JPH0142676B2 - - Google Patents
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- JPH0142676B2 JPH0142676B2 JP54079851A JP7985179A JPH0142676B2 JP H0142676 B2 JPH0142676 B2 JP H0142676B2 JP 54079851 A JP54079851 A JP 54079851A JP 7985179 A JP7985179 A JP 7985179A JP H0142676 B2 JPH0142676 B2 JP H0142676B2
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- histidine
- dna
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- plasmid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
-
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
この発明は発酵法によるＬ―ヒスチジンの製造
法及びそれに使用する微生物に関するものであ
る。 発酵法によるＬ―ヒスチジンの直接的製造法に
ついては、ブレビバクテリウム属、セラチア属等
の突然変異株を用いる方法が知られている。 これに対し本発明者らは、デオキシリボ核酸
（以下、DNAと記す）供与菌として、エシエリヒ
ア（Escherichia）属のヒスチジンアナログの一
つである２―チアゾールアラニン（以下、2TA
と記す）に耐性を有する変異株を選択、これより
Ｌ―ヒスチジンの合成に関与する遺伝情報を有す
るDNAを抽出、ついでこのＬ―ヒスチジンの合
成に関与する遺伝情報を有するDNAをベクター
（プラスミド（Plasmid）もしくはフアージ
（Phage））に組み込ませ、この組み換えプラスミ
ドもしくはフアージをエシエリア属の微生物に導
入することに成功した。更に、当該プラスミドも
しくはフアージの受容菌として、各種の変異が加
えられた微生物を用いればよりＬ―ヒスチジンの
生産能が高い菌株が得られることを知つた。 エシエリヒア属のヒスチジンアナログに耐性を
有する変異株は、通常の人工変異操作をエシエリ
ヒア属の微生物に施すことにより得られる。本発
明のヒスチジンアナログは、エシエリヒア属の微
生物の増殖を抑制するようなものであるが、その
抑制はＬ―ヒスチジンが培地中に共存すれば、全
体的、又は部分的に解除されるようなものであ
る。例えば、２―チアゾールアラニン、１，２，
４―トリアゾールアラニン、ヒスチジンヒドロキ
サメート等がある。これより染色体DNAを常法
により抽出し、常法により制限エンドヌクレアー
ゼ（Endonuclase）で処理、同様に処理したベク
ターとして用いるプラスミドもしくはフアージの
DNAと混合し、リガーゼによつて連結せしめる。
染色体DNAについてこの操作を浅く、すなわち
部分分解で止まるようにすれば、多くの制限酵素
が本実験の目的に有効である。 一方、ターミナルトランスフエラーゼを用い
て、染色体DNA断片と開裂したベクターDNAと
に、デオキシアデニル酸、チミジル酸、又はデオ
キシグアニル酸とデオキシシチジル酸とをそれぞ
れ付加し、混合したのちリガーゼで連結せしめる
方法も利用しうる。 ベクターDNAとしては、ColElの系統、
pSC101の系統、pBR322の系統、R6Kの系統、
ラムダーフアージの系統など通常用いられる全て
のものが採用されうる。 以上のようにして得た染色体DNA断片とベク
ターの結合物を形質転換法によつてエシエリヒア
属の菌体に入れ、遺伝形質として安定するまで短
時間増殖せしめたのち、所望の染色体上の遺伝形
質もしくは、ベクターのもつ形質もしくはそれら
両者を併せもつ菌のクローンを選択的に生育せし
める培地を用いて、所望の形質転換株をうる。こ
のとき用いるDNAの受容菌としては、エシエリ
ヒヤ属の菌なれらばとくに支障なく用いられ、カ
イ―1776等のEK―２ランクのものも使用可能で
ある。生産性を向上させるためには、Ｌ―イソロ
イシン等、Ｌ―プロリン、Ｌ―アルギニン、Ｌ―
メチオニン、Ｌ―トリプトフアン、Ｌ―ロイシ
ン、Ｌ―チロシン、Ｌ―リジン、キサンチン、グ
アニン等の栄養要求性、サルフアメトミジン、エ
チオニン、２―アミノベンゾチアゾール、８―ア
ザグアニン、８―アザアデニン、２，６―ジアミ
ノプリン、メチオニンスルフオキシド、４―アミ
ノピラゾール―３，４―ジピリミジン、１，２，
４―トリアゾールアラニン等の耐性等の性質をも
たせるのがよい。 かくして得られたＬ―ヒスチジン生産菌を培養
する方法は、従来のＬ―ヒスチジン生産菌の培養
方法と特に変らない。即ち、培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン更に必要に応じアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース、ラクトース等およびこれ等を含有す
る澱粉加水分解液、糖蜜等が用いられる。窒素源
としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。 培地に50mg/d以上のアデニン、アデノシン
もしくはアデニル酸、ヒポキサンチン、イノシ
ン、イノシン酸等のプリン系物質を添加すればよ
り好ましい結果が得られる場合が多い。 培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適
宜調節しつつ、実質的にＬ―ヒスチジンの生成蓄
積が停止するまで行われる。 かくして培養液中には著量のＬ―ヒスチジンが
生成蓄積される。培養液よりＬ―ヒスチジンを採
取するには通常の方法が適用できる。 本発明の微生物を用いることにより、従来知ら
れているエシエリヒア・コリのＬ―ヒスチジン生
産菌を用いる場合に比べ、Ｌ―ヒスチジンの生成
収率が高いばかりでな、更にＬ―ヒスチジン以外
のアミノ酸の副生量が極めて少く、Ｌ―ヒスチジ
ンの分離・採取の際に好都合である。 実施例 １ (1) ヒスチジン過剰生産能を遺伝情報のもつた染
色体DNAの調製 エシエリヒア・コリＲ―344 株（Ｋ−12
（ATCC10798）より誘導した2TA耐性株）を
１のＬ培地（ペプトン１％、酵母0.5％、グ
ルコース0.1％、HaCl 0.5％；pH7.2に調整）
中37℃で約３時間振盪培養を行い、対数増殖期
の菌体を集菌後フエノール法による通常の
DNA抽出法によつて染色体DNAを抽出精製
し、最終5.3mgを得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてアンピシリン耐性、テトラサ
イクリン耐性、プラスミドの１種pBR322の
DNAを次のようにして調製した。まず、
pBR322をプラスミドとして保有するエシエリ
ヒア・コリーＫ−12株の１種を１のグルコー
ス・カザミノ酸・無機塩培地（グルコース２
ｇ、NH4Cl １ｇ、Na2HPO4 ６ｇ、KH2PO4
３ｇ、NaCl ５ｇ、MgSO4・7H2O 0.1ｇ、
CaCl2・2H2O 0.015ｇ、カザミノ酸20ｇを１
の純水に溶解後pH7.2に調製しものを基本培地
として用い、これにＬ―トリプトフアン0.05
ｇ、チミン0.05ｇ、サイアミン（塩酸塩）100μ
ｇを添加）に接種し、37℃で対数後期まで培養
したのち170μｇ/mlのクロラムフエニコールを
添加し、さらに一夜培養した。 この操作により、細胞内にプラスミドDNA
が多量に生産される。 クロラムフエニコル添加後16時間目に集菌
し、リゾチーム・SDS処理によつて溶菌させ、
30000×ｇ１時間の超遠心により上清を得た。
これよりプラスミドDNAを濃縮後、セシウム
クロライド―エチジウムブロマイド平衡密度勾
配遠心法によつて最終580μｇのpBR322プラス
ミドDNAを分画採取した。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇをとり、制限エ
ンドヌクレアーゼHind、EcoR、Pstを
それぞれ与え、37℃で５分、10分、20分、30分
又は60分反応させ、DNA鎖を種々の程度に切
断した。(2)で得たベクターDNAの場合は60分
反応させ、完全に切断せしめた。65℃５分の熱
処理後、両反応液を混合、ATP及びジチオス
レイトール存在下、T4フアージ由来のDNAリ
ガーゼによつて10℃、24時間のDNA鎖の連結
反応を行つた。 65℃５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱
採取した。 (4) ヒスチジン過剰生産遺伝子を担つたプラスミ
ドによる形質転換 エシエリヒア・コリ Ｋ―12株からニトロア
ニジン変異処理によつて誘導したヒスチジン要
求株Ｈ―13株をＬ培地10mlに接種し、37℃で振
盪培養を行い対数増殖期中期まで生育させた後
集菌し、これを氷冷下0.1M Mg Cl2、0.1M
CaCl2各溶液に順次懸濁させることによつてい
わゆるコンピテントな（DNA取り込み能を有
する）細胞を調製した。このコンピテント細胞
懸濁液に、(3)で得たDNAの溶解液を加えて氷
冷下30分反応させ、直ちに42℃２分のヒートシ
ヨツクを与えた後、再び氷冷下に30分放置して
DNAを細胞内に取り込ませた。つぎに、この
細胞懸濁液の一定量を新たなＬ培地に接種し、
37℃２時間振盪培養を行つて形質転換反応を完
了させた後、集菌洗滌し、再懸濁液を最少培地
プレート（グルコース２ｇ、（NH4）2SO4 １
ｇ、K2HPO4 ７ｇ、KH2PO4 ２ｇ、
MgSO4・7H4O 0.1ｇ、クエン酸ナトリウム0.5
ｇを１の純水に溶解しpH7.2に調整したもの
を基本最少培地とし、これに寒天２％を加えて
殺菌した固形培地）に塗抹し、37℃で３日間培
養した。生じたコロニーを釣菌し、そのアンピ
リシリン（50μｇ/ml）およびテトラサイクリ
ン（５μｇ/ml）の耐性度を、固形Ｌ培地で検
定した。さらにヒスチジン過剰生産能を有する
菌株を採取するためのヒスチジン要求性変異株
Ｈ―13を全面に塗布した最小培地平板上に上記
コロニーを移植した。ヒスチジン分泌コロニー
の周囲にはヒスチジン要求性菌が生育するので
ハローが観察され容易に過剰生産菌を識別する
ことができた。少くとも一種の上記抗生物質に
耐性を有し、かつヒスチジンの過剰生産能を有
するコロニーを目的とする形質転換株として純
化し、保存した。 酵素Hind処理によつて造成されたプラス
ミド含有株としてAJ11378、酵素EcoR処理
によつて造成されたプラスミド含有株として
AJ11385、酵素Pst処理によつて造成された
プラスミド含有株とししてAJ11386などを得
た。 (5) 新規ヒスチジン生産株によるＬ―ヒスチジン
の生産 (4)で得られた菌株のうち、AJ11378、
AJ11385、AJ11386をDNA供与菌であるＲ−
344と比較して、Ｌ―ヒスチジンの発酵生産を
検定した結果を第１表Ａに示した。 第１表Ｂは、AJ11378かから、ヒスチジンの
生合成に関与する遺伝子を組み込んだプラスミ
ドを抽出し、他の菌株に形質転換法によつてと
りこませて作つた新規ヒスチジン生産菌の培養
結果である。 Ｒ−344に１，２，４―トリアゾールアラニ
ン耐性をつけたヒスチジン生産株Ｒ―344―34
を得た。AJ11387はＲ―344に、AJ 11388はＲ
―344―34にそれぞれ、AJ11378から、ヒスチ
ジンの生合成に関与する遺伝子を組み込んだプ
ラスミドをとりこませた形質転換株である。
法及びそれに使用する微生物に関するものであ
る。 発酵法によるＬ―ヒスチジンの直接的製造法に
ついては、ブレビバクテリウム属、セラチア属等
の突然変異株を用いる方法が知られている。 これに対し本発明者らは、デオキシリボ核酸
（以下、DNAと記す）供与菌として、エシエリヒ
ア（Escherichia）属のヒスチジンアナログの一
つである２―チアゾールアラニン（以下、2TA
と記す）に耐性を有する変異株を選択、これより
Ｌ―ヒスチジンの合成に関与する遺伝情報を有す
るDNAを抽出、ついでこのＬ―ヒスチジンの合
成に関与する遺伝情報を有するDNAをベクター
（プラスミド（Plasmid）もしくはフアージ
（Phage））に組み込ませ、この組み換えプラスミ
ドもしくはフアージをエシエリア属の微生物に導
入することに成功した。更に、当該プラスミドも
しくはフアージの受容菌として、各種の変異が加
えられた微生物を用いればよりＬ―ヒスチジンの
生産能が高い菌株が得られることを知つた。 エシエリヒア属のヒスチジンアナログに耐性を
有する変異株は、通常の人工変異操作をエシエリ
ヒア属の微生物に施すことにより得られる。本発
明のヒスチジンアナログは、エシエリヒア属の微
生物の増殖を抑制するようなものであるが、その
抑制はＬ―ヒスチジンが培地中に共存すれば、全
体的、又は部分的に解除されるようなものであ
る。例えば、２―チアゾールアラニン、１，２，
４―トリアゾールアラニン、ヒスチジンヒドロキ
サメート等がある。これより染色体DNAを常法
により抽出し、常法により制限エンドヌクレアー
ゼ（Endonuclase）で処理、同様に処理したベク
ターとして用いるプラスミドもしくはフアージの
DNAと混合し、リガーゼによつて連結せしめる。
染色体DNAについてこの操作を浅く、すなわち
部分分解で止まるようにすれば、多くの制限酵素
が本実験の目的に有効である。 一方、ターミナルトランスフエラーゼを用い
て、染色体DNA断片と開裂したベクターDNAと
に、デオキシアデニル酸、チミジル酸、又はデオ
キシグアニル酸とデオキシシチジル酸とをそれぞ
れ付加し、混合したのちリガーゼで連結せしめる
方法も利用しうる。 ベクターDNAとしては、ColElの系統、
pSC101の系統、pBR322の系統、R6Kの系統、
ラムダーフアージの系統など通常用いられる全て
のものが採用されうる。 以上のようにして得た染色体DNA断片とベク
ターの結合物を形質転換法によつてエシエリヒア
属の菌体に入れ、遺伝形質として安定するまで短
時間増殖せしめたのち、所望の染色体上の遺伝形
質もしくは、ベクターのもつ形質もしくはそれら
両者を併せもつ菌のクローンを選択的に生育せし
める培地を用いて、所望の形質転換株をうる。こ
のとき用いるDNAの受容菌としては、エシエリ
ヒヤ属の菌なれらばとくに支障なく用いられ、カ
イ―1776等のEK―２ランクのものも使用可能で
ある。生産性を向上させるためには、Ｌ―イソロ
イシン等、Ｌ―プロリン、Ｌ―アルギニン、Ｌ―
メチオニン、Ｌ―トリプトフアン、Ｌ―ロイシ
ン、Ｌ―チロシン、Ｌ―リジン、キサンチン、グ
アニン等の栄養要求性、サルフアメトミジン、エ
チオニン、２―アミノベンゾチアゾール、８―ア
ザグアニン、８―アザアデニン、２，６―ジアミ
ノプリン、メチオニンスルフオキシド、４―アミ
ノピラゾール―３，４―ジピリミジン、１，２，
４―トリアゾールアラニン等の耐性等の性質をも
たせるのがよい。 かくして得られたＬ―ヒスチジン生産菌を培養
する方法は、従来のＬ―ヒスチジン生産菌の培養
方法と特に変らない。即ち、培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン更に必要に応じアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース、ラクトース等およびこれ等を含有す
る澱粉加水分解液、糖蜜等が用いられる。窒素源
としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。 培地に50mg/d以上のアデニン、アデノシン
もしくはアデニル酸、ヒポキサンチン、イノシ
ン、イノシン酸等のプリン系物質を添加すればよ
り好ましい結果が得られる場合が多い。 培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適
宜調節しつつ、実質的にＬ―ヒスチジンの生成蓄
積が停止するまで行われる。 かくして培養液中には著量のＬ―ヒスチジンが
生成蓄積される。培養液よりＬ―ヒスチジンを採
取するには通常の方法が適用できる。 本発明の微生物を用いることにより、従来知ら
れているエシエリヒア・コリのＬ―ヒスチジン生
産菌を用いる場合に比べ、Ｌ―ヒスチジンの生成
収率が高いばかりでな、更にＬ―ヒスチジン以外
のアミノ酸の副生量が極めて少く、Ｌ―ヒスチジ
ンの分離・採取の際に好都合である。 実施例 １ (1) ヒスチジン過剰生産能を遺伝情報のもつた染
色体DNAの調製 エシエリヒア・コリＲ―344 株（Ｋ−12
（ATCC10798）より誘導した2TA耐性株）を
１のＬ培地（ペプトン１％、酵母0.5％、グ
ルコース0.1％、HaCl 0.5％；pH7.2に調整）
中37℃で約３時間振盪培養を行い、対数増殖期
の菌体を集菌後フエノール法による通常の
DNA抽出法によつて染色体DNAを抽出精製
し、最終5.3mgを得た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてアンピシリン耐性、テトラサ
イクリン耐性、プラスミドの１種pBR322の
DNAを次のようにして調製した。まず、
pBR322をプラスミドとして保有するエシエリ
ヒア・コリーＫ−12株の１種を１のグルコー
ス・カザミノ酸・無機塩培地（グルコース２
ｇ、NH4Cl １ｇ、Na2HPO4 ６ｇ、KH2PO4
３ｇ、NaCl ５ｇ、MgSO4・7H2O 0.1ｇ、
CaCl2・2H2O 0.015ｇ、カザミノ酸20ｇを１
の純水に溶解後pH7.2に調製しものを基本培地
として用い、これにＬ―トリプトフアン0.05
ｇ、チミン0.05ｇ、サイアミン（塩酸塩）100μ
ｇを添加）に接種し、37℃で対数後期まで培養
したのち170μｇ/mlのクロラムフエニコールを
添加し、さらに一夜培養した。 この操作により、細胞内にプラスミドDNA
が多量に生産される。 クロラムフエニコル添加後16時間目に集菌
し、リゾチーム・SDS処理によつて溶菌させ、
30000×ｇ１時間の超遠心により上清を得た。
これよりプラスミドDNAを濃縮後、セシウム
クロライド―エチジウムブロマイド平衡密度勾
配遠心法によつて最終580μｇのpBR322プラス
ミドDNAを分画採取した。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇをとり、制限エ
ンドヌクレアーゼHind、EcoR、Pstを
それぞれ与え、37℃で５分、10分、20分、30分
又は60分反応させ、DNA鎖を種々の程度に切
断した。(2)で得たベクターDNAの場合は60分
反応させ、完全に切断せしめた。65℃５分の熱
処理後、両反応液を混合、ATP及びジチオス
レイトール存在下、T4フアージ由来のDNAリ
ガーゼによつて10℃、24時間のDNA鎖の連結
反応を行つた。 65℃５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱
採取した。 (4) ヒスチジン過剰生産遺伝子を担つたプラスミ
ドによる形質転換 エシエリヒア・コリ Ｋ―12株からニトロア
ニジン変異処理によつて誘導したヒスチジン要
求株Ｈ―13株をＬ培地10mlに接種し、37℃で振
盪培養を行い対数増殖期中期まで生育させた後
集菌し、これを氷冷下0.1M Mg Cl2、0.1M
CaCl2各溶液に順次懸濁させることによつてい
わゆるコンピテントな（DNA取り込み能を有
する）細胞を調製した。このコンピテント細胞
懸濁液に、(3)で得たDNAの溶解液を加えて氷
冷下30分反応させ、直ちに42℃２分のヒートシ
ヨツクを与えた後、再び氷冷下に30分放置して
DNAを細胞内に取り込ませた。つぎに、この
細胞懸濁液の一定量を新たなＬ培地に接種し、
37℃２時間振盪培養を行つて形質転換反応を完
了させた後、集菌洗滌し、再懸濁液を最少培地
プレート（グルコース２ｇ、（NH4）2SO4 １
ｇ、K2HPO4 ７ｇ、KH2PO4 ２ｇ、
MgSO4・7H4O 0.1ｇ、クエン酸ナトリウム0.5
ｇを１の純水に溶解しpH7.2に調整したもの
を基本最少培地とし、これに寒天２％を加えて
殺菌した固形培地）に塗抹し、37℃で３日間培
養した。生じたコロニーを釣菌し、そのアンピ
リシリン（50μｇ/ml）およびテトラサイクリ
ン（５μｇ/ml）の耐性度を、固形Ｌ培地で検
定した。さらにヒスチジン過剰生産能を有する
菌株を採取するためのヒスチジン要求性変異株
Ｈ―13を全面に塗布した最小培地平板上に上記
コロニーを移植した。ヒスチジン分泌コロニー
の周囲にはヒスチジン要求性菌が生育するので
ハローが観察され容易に過剰生産菌を識別する
ことができた。少くとも一種の上記抗生物質に
耐性を有し、かつヒスチジンの過剰生産能を有
するコロニーを目的とする形質転換株として純
化し、保存した。 酵素Hind処理によつて造成されたプラス
ミド含有株としてAJ11378、酵素EcoR処理
によつて造成されたプラスミド含有株として
AJ11385、酵素Pst処理によつて造成された
プラスミド含有株とししてAJ11386などを得
た。 (5) 新規ヒスチジン生産株によるＬ―ヒスチジン
の生産 (4)で得られた菌株のうち、AJ11378、
AJ11385、AJ11386をDNA供与菌であるＲ−
344と比較して、Ｌ―ヒスチジンの発酵生産を
検定した結果を第１表Ａに示した。 第１表Ｂは、AJ11378かから、ヒスチジンの
生合成に関与する遺伝子を組み込んだプラスミ
ドを抽出し、他の菌株に形質転換法によつてと
りこませて作つた新規ヒスチジン生産菌の培養
結果である。 Ｒ−344に１，２，４―トリアゾールアラニ
ン耐性をつけたヒスチジン生産株Ｒ―344―34
を得た。AJ11387はＲ―344に、AJ 11388はＲ
―344―34にそれぞれ、AJ11378から、ヒスチ
ジンの生合成に関与する遺伝子を組み込んだプ
ラスミドをとりこませた形質転換株である。
【表】
【表】
実験はグルコース５ｇ/d、硫酸アンモニウ
ム2.5ｇ/d、リン酸第一カリ0.2ｇ/d、硫酸マ
グネシウム・７水塩0.1ｇ/d、酵母エキス0.05
ｇ／ｄ、ビタミンB1塩酸塩1000γ/、FeSO4・
7H2O １mg/d、MnSO4・4H2O １mg/d、炭
酸カルシウム2.5％（別殺菌添加）の組成をもち、
pH7.0の液体培地を500mlフラスコに20ml分注し、
これに第１表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植
えつけ、31℃で72時間培養した。培養後遠心上清
中のＬ―ヒスチジンをバイオアツセイ法で定量し
た。
ム2.5ｇ/d、リン酸第一カリ0.2ｇ/d、硫酸マ
グネシウム・７水塩0.1ｇ/d、酵母エキス0.05
ｇ／ｄ、ビタミンB1塩酸塩1000γ/、FeSO4・
7H2O １mg/d、MnSO4・4H2O １mg/d、炭
酸カルシウム2.5％（別殺菌添加）の組成をもち、
pH7.0の液体培地を500mlフラスコに20ml分注し、
これに第１表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植
えつけ、31℃で72時間培養した。培養後遠心上清
中のＬ―ヒスチジンをバイオアツセイ法で定量し
た。
Claims (1)
- １ エシエリヒア属のヒスチジンアナログに耐性
を有する変異株より得たＬ―ヒスチジンの合成に
関与する遺伝情報を担うデオキシリボ核酸を組込
んだベクターをエシエリヒア属の微生物に含有せ
しめたＬ―ヒスチジン生産性微生物を培養し、培
養液中に蓄積したＬ―ヒスチジンを採取すること
を特徴とするＬ―ヒスチジンの製造法。
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