によって供給された装置及び
薬品で行なった。レムリー（Ｌａｅ＋ｗｌｉ）の緩衝液
系［ネーチ−？　−（Ｎａｔｕｒｅ）、７２７巻、６９
０ページ（１９７０年）］中の５〜２０％の線状ポリア
クリルアミド勾配を有する０、７５ｍ＋＊の厚さのゲル
板で行なった。ゲルを固定し、４０％（マハ）メタノー
ルと１０％（マ／マ）酢酸との溶液中の０，２％（賛ハ
）クーマシープルー　Ｇ−２５０で呈色し。

７％メタノール、７％酢酸及び１％（マ／マ）グリセリ
ンから成る溶液中で拡散することによって脱色した０分
子量標識物質はファーマシ７社のものを使用した。１２
５工標識された癌胚抗原をコダック社のフィルムを用い
て乾燥ゲルのオートラジオグラフィーによって検出した
。

（マｌ）　結合曲線（第１図） 一定量の１２Ｉ−標識癌胚抗原の結合を連続希釈率した
抗血清において測定して、特定の標識された抗原製剤に
関し、抗血清の力価及び結合の程度を判断し、かつその
免疫活性（転移癌胚抗原に対する細胞系癌胚抗原）を評
価する。

（ａ）　　ウマの確立した特異性及び力価の抗癌胚抗原
ＩｇＧを０．５％（マ／マ）の同一種の正常血清を含有
するｐＨ８，５の０．０５Ｍ硼酸−硼砂緩衝液中で希釈
する。各検定管は５００μの希釈抗血清（ブランクの場
合には、単に正常血清）を含んでいる。

（ｂ）　　　１００μの約２０．０００　ｃｐ＋ｓ凰２
５Ｉ−標識癌胚抗原希釈溶液を加える。３７℃で２時間
ゆっくり振盪した後、１５０μの（予備滴定によって過
剰であると確認された）希釈されていない抗ＩｇＧ抗血
清を加える。３７℃で１時間及び水浴で１時間（又は４
℃で一晩）放置した後、沈殿物を４℃において２５分間
８０００　ｇ　（ＳｏｒｖａｌｌＨ５４０−ター）で遠
心分離することによって回収する。この沈殿物を計数す
る。

（Ｃ）　　抗体の比結合率を次式に従って各連続希釈液
に対して計算する。

結合％＝　Ｃ（Ｂ−Ｎ）　／　（Ｔ−Ｎ）　］　ｘｌ　
００（Ｂ＝管のｃｐｍ、Ｎ＝ニブランクびＴ＝全カウン
ト数） （ｄ）　　抗原／抗体複合体を固定Ｓ、　ａｕｒｅｕｓ
Ｃｏｗａｎ　Ｉによっても沈殿させることができる。

（ｅ）　　通常、９０％以上の放射性物質を沈殿し、非
特異性の抗原のカウント数は全体の４〜８％を示す、標
識された物質は３〜４週間後に通常廃棄される。二種類
の抗原物質の類似性を最大結合量並びに得られた力価に
よって判定する。

（マｉｉ）　　阻害曲線（第２図） （ａ）　　阻害剤が存在する場合に、最大結合率の５０
％が生じるような抗血清の希釈率で、阻害分析を行なう
。

（ｂ）　　抗原を最大阻害率、曲線の形状及び５０％の
阻害を示す濃度に関して比較する。

（Ｃ）　　各検定管は５００μの希釈抗血清及び１〜２
００ｎｇ／ｍｌの非標識癌胚抗原を含有する５０μの硼
酸−硼砂緩衝希釈液（結合曲線と比較せよ）を含有する
。ブランク管は希釈液だけを含み、非特異的な沈殿を示
す、抗血清を含有するが、非標識癌胚抗原を含有しない
管は阻害剤が存在しない場合に最大の沈殿を示す。

（ｄ）　　標準転移癌胚抗原を、正常ウマ血清（結合曲
線と比較せよ）及び０．０１％のチオメルサール（ｔｈ
ｉｏｍｅｒｓａｌ）を含有する硼酸／硼砂緩衝液中１．
５６．３．１２．６．２５、■２．５．２５．５０．１
００及び２００ｎｇ／−の濃度で調製し、これらの調製
物を４°Ｃで１力月間保存する。

（ｅ）　　検定すべき未知量の癌胚抗原を含有する試料
の場合、標準癌胚抗原の代りに５０１Ｌｊの適当な希釈
液を加える。

（ｆ）　　全ての管を３７℃で２時間培養し、引続きｔ
ｏｏｇの約２０，０００　ｃｐｓ１２５Ｉ−標識癌胚抗
原硼酸／硼砂緩衝溶液（正常ウマ血清を含有する）を添
加する。

（ｇ）　　培養に引続き、第二の抗体の添加及び沈殿物
の回収を上記結合曲線に関して述べたように行なう。

（ｈ）　　各標準又は未知の抗原に関する阻害率を次式
に従って計算する。

阻害％＝　［１−（Ｂ−Ｎ）／（Ｂｏ　−Ｎ）］　ｘ　
ｌ　Ｏ０（Ｂｏ　＝非標識癌胚抗原の非存在下における
結合数） （マ１１１）癌胚抗原のエリザ法による測定癌胚抗原儂
度を「二重サンドウィッチ（ｄｏｕｂｌｅｓａｎｄｗｉ
ｃｈ）　Ｊ法によって測定する。

（ａ）　　９６個の穴を有するポリ塩化ビニル製の微量
液体反応用平板［ダイナチク社（［］ｙ１６ｔｅｃｈ）
製］にポリクローン抗癌胚抗原ＩｇＧ［０，９％の塩化
ナトリウムを含有するＰＨ７，６の５０ｓＭ）リスー塩
酸緩衝渣（ＴＳ）中１０μ／ｆｆ１Ｊ、即ち１５０ＩＬ
ｊ／穴の濃度］を被覆し、湿潤室で３時間放置する。過
剰の抗血清を除去し、各穴をＴＳＳ緩衝液３回洗浄し、
次いで４℃において一晩１５０μ／穴のＴＳＡ　（１層
ｇ／−のウシ血清アルブミンを含有するＴＳ緩衝液）で
処理することによってブロック（ｂｌｏｃｋ）する。

（ｂ）　　癌胚抗原を含有する全ての試料を０．０５％
のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　−２０を含有するＴＳＡ　
（ＴＳＡＴ）で１〜３０ｍｇ／−に新たに希釈する。高
濃度の蛋白質（即ち血清）を含有する試料をｐＨ５，０
の０．２Ｍ酢酸ナトリウムで抽出し、０．５ｆ酸Ｊの抽
出物を１Ｉｌｊの緩衝液に添加し、７０’０で１０分間
放置し、引続き１２，０００ｇで遠心分離して、上澄み
液を分析のために回収する。

（ｃ）　　標準癌胚抗原溶液を純粋癌胚抗原から調製し
、市販の分析装置（Ａｂｂｏｔｔ　ＣＥＡ−ＥＩＡ）と
比較して較正する。全ての希釈をＴＳＡＴで行なう、０
．０１％のチオメルサールが添加されている場合、Ｏ１
２，５，５，１０，１７，５及び２０ｎｇ／−の癌胚抗
原を含有する標準液は４℃で少なくとも２力月間安定で
ある。ストック溶液は１１００ｐ−／ｄの癌胚抗原を含
有する緩衝液であり、凍結保存（−２０℃のアリコート
）される、希釈された標準液は凍結すべきでない。

（ｄ）　　分析を二回行なう、１００μの癌胚抗原（標
準及び試料）を各反応平板の穴に添加する。３７℃で９
０分間放置した後、抗原を除去し、穴をＴＳＴで３回洗
浄する。

、。）１００ｕａつ＝ヮ□□、３ｏ１ ＣＴＳＡＴ中約１０　ＪＬｇ／ａｌ）を各穴に添加する
。

３７°Ｃで９０分間培養した後、穴をＴＳＡＴで３回洗
浄する。

（ｆ）　　ｔｏｏμのホースラディツシュペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）に結合したウサギ抗ウマＩｇＧ［マイル
ズ社（Ｍｉｌｅｓ）製］を添加（ＴＳＡＴで１　：　２
０００〜５０００に希釈）し、引続き３７℃で４０分間
培養し次いでＴＳＴで３回洗浄する。

（ｇ）　　１００μの基質（ＡＢＴＳ十過酸化水素）を
各穴（ブランクは除く）に添加し、室温で２０分間培養
する。上記ＡＢＴＳは、５０μの過酸化水素（０，３％
、新たに調製したもの）を含有する５−のクエン酸塩緩
衝液中に１ｍｇ溶解することによって新たに調製された
２、２゛−アジノジ（３−エチルベンゼンチオリンスル
ホン酸）である、クエン酸塩緩衝液は０．２Ｍリン酸酸
水素ナナトリウム滴下してｐＨ４にされた０、１Ｍクエ
ン酸である。

（ｈ）　　各穴の内容物を新しい微量液体反応用平板に
移し、吸光度をエリサリーダー（ダイナチク社製）で、
４０５ｎｍにおいて測定する。

（ｉ）　　癌胚抗原の儂度を標準曲線から計算する。

上記において、ｌ）全ての希釈に、二度蒸留した水を使
用し、２）バッチの量を変える場合は、全ての抗血清を
ボックス（ｂｏｘ）滴定によって予め滴定しておくべき
であると言うことに留意されたい。

なお、組織培養で培養されたＨｕＣＣＬ−１４Ａ細胞系
の培養物から得た癌胚抗原（ＣＥＡ）の精製条件及び結
果を次の表Ａに示す。

入−込 粗培地　　　　　　　０．０ＯＢ　　　　　１００ＰＣ
Ａ抽出　　　　　　　０．０４　　　　　　［ｉ０〜８
０硫酸アンモニウム　　　０．５　　　　　５０精製係
数　　　　１８，７００ １リツトルの培養物は０．２〜０．８鳳ｇの粗ＣＥＡを
含［発明の効果］ 以上詳述したように本発明の癌胚抗原の製造方法によれ
ば、有用な癌胚抗原を極めて能率よく的確に製造するこ
とができる。

また、上記方法により製造された本発明の癌腫細胞によ
れば、その機能を十分に発揮できる利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は癌胚抗原の抗体との結合度を示す結合曲線であ
り、第２図は癌胚抗原の抗原との結合の阻害度を示す阻
害曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）癌胚抗原生産性細胞系を単層培地中で培養し； 少なくとも一回の追加の培養工程において、前記培地を
   連続的に攪拌しながら、前記細胞系を微粒子担体上でさ
   らに培養し； 前記細胞系によって分泌された所望の癌胚抗原を含有す
   る培地を収穫し；及び ヨウ素化品質をもった製品が得られるまで前記癌胚抗原
   を精製する； 各工程から成ることを特徴とする癌胚抗原の製造方法。 （２）回分式操作として行なわれる特許請求の範囲第１
   項に記載の癌胚抗原の製造方法。 （３）連続操作として行なわれる特許請求の範囲第１項
   に記載の癌胚抗原の製造方法。 （４）少なくとも前記追加の培養工程及び精製工程が連
   続操作の一部として行なわれる特許請求の範囲第１項に
   記載の癌胚抗原の製造方法。 （５）前記収穫工程が培養物の一部だけに行なわれ、か
   つ回収される該培養物が同量の新鮮な培地によって置換
   えられる特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
   か一つに記載の癌胚抗原の製造方法。 （６）前記収穫工程が数日の間隔で周期的に繰返される
   特許請求の範囲第５項に記載の癌胚抗原の製造方法。 （７）前記微粒子担体がセルロースから得られた微粒子
   担体である特許請求の範囲第１項から第６項までのいず
   れか一つに記載の癌胚抗原の製造方法。 （８）前記微粒子担体が硬質で、かつ円筒状である特許
   請求の範囲第１項から第７項までのいずれか一つに記載
   の癌胚抗原の製造方法。 （９）前記微粒子担体が硬質で、かつ球状である特許請
   求の範囲第１項から第７項までのいずれか一つに記載の
   癌胚抗原の製造方法。 （１０）前記単層培養工程が３〜５日間、即ち全面生長
   が達成されるまで行なわれる特許請求の範囲第１項から
   第９項までののいずれか一つに記載の癌胚抗原の製造方
   法。 （１１）前記単層培養工程の培地がＲＰＭＩＮｏ．１６
   ４０から成る特許請求の範囲第１項から第１０項までの
   いずれか一つに記載の癌胚抗原の製造方法。 （１２）前記培地が抗生物質をさらに含有する特許請求
   の範囲第１１項に記載の癌胚抗原の製造方法。 （１３）前記抗生物質がネオマイシン、ペニシリン、ス
   トレプトマイシン及びゲンタマイシンから成る群から選
   択される特許請求の範囲第１２項に記載の癌胚抗原の製
   造方法。 （１４）前記培地が胎児ウシ血清をさらに含有する特許
   請求の範囲第１１項から第１３項までのいずれか一つに
   記載の癌胚抗原の製造方法。 （１５）前記胎児ウシ血清が前記ＲＰＭＩＮｏ．１６４
   ０の約１０％の割合で存在する特許請求の範囲第１４項
   に記載の癌胚抗原の製造方法。 （１８）前記培地のｐＨが約７．２に調整される特許請
   求の範囲第１１項から第１５項までのいずれか一つに記
   載の癌胚抗原の製造方法。 （１７）前記単層培養工程が３７±５℃の温度で行なわ
   れる特許請求の範囲第１１項から第１６項までのいずれ
   か一つに記載の癌胚抗原の製造方法。 （１８）前記温度が約３７℃である特許請求の範囲第１
   ７項に記載の癌胚抗原の製造方法。 （１９）前記単層培養工程が大気中に通常存在するより
   も多い量の二酸化炭素を含む雰囲気中で行なわれる特許
   請求の範囲第１１項から第１８項までのいずれか一つに
   記載の癌胚抗原の製造方法。 （２０）前記雰囲気が約５〜１０％の二酸化炭素を含有
   する圧縮空気である特許請求の範囲第１９項に記載の癌
   胚抗原の製造方法。 （２１）単層培養に引続き、前記所望の細胞がトリプシ
   ン化溶液を用いて表面培養容器から回収される特許請求
   の範囲第１１項から第２０項までのいずれか一つに記載
   の癌胚抗原の製造方法。 （２２）前記トリプシン化溶液がトリプシン−ＥＤＴＡ
   溶液である特許請求の範囲第２１項に記載の癌胚抗原の
   製造方法。 （２３）前記少なくとも一回の追加の培養工程が３〜１
   ０日間、即ち全面生長が達成されるまで行なわれる特許
   請求の範囲第１項から第２２項までのいずれか一つに記
   載の癌胚抗原の製造方法。 （２４）前記少なくとも一回の追加の培養工程の培地が
   ＲＰＭＩＮｏ．１６４０から成る特許請求の範囲第１項
   から第２３項までのいずれか一つに記載の癌胚抗原の製
   造方法。 （２５）前記培地が胎児ウシ血清をさらに含有する特許
   請求の範囲第２４項に記載の癌胚抗原の製造方法。 （２６）前記胎児ウシ血清が前記ＲＰＭＩＮｏ．１６４
   ０の約１０％の割合で最初は存在する特許請求の範囲第
   ２５項に記載の癌胚抗原の製造方法。 （２７）前記少なくとも一回の追加の培養工程の培地の
   ｐＨが約７．２に調整される特許請求の範囲第１項から
   第２６項までのいずれか一つに記載の癌胚抗原の製造方
   法。 （２８）前記少なくとも一回の追加の培養工程が３７±
   ５℃の温度で行なわれる特許請求の範囲第１項から第２
   ７項までのいずれか一つに記載の癌胚抗原の製造方法。 （２９）前記温度が約３７℃である特許請求の範囲第２
   ８項に記載の癌胚抗原の製造方法。 （３０）前記少なくとも一回の追加の培養工程の培地が
   二酸化炭素と空気の混合ガスで曝気される特許請求の範
   囲第１項から第２９項までのいずれか一つに記載の癌胚
   抗原の製造方法。 （３１）前記少なくとも一回の追加の培養工程が、前記
   工程の二回目の処理量が前記工程の最初の処理量の約整
   数倍であるような少なくとも二回の連続工程から成る特
   許請求の範囲第１項から第３０項までのいずれか一つに
   記載の癌胚抗原の製造方法。 （３２）前記二回目の処理量が前記最初の処理量の約５
   〜１０倍である特許請求の範囲第３１項に記載の癌胚抗
   原の製造方法。 （３３）前記精製工程が過塩素酸を用いる抽出及び不溶
   分を排除することから成る特許請求の範囲第１項から第
   ３３項までのいずれか一つに記載の癌胚抗原の製造方法
   。 （３４）前記抽出に引続き、濃縮及び脱塩が行なわれる
   特許請求の範囲第３３項に記載の癌胚抗原の製造方法。 （３５）前記濃縮及び脱塩に引続き、硫酸アンモニウム
   処理が行なわれ、それによって沈殿した非癌胚抗原蛋白
   質が排除される特許請求の範囲第３４項に記載の癌胚抗
   原の製造方法。 （３６）前記硫酸アンモニウム処理に引続き、濃縮及び
   脱塩が行なわれる特許請求の範囲第３５項に記載の癌胚
   抗原の製造方法。 （３７）前記精製工程が追加工程の限外濾過及び遠心分
   離に引続きただちに行なわれる特許請求の範囲第１項か
   ら第３６項までのいずれか一つに記載の癌胚抗原の製造
   方法。 （３８）前記精製工程がアフィニティークロマトグラフ
   ィーによって行なわれる特許請求の範囲第１項から第３
   ７項までのいずれか一つに記載の癌胚抗原の製造方法。 （３９）前記精製工程がモノクローン抗癌胚抗原抗体を
   担持したセファロースカラムでのアフィニティークロマ
   トグラフィによって行なわれる特許請求の範囲第３８項
   に記載の癌胚抗原の製造方法。 （４０）前記アフィニティークロマトグラフィーが約４
   ℃で行なわれる特許請求の範囲第３８項又は第３９項に
   記載の癌胚抗原の製造方法。 （４１）前記癌胚抗原生産細胞系がＨｕＣＣＬ−１４Ａ
   である特許請求の範囲第１項から第４０項までのいずれ
   か一つに記載の癌胚抗原の製造方法。 （４２）確立癌胚抗原物質の免疫活性と同様な免疫活性
   、大体において約１６０，０００〜２００，０００の分
   子量及び次の重量％組成分析値：蛋白質４５．２±２．
   ３％；Ｎ−アセチルグルコサミン１９．１±０．９５％
   ；マンノース６．６±０．３３％；フコース７．６±０
   ．３８％；ガラクトース９．３±０．４７％；及びシア
   ル酸１２．３±０．６２％を有する癌胚抗原。 （４３）確立癌胚抗原物質の免疫活性と同様な免疫活性
   、大体において約１６０，０００〜２００，０００の分
   子量及び次の重量％組成分析値：蛋白質４５．２±２．
   ３％：Ｎ−アセチルグルコサミン１９．１±０．９５％
   ；マンノース６．６±０．３３％；フコース７．６±０
   ．３８％；ガラクトース９．３±０．４７％；及びシア
   ル酸１２．３±０．６２％を有し、かつ特許請求の範囲
   第１項から第４１項のいずれか一つに記載の方法に従っ
   て製造された癌胚抗原。