JPS623793A - Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 Ｌ−フェニルアラニン（以下フェニルアラニンと略す。

）は近年注目されているジ被プチド甘味料であるアメ／
４ルチルフエニルアラニンメチルエステルの重要な原料
である。本発明はフェニルアラニンの製造方法に関し、
更に詳しくは、微生物を用いて桂皮酸とアンモニア供与
体からフェニルアラニンを製造する方法に関するもので
ある。

〔従来の技術〕

更に、本出願人らによって糸状菌に属する微生物による
゛方法（特願昭５９−１８８６９．特願昭５９−１６１
２１６．特願昭５９−２１５９６２、特願昭６Ｏ−８８
５８）が開発されている。

〔本発明が解決しようとする問題点〕

従来よシ知られている微生物による桂皮酸とアンモニア
供与体からフェニルアラニンを生成する反応では水性媒
体の…を８ないし１１に保つために水性媒体中に高価な
塩酸又は硫酸などの酸を添加する必要があり、フェニル
アラニンの精製工程で、酸の添加により生ずる塩類の煩
雑な除去を行なわなければならず、このためにフェニル
アラニンの処理収率が低下するという欠点を有してい念
。

本発明が解決しようとする問題点は上記の欠点を解決し
、効率の良い、工業的に安価なフェニルアラニンを製造
する方法を確立することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上記の問題点を解決するために、種々研究
を行った結果、従来の糸状菌を用いた桂皮酸とアンモニ
ア供与体からし一７エニルアラニンを製造する方法では
、水性媒体中の−を調整するために生ずるアンモニウム
塩が著しくＬ−フェニルアラニンの生成を阻害すること
、水性媒体中のアンモニウム塩を低濃度にすることによ
り従来の方法に比べ、著しくＬ−フェニルアラニンノ生
成が向上すること及び水性媒体中のアンモニウム塩が低
濃度のために７エニルアラニンの精製工程で塩を除去す
る工程が簡略化でき、フェニルアラニンの処理収率が向
上することを見いだした。本発明はこの知見に基づいて
成されたものである。゛本発明において使用量れる微生
物は、糸状菌であるならば、なにを用いてもよいが、具
体的には以下にしめずようなものがある。

ゲオトリカム　キャビタータム（ＧｅｏＬｒｉｃｈｕｍ
ｃａｐｉｔａｔｕｍ　）　ＡＪ　１１７１２８　ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−７７３６モニリエア　セエペオレンス　パアー
　セエペオレンス（Ｍｏｎ１１１ｅｌｌａ　５ｕａｖｅ
ｏｌｅｎｓ　ｖａｒｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ　）　ＡＪ　
１１７１２９　ＦＥＲＭ　Ｐ−７７３７ペリキユラリア
　フィーラメントーサ（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａｆｌ
ｌａｍｅｎＬｏｓａ　）　ＩＦＯ６２５４ゴナトボトリ
ウム　アビキュラタム （Ｇｏｎａｔｏｂｏｔｒｙｕｍ　ａｐｉｃｕｌａｔｕｍ
　）　ＩＦＯ９０９８シンセフアラストラム　ラセモサ
ム （Ｓｙｎｅｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ　ｒａｃｅｍｏｓｕ
ｍ　）　ＩＦＯ４８１４エンド−４セス　リンデネリイ
（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓｌｌｎｄｎｅｒｉ　）　ＡＪ　６
６１１　ＦＥＲＭ　Ｐ−７４２５アスペルギウス　シイ
ハリエＩＩ　（Ａ＠ｐｓｒｇｉｌｌｕ♂ｃｈｓｖａｌｉ
ｅｒｌ　）　ＡＪ　７２２１　ＦＥＲＭ　Ｐ−７４２６
サツカロミコブシス　フィプリダナ （５ａｃｃｈａｒ、ｄｍｙｃｏｐｓｉｓ　ｆｉｂｕｌｉ
ｇｅｒａ　）　ＩＦＯ０１０５ユーロチウム　シイパリ
エリ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍｃｈｓｖａｌｉｅｒｉ　）　Ｉ
ＦＯ４０９０クロメレラ　ックマエンシス（Ｇｌｏｍｅ
ｒｅｌｌａｔｕａｕｍａｎｓｎｓｉｓ　）　ＡＪ　６３
０７　ＦＥＲＭ　Ｐ−７８９２クラドスポリウム　コロ
カシェ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｃｏｌｏｃａｓｉａ
ｅ　　）ＩＦｏ　６６９８などがある。

桂皮酸とアンモニア供与体にこれらの微生物を作用せし
める方法は本微生物を培養し微生物の培養物、菌体また
は菌体処理物を水性媒体中で桂皮酸とアンモニア供与体
を作用させれば良い。

上記微生物を培養するための培地としては通常の炭素源
、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地である。更
にビタミン、アミン酸等の有機微量栄養素を添加すると
望ましい結果が得られる場合が多い。

炭素源としては、グルコース、シュクｏ−ス％の炭水化
物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適宜使用
される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア
水、アンモニウム塩、その他が用いられる。無機イオン
としては、マグネシウムイオン、燐酸イオン、カリイオ
ン、鉄イオンその他が必要に応じ適宜使用される。

培養は好気条件下にＰ）（２ないし８、温度を１５ない
し３０℃の適当な範囲に制御しつつ工ないし３０日間培
養を行なう。

本微生物の培養物、菌体または菌体処理物を水性媒体中
にて桂皮酸とアンモニア供与体に作用せしめるには、該
菌体または菌体処理物を桂皮酸とアンモニア供与体を含
む水性媒体に溶解またはけん濁せしめ、該水性媒体を１
０ないし７０℃の適当な温度に調節しつつ暫時静置また
は攪拌すればよい。

尚、桂皮酸とアンモニア供与体とからフェニルアラニン
を生成せしめる反応において、桂皮酸の使用量は特に制
限されないが、通常バッチ法で行なう場合は０．０１〜
１．　ＯＭ　、好ましくは０．１〜０．８Ｍ程度である
。

他方の反応基質であるアンモニア供与体は、反応液中に
塩を生じ石せないためアンモニアを用いて桂皮酸を中和
溶解させる方法が最も望ましいがＬ−フェニルアラニン
のとシ上げが困難にならなイ程度であれば酢酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ギ
酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩の形で存在せしめてもよい。本発明において水性媒
体中に含まれる桂皮酸以外の酸はアンモニア供与体に対
し、モル濃度比で０．１２以下になるように調整するの
で、水性媒体中に副生ずる塩は、従来の方法に比べ著し
く低い。このためにＬ−フェニルアラニンのとシ上げ量
が増大する。また、これら反応基質は反応の進行に伴っ
て分割添加しても良ｂ０ 反応は通常、水性媒体中で温度２０〜６０℃、好ましく
は３０〜４０℃である。

また菌体としては、菌体を含む培養液をそのまま用いて
もよい。また、これを一旦培養液より分離して洗滌また
は洗滌せずに使用してもよい。菌体処理物としては、機
械的摩砕菌体、超音波に士、　処理した菌体、凍結乾燥
菌体、アセトン乾燥菌体、リゾチウム等の酵素で処理し
た菌体、界面活性剤、トルエン等で処理した菌体、菌体
の蛋白画分、これらの固定化物又はその他が適宜用いら
れる。

このような菌体を得る方法は前記の培地および培養方法
がそのまま採用できる。

本微生物の培養にあたって培地中に桂皮酸、フェニルア
ラニンま九はＤ−フェニルアラニンの少なくとも一穏を
少量添加−することによって、桂皮酸とアンモニア供与
体からフェニルアラニンを生成する能力の高い菌体が得
られる場合がある。

フェニルアラニンの確認及び定量は、ロイコノストック
・メセントロイデスＡＴＣＣ−８０４２によるバイオア
ッセイ法によシ行なった。

実施例１ ポリーＪ！グトン１．　ＯｆＺ／ｄｌ、酵母エキス１．
　ＯＥ／ｄｉ　。

Ｋ２ＨＰＯ４０，３１／ｄｌ　、　　ＫＨ２ＰＯ４０，
１１７ｄｌ　、　ＭｇＳＯ４”７Ｈ２００，０５１！／
ｄｔ１フエニルアラニン０．５１７ｄｔを含む培地（ｐ
Ｈ６，０）を５００ｍ容フラスコに５ＱｍＪ入れ１１５
℃で１５分間殺菌した。

これにポテトデキストロース寒天培地で２５℃７日間培
養したゲオトリカム　キャビタータムＡＪ　１１７１２
８　ＦＥＲＭ　Ｐ−７７３６、モニリエア　セエベオレ
ンス　パアーセエペオレンス　ＡＪ　１１７１２９　Ｆ
ＥＲＭＰ−７７３７、ペリキュラリア　フィラメントー
サＩＦＯ６２５４、プナトゴトリウム　アビキュラタム
ＩＦ０９０９８　、シンセファラストラム　ラセモサム
ＩＦ０４８１４　、エンド主イセス　リンデネリイＡＪ
　６６１１　ＦＥＲＭ　Ｐ−７４２５、アスペルギウス
　シイパリエリＡＪ　７２２１　ＦＥＲＭ　Ｐ−７４２
６、サツカロマイコブシス　フイ２１Ｊ　ｒ＋　ＩＦＯ
０１０５、ニーαチウムシイハリエ’Ｊ　ＩＦＯ４０９
０１グロメレラ　ックマエンシスＡＪ　６３０７　ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−７８９２、クラドスポリウム　コロカシェＩ
ＦＯ６６９８をそれぞれ一白金耳接種し、　ＡＪ１１７
１２８　（ＦＥＲＭ　Ｐ−７７３６）　、　ＡＪ　１１
７２１９　（ＦＥＲＭ　Ｐ−７７３７）、ＡＪ　６６１
１　（ＦＥＲＭ　Ｐ−７４２５）の場合には２５℃１４
日間、ＩＦＯ６２５４、ＩＦＯ４８１４、ＡＪ　７２２
１（ＦＥＲＭ　Ｐ−７４２６）、ＩＦＯ４０９０、ＩＦ
Ｏ０１０５、ＡＪ６３０７（ＦＥＲＭ　Ｐ−７８９２）
の場合にＨ２５℃４日間、ＩＦＯ９０９８及びＩＦｏ　
６６９Ｂの場合には２５℃２日間培養した。これらの培
養液よシ菌体をそれぞれヂ過によシ採取し、培養液と同
量の生理食塩水で一回洗浄し菌体を集めた。また比較の
ために従来知られているロドトルラ　グルチェスＩＦ０
０５５９株をポリ（ブト７１．　ＯＥｌ／ｌ、酵母エキ
ス１．０　Ｉ／ｄｔ　、に２ＨＰＯ４０、３ｆｉ／ｄｔ
　、　ＫＨ２ＰＯ４０，１１／ｄｔ　、　ＭｇＳＯ４−
７Ｈ２００，０５１／ｄ１．７　：ｔ−＝＃７　、Ｆ　
ニア　０．５１１／ｄｌヲ含む培地（ｐＨ６，０）を５
００１ｎｌ容フラスコに入れ１１５℃１５分間殺菌した
ものへ、−白菌耳接種し２５℃２４時間培養し、遠心分
離によシ菌体を集め培養液と同量の生理食塩水で１回洗
浄し菌体を集めた。

これらの菌体を桂皮酸３Ｊ、２８％のアンモニア水５５
ｍ１（終末８Ｍ）を含み第１表に示した量の塩酸を添加
した１００ｍ１の水性媒体にそれぞれ調整する反応方法
に対しすべぜ糸状菌において本発明の一無調整の反応方
法のほうが高い蓄積をし調整では、Ｌ−フェニルアラニ
ン生成が減少した。

実施例２ 実施例１と同様に調製したクラドスポリウムコロカシェ
ＩＦＯ６６９８の洗浄菌体を集めた。

桂皮酸３０１１／ｌ　、及び第２表に示した鎗のアンモ
ニアを含む水溶液（ｐＨ無調梨およびＨＣｔにて−１０
，５に調Ｍ）１　ｌに菌体を５０９／ｌになるように添
加し３時間３０℃に保持、反応した。その結果第２表に
しめした量のフェニルアラニンが生成蓄積しＩ）１１無
調整の条件ではアンモニアの添加量が低くても高い蓄積
を示す事が判明した。

実施例３ 実施例１と同様にクラドスポリウム　コロカシェＩＦＯ
６６９８の菌体全調製し、実施例２のｍアンモニア水５
５０　ｍｌを用いる反応条件と同様に反応せしめた。

この反応終了液から菌体を戸別したのち、減圧度調節器
付ロータリーエバポレーターにより内圧１８０＋ｍＨｇ
において結晶が析出し始める液量まで濃縮した。それぞ
れ２８５　ｍ１９Ｊおよび７　ｓ　ａ　ｍｌ　（Ｂ）の
濃縮液を得た。

次いでこれ等の濃縮液を３５チＨＣ１溶液でｐｌ（約１
まで中和し、析出した未反応の桂皮酸を瀘過により取り
除いた後、Ｆ液に２８％ＮＨ，溶液を加えて声を７に調
整し室温下で一夜撹拌させ、Ｌ−フェニルアラニンの結
晶を析出せしめた。結晶ｔＦ別し少量の氷水で洗浄した
のち乾燥してそれぞれ１９．１’（〜及び１０．７１１
　（Ｂ）のＩ、−フェニルアラニンの結晶を取得した。

実施例４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）桂皮酸とアンモニア供与体からＬ−フェニルアラニ
   ンを生成する能力を有するゲオトリカム属、モニリエア
   属、ペリキュラリア属、ゴナトボトリウム属、シンセフ
   ァラストラム属、エンドミセス属、アスペルギルス属、
   ユーロチウム属、サッカロミコプシス属、グロメレラ属
   又はクラドスポリウム属に属する微生物を桂皮酸、アン
   モニア供与体及びアンモニア供与体の濃度に対し、モル
   濃度比で０．１２以下の桂皮酸以外の酸を含有する水性
   媒体中で保温し、この水性媒体中にＬ−フェニルアラニ
   ンを生成・蓄積させ、これを採取することを特徴とする
   Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。 ２）桂皮酸以外の酸が塩酸、硫酸、リン酸、炭酸、硝酸
   、ギ酸、酢酸、クエン酸よりなる群の１以上から選ばれ
   る酸である特許請求の範囲第１項記載のＬ−フェニルア
   ラニンの製造方法。 ３）アンモニア供与体の濃度が桂皮酸に対し等モル以上
   である特許請求の範囲第１項記載のＬ−フェニルアラニ
   ンの製造方法。