JPS6233207B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗腫瘍性剤に関し、さらに詳しくはク
ロストリジウム属細菌類の菌体を稀酸性あるいは
アルカリ性水溶液で抽出した抽出液の溶剤沈殿物
を有効成分とする抗腫瘍性剤に関する。 細菌類の細胞壁の構成、特にクロストリジウム
属の細菌の細胞壁の構成に関しては、本江、渡
辺、緒方らにより、PG層（peptidoglycan）とPS
層（polysaccharide）とが４：１の比で構成して
いること 〔PS：渡辺ら 日本農芸化学会創立50周年記
念西日本支部大会講演（要旨２の６ 1974
年10月）（日本農化会誌48Ｎ―162（1974） PG：緒方ら 同上大会講演（要旨２の５
1974年10月）（日本農化会誌48Ｎ―162
（1974） が発表され公知である。一方、細菌類の細胞壁の
抗腫瘍性については、結核菌（山村ら 日本臨床
32542（1974））及び乳酸菌（I.G.Bog danovら
FEBS Ietters 57 259（1975））の抗腫瘍性が
報じられ、さらに本発明者らはクロストリジウム
属の菌体を超音波処理して遠心力の調節による常
法によつて収得した細胞壁区分及び特定のクロス
トリジウム属が生産する不溶性多糖類Ｃ―45がマ
ウスの腹水癌に対して顕著な抗腫瘍性を示すこと
を発見しそれに基づいた発明を完成し特許を出願
した。（特願昭52―第141804及び特願昭52―第
141803号） なお細胞壁区分はポリサツカライド部分とペプ
チドグリカン部分に分けられポリサツカライド区
分よりはペプチドグリカン部分が強い活性を示す
ことを確認された。 本発明者らはその後、さらに研究をすすめ、ク
ロストリジウム属に属する細菌類の菌体自体、特
にその微酸性水溶液抽出区分あるいはアルカリ性
水溶液抽出区分が先に出願した発明の細胞壁区分
や不溶性多糖類よりも強い抗腫瘍性を示すことを
見い出しそれに基づいて本発明を完成したもので
ある。 すなわち本発明は「クロストリジウム属の細菌
類の菌体を稀酸性あるいはアルカリ性水溶液で抽
出した抽出液の溶剤沈殿物を有効成分とする抗腫
瘍剤」を要旨とするものである。 本発明者がクロストリジウム属の細菌類に属す
る菌株としてその菌体を回収するために使用し得
る菌株は、 クロストリジウム サツカロパーブチルアセト
ニカム N1―４（Clostridium
saccharoperbutylacetonicum N1―４） クロストリジウム アセトブチリカム 314
（Clostridium acetobutylicum 314） クロストリジウム ブチリカム（Clostridium
butyricum） 本発明に使用する菌は加れも次の通りの公知の
入手可能な菌株である。 クロストリジウム サツカロパーブチルアセト
ニカム（Clostridium
saccharoperbutylacetonicum）ATCC 27022
（又は日本特許第284441）。 クロストリジウム アセトブチリカム（Cl．
acetobutylicum）IFO 3346（又はATCC
824） クロストリジウム ブチリカム（CI．
butyricum）IFO 3315（又はATCC 19398） なお、本発明者らは菌体組成として上記のクロ
ストリジウム属細菌類が殆んど大差ないことを確
めた上、主としてクロストリジウム サツカロパ
ーブチルアセトニカム ATCC 27022を主として
実験に使用した。 次に本発明の菌体を採取するための培養はクロ
ストリジウム属の培養に用いる通常の嫌気発酵の
方法を用いる。 但し、クロストリジウム・サツカロパーブチル
アセトニカム、クロストリジウム・アセトブチリ
カム及びクロストリジウム・ブチリカムの培養は
種菌の培養（500mlまで）及び本培養（５及び
50）は共に30℃で培養したが、クロストリジウ
ム・アセトブチリカムのみ場合により種菌を37℃
で培養し、本培養は30℃で行つた。培地組成とし
ては通常の培地組成、即ち炭素源としてはグルコ
ース、蔗糖、殿粉質、麦芽糖、殿粉糖化液、甘蔗
廃糖蜜、甜菜廃糖蜜等が用いられ、窒素源として
はアンモニア、硫安、硝安、酢酸アンモニウム等
のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素や大豆粕、棉実
粕、ペプトン、米糠、C.S.L、酵母エキス等の有
機窒素源やりん酸塩、マグネシウム塩等のミネラ
ル及び培地の酸性化を防ぐために炭酸石灰を加
え、その他場合により微量要素を添加して用い
る。本発明者は菌体分離の便のために実験的には
次の組成を有するTYA培地を用いた。 TYA培地 グルコース40ｇ、酢酸アンモニウム３ｇ、トリ
プトン６ｇ、酵母エキス２ｇ、りん酸―カリ
0.5ｇ、硫酸マグネシウム0.3ｇ、硫酸第二鉄６
mg（初発PH6.5）（通常は酸性化を防ぐため炭酸
石灰を用いる） 但し、本発明の実験では、トリプトンの代りに
ポリペプトンを用い、かつPH調整は特に行わなか
つたが、工業的にはアンモニア等により調整す
る。菌体の採取は対数増殖期ないしは定常期に行
えばよく、本発明では先に出願した細胞壁との比
較のため増殖がO.D.で0.4〜0.6の間の時期に行つ
た。この時間は通常培養開始後５〜７時間であ
る。 これらの増殖培養地から菌体を回収するには公
知の方法がすべて用いられ、通常は遠心分離によ
つて6000〜12000rpmで遠沈して冷水で洗浄して
遠沈を反覆することによつて混在物を除去して抽
出用の素材とする。 その場合の菌体の収量は、クロストリジウム・
サツカロパーブチルアセトニカム（C.
saccharoperbutylacetonicum）、クロストリジウ
ム・アセトブチリカム（Cl． acetobutylicum）
及びクロストリジウム・ブチリカム（C.
butyricum）の場合、殆んど同様で30の培養液
から30〜35ｇ（乾物）が得られる。 （微酸性水溶液抽出液の溶剤沈殿物の調製） 菌遠心分離機で分離した湿菌体（以上述べたよ
うな乾物量に相当する）を酸性水溶液で抽出する
が、この場合の酸は無機塩として塩酸または硫酸
を用い塩酸の場合0.05N（0.18％）から1N（3.75
％）の温度は濃厚な場合は常温、稀薄な場合は80
℃位までに加温して行ない、処理時間は濃度と温
度によつて30分ないし１昼夜撹拌しながら保持す
ることによつて行なわる。 例えば、培養液30から分離した湿菌体に稀塩
酸0.125N（0.46％）を500ml加え、還元状態用で
抽出するために40％ホルマリン１mlを加えて撹拌
しながら70℃に加温し30分保持した、この抽出液
を遠心分離機によつて分離し、残部（Ac―Re）
と液部に分ち液部にアセトンまたは低級アルコー
ル等の水と混和する溶剤、例えばエチールアルコ
ールを加えてアルコール85％（容積）として沈殿
させた後、該沈殿区分を純水に懸濁させて純水に
対して透析した後、透析内液を減圧濃縮凍結乾燥
して微酸性水溶液抽出液の溶剤沈殿物（Ac―
Ex）2.0ｇを得た。なお、この沈殿部（Ac―
Ex）はさらに水可溶部（Ac―Ｓ）1.3ｇと不溶部
（Ac−Is）0.7ｇに分けられる。 （アルカリ性水溶液抽出液の溶剤沈殿物の調製） 菌体のアルカリ性水溶液の調製は、苛性ソーダ
または苛性カリの５％ないし30％の濃度で常温な
いしは稀薄な場合は若干加温する程度で行なわれ
その処理時間もアルカリ濃度及び温度によつて相
違するが、常温で30％〜15％の場合撹拌しながら
一夜ないし一昼夜保持することによつて行なわれ
る。 例えば培養液30から分離した湿菌体に24％の
苛性カリ水溶液500mlを加えて、好ましくはキレ
ート形成剤としてほう酸15ｇを加えて撹拌しなが
ら一夜放置した後、抽出液を遠心分離によつて残
部（Al―Re）と液部に分ち液部に塩酸を加えて
中和しPHを約6.5とした後、アセトンまたは低級
アルコール等の水と混和する溶剤、例えばエチル
アルコールを加えてアルコール80％（容積）とし
て沈殿させた後、該沈殿を銃水に懸濁させて純水
に対して透析した後透析内液を減圧濃縮後凍結乾
燥してアルカリ性水溶液抽出液の溶剤沈殿物
（Al―Ex）5.1ｇを得た。 なお、この沈殿部（Al―Ex）はさらに水可溶
部（Al―Ｓ）2.9ｇと不溶部（Al―ls）2.2ｇに分
けられる。 なお、本発明者は上記の微酸性水溶液とアルカ
リ性水溶液の抽出物の他に、フエノール抽出物
（最終濃度フエノール45％）をつくり上記と同様
に不溶残部（Ｐ―Re）と可溶部溶剤沈殿部（Ｐ
―EX）をも調製した。 次にこれらの各抽出部分の物理的性状を記載す
る。 【表】 【表】 なお、上記の微酸性液抽出溶剤沈殿部の純水可
溶部分（Ac―Ｓ）の組成を確めるため、DEAE
―セフアデツクス Ａ―50カラムクロマトラフイ
ー（セフアデツクスはPharmacia Fine
Chemical AB 社商標の交叉結合のデキストラ
ンゲル．）によつてイオン交換クロマトグラフイ
ーパターンを検したのが第９図である図中黒丸は
280mmにおける吸光度のカーブで白丸は620mmにお
ける吸光度のカーブであり、図中右上の三角形で
示した線はグラデイエントエルーシヨンに用いた
食塩水の濃度を示す。このパターンからAC―Ｓ
はＦ―の糖部分Ｆ―の蛋白部分Ｆ―の糖蛋
白部分Ｆ―の蛋白部分よりなることが認められ
た。 次にこの菌体からの各抽出液各部分壁を用いて
その抗腫瘍性を試験した結果を次に記載する。先
ず抗腫瘍性試験の方法を記す。 試験動物はddN♀（体重23±２ｇ）を用い、
Sarcoma―180をマウス一頭当り10⁵cells腹腔内注
射し、注射前６日、３日、注射後２，３，４，
５，６，７，８，９日の10回に分けて各試験製剤
をPBS_(-)に懸濁して腹腔内注射した。 対照は生理食塩水のりん酸バツフアーPBS_(-)
〔PBSはカルシウムイオンを除いたphosphate
buffer of serum〕のみをサンプルと同様に10回
投与した。その結果は次の通りであつた。 先ず予備試験で対照のマウス10頭がすべて死亡
したのに対して凍結乾燥菌体では１mg、10回投与
で10頭中７頭に完全抑制を認め、アセトン処理菌
体では抗腫瘍性は維持されたがホルマリン処理及
び熱処理菌体では若干低下した。 次に微酸性、アルカリ性及びフエノール抽出物
の投与結果を記載する。 【表】 ＊ フエノールで溶出した水層部
この表に示すように100日後、対照区の全部死
亡に対し微酸性水溶液溶剤沈殿部では10頭中10頭
生存し、アルカリ性水溶液溶剤沈殿部は10頭中９
頭生存し、しかし死亡したものも93日生存する結
果を示し、腹水癌に対して顕著な抗腫瘍性を示し
た。 これら製剤すなわち本発明のクロストリジウム
層微生の菌体の微酸性水溶液抽出液またはアルカ
リ性水溶液抽出液の溶剤沈殿物を実際に投与する
場合には、注射用蒸留水又は生理食塩水に懸濁し
て投与される。その場合の投与方法としては、動
物の場合、腹腔内注射、皮下注射、及び水可溶物
は静脈又は動脈への血管内注射及び局所投与等の
注射剤として、人の場合は静脈又は動脈への血管
内注射又は局所投与等の注射剤、又はカプセル等
の経口剤として投与され、その投薬量は、動物試
験の結果及び種々の状況を勘案して、総投与量が
一定量を越えない範囲で連続的又は間けつ的に投
与する。しかし、その投与量は、投与方法、患者
又は被処理動物の状況、例えば年令、体重、性
別、感受性、食餌、投与時間、併用する薬剤、患
者又はその病気の程度に応じて適宜に変えて投与
することはもちろんであり、一定の条件の下にお
ける適量と投与回数は上記の指針を基として専門
医の適量決定試験によつて決定されなければなら
ない。 実施例 クロストリジウム・サツカロパーブチルアセト
ニカム ATCC 27022をヒートシヨツクにより栄
養細胞とした菌体を、250ml発酵瓶にTYA培地
100mlを分注したものに接種し、発酵栓をして30
℃、初発PH6.5で15時間培養後、この培養液50ml
を１発酵瓶に500mlTYA培地を分注したものへ
接種し、同様に15時間培養して、この培養液300
mlを５平底フラスコにTYA培地を３分注し
たものへ接種して同様に15時間培養して前培養を
行う。本培養は５平底フラスコ６ケにそれぞれ
TYA培地５を入れ、上記の前培養液を500mlづ
つ接種して30℃で綿栓静置培養を行う。約６時間
後、ODが0.6に達した時培養液を併せて
12000rpmで連続遠沈し、その菌体を冷水に懸濁
して、6000rpm、10分冷凍遠沈（４℃）を３回繰
り返して菌体を洗浄する。この菌体を冷水500ml
に懸濁して4.5mlの濃塩酸を加えて撹拌し、さら
にホルマリン１mlを加えて撹拌後、70℃恒温槽で
30分撹拌しながら抽出する。 この抽出液を12000rpm、30分遠沈して、その
上澄液を集め、最終濃度が85％となるようにアル
コールを加えて、撹拌し、一夜放置する。生じた
繊維状の物質を6000rpm、10分遠沈して集め、約
300mlの水に懸濁させ２日間水道水、１日純水で
流水透析を行う。エバポレーターで約100mlに濃
縮して凍結乾燥する。 この酸抽出物標品を用いて腹水癌に対する抗腫
瘍性を次のようにして確認した。即ち、ddN♀の
５週令マウス中から体重が20〜25ｇのものを選
び、Sarcoma―180を受け継ぎして１週間後のも
のを細胞数10⁵となるようにPBS^(-)で稀釈して腹
腔内に移殖する。 試料は１mg／0.2mlPBS^(-)に懸濁後115℃、５
分オートクレープして0.2mlづつ10回腹腔内に投
与する。投与はSarcoma180移殖前に２回（−
６，−３）、移殖後８回（２，３，４，５，６，
７，８，９）投与する。対照としてPBS^(-)のみ
を投与する。 対照のマウスは10頭全てが癌化して、18日前後
に死亡してしまうが、クロストリジウム・サツカ
ロパーブチルアセトニカムの酸抽出物を投与する
と、10頭中10頭全く癌化せず、強い抗腫瘍性が確
認された。

【図面の簡単な説明】

第１〜第４図はそれぞれ本発明の菌体微酸性水
溶液抽出液溶剤沈殿部（Ac―Ex）、同上の純水
可容部分（Ac―Ｓ）、アルカリ性水溶液抽出液溶
剤沈殿部（Al―Ex）及び同上の純水可容部分の
紫外部吸収スペクトル図、第５〜第８図はそれぞ
れ同上と同じ順序のIR吸収スペクトル図、第９
図は微酸性水溶液抽出液溶剤沈殿部の純水可容部
分（Ac―Ｓ）のDEAE―セフアデツクス Ａ―
50カラムクロマトグラフイーのイオン交換クロマ
トグラフイーパターンを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ クロストリジウム（Clostridium）属の細菌
   類の菌体を稀酸性あるいはアルカリ性水溶液で抽
   出した抽出液の溶剤沈殿物を有効成分とする抗腫
   瘍性剤。