JPS6241693B2

JPS6241693B2 -

Info

Publication number: JPS6241693B2
Application number: JP60164045A
Authority: JP
Inventors: Akishiro Nakamura; Hisao Kondo; Toshio Ootani
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 1985-07-26
Filing date: 1985-07-26
Publication date: 1987-09-04
Also published as: JPS6183196A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、医薬の分野で有用な抗真菌剤に関す
る。更に詳述すればストレプトバーテシリウム族
に属するネオエナクチン生産菌を好気的に培養
し、その培養液を菌体より抗真菌性物質ネオエナ
クチンを分離、精製し、製薬上許容しうる方法に
より単離されたネオエナクチンを有効成分とする
抗真菌剤およびその製剤化に関する。真菌による疾患は一般に難治とされ、近年この
真菌症が急速に増加する傾向があ。ポリエチレン
系抗生物質は深在性真菌症に対する治療剤として
現在よく用いられている。しかし、効果のある用
量と毒性を示す用量の間が狭く安全性に難点があ
る。そこで本発明者等はポリエン系抗生物質（例
えば、トリコマイシン）とコレステロールの拮抗
を利用した新しいスクリーニング方法〔ケミカル
アンドフアーマセテイカルブリチン（Chemical
and pharmaceutical Bulletin）第21巻、2057
頁、1973〕を考案し、非ポリエン系抗生物質で抗
真菌効果を有する物質、またはポリエン系抗生物
質の作用を増強する物質の探索を行つた。この方法により本発明者等はストレプトミセス
ロゼオビリデイス（Streptomyces
roseoviridis）H646−SY3がエナクチン〔ジヤー
ナルオブアンチバイオテイツクス（Journal
of antibiotics）第30巻、182頁、1977〕を生産し
ている事を発見した。エナクチンは、それ自身は真菌に対し強い抗菌
力を有していないが、トリコマイシンまたはアン
ホテリシンＢの抗菌力を著しく増強する事を認め
た。更に、本スクリーニング方法を用い微生物培養
液の検索を行なつたところストレプトバーテシリ
ウム（Streptoverticillium）に属する一菌株が強
い抗真菌作用を有する新物質ネオエナクチンを生
産している事を発見した。本発明のネオエナクチ
ンは有用な抗真菌剤であり、例えば真菌であるカ
ンジダアルビカンス Yu−1200に対し最小発
育阻止濃度0.313μｇ／mlを示し、ポリエン系抗
真菌剤トリコマイシンの抗菌力を増強する。ま
た、ポリエン系の抗真菌剤の抗菌力を弱めるとさ
れているコレステロールの存在下においてもトリ
コマイシンの抗真菌力を増強する。本発明はネオエナクチンまたはその官能性誘導
体ならびにそれらの塩類を提供する事にある。また、本発明はストレプトバーテシリウム属に
属する菌株、例えばストレプトバーテシリウム
オリボレテイキユーリサブエスピーネオエナ
クテイカス H829−MY10（Streptoverticillium
olivoreticuli subsp.neoenacticus）を培養して培
養液および菌体より抗真菌物質ネオエナクチンま
たはその構成因子を分離精製する方法を提供する
ことにある。ネオエナクチンは白色の無定形粉末であつて、
融点60.5〜64.5℃を示す。ネオエナクチンは低級
アルコール、酢酸エチル、エーテル、クロロホル
ムに可溶で、水、ｎ−ヘキサン、石油エーテルに
不溶である。エナクチンの元素分析による百分率
組成（平均値）は次の通りである。Ｃ，63.47％Ｈ，10.04％，Ｎ，7.44％，（Ｏ，19.05％）ハロゲンおよびイオウは検出されなかつた。ネ
オエナクチンのメタノール溶液、0.1N 塩酸−
メタノール溶液、0.1N 苛性ソーダ−メタノー
ル溶液中における紫外部吸収を添付図１に示す。メタノール溶液中 208nm（Ｅ^１％_１cm＝166） 0.1N 塩酸メタノール溶液208nm（Ｅ^１％cm＝
161） 0.1N 苛性ソーダ−メタノール溶液中 240nm（Ｅ^１％cm＝138）ネオエナクチン臭化カリウム錠中における赤外
吸収スペクトルを添付図２に示す。比旋光度〔α〕^１２ _Ｄ＝−14.2゜（Ｃ＝３％、メタノール
中）ネオエナクチンの呈色反応ニンヒドリン反応＋ナフトレゾルシノール−リン酸反応＋ KMnO₄ ＋アンスロン−リン酸反応 − α−ナフトール−リン酸反応 − ネオエナクチンの構成成分ネオエナクチンを1N塩酸で110℃、17時間加水
分解し、加水分解物をエーテルつづいて酢酸エチ
ル抽出した。水層を蒸発乾固し、水に溶解後、ア
ンバーライトIR−45を通し、通過液を集め減圧
下蒸発させ容量を小さくした後エタノールを加え
た。得られた白色沈澱はペーパークロマトグラフ
イーおよび赤外吸収スペクトルよりＬ−セリンと
同定できた。ネオエナクチンおよびエナクチンのペーパーク
ロマトグラフイーとシリカゲルＧ薄層クロマトグ
ラフイー検出微生物としてカンジダアルビカンス
Yu−1200を使用する種々のペーパークロマトグ
ラフイーとシリカゲルＧ薄層クロマトグラフイー
の結果を表１および２に示した。検出には補助的
にニンヒドリン反応および40％硫酸を噴霧し加熱
する方法を用いた。

【表】

【表】生産微生物の具体例としては例えばストレプト
バーテシリウム属に属するストレプトバーテシリ
ウムオリポレテイキユリサブエスピーネオエ
ナテイカス H829−MY10がある。この菌株は本
発明者等が長崎県の土壌より分離した菌株でその
菌学的性質は次の通りである。 (1) 形態；本菌株は顕微鏡下でよく分枝した基生
菌糸を形成するが、気菌糸の成長は遅く、ほと
んどの合成培地または有機培地上で気菌糸は作
らないか、もし作つても非常に貧弱である。胞
子体は、ほとんどがまつすぐで、第一次輪生枝
またはまれに第二次輪生枝を生成する。胞子の
形態は円筒一指骨様であり大きさは１〜1.2ミ
クロン位で胞子の表面は平滑である。ストレプ
トミセスルテオカラー（Streptomyces
luteocolor）またはストレプトバーテシリウム
バーテイシラス（Streptoverticillium
vertioillus）に見られる球状構造体（Ball−
like body）が時として胞子体の先端に確認さ
れる。 (2) 各種培地上の生育状態各種培地上の生育状態を表３に示す。

【表】

【表】 (3) 生理的性質生育温度範囲；マルトース−酵母エキス寒
天培地において20〜37℃の温度範囲において
良好な生育をする。ゼラチンの液化；中等度の液化能を有す
る。デンプンの加水分解；陰性脱脂乳の凝固；陽性脱脂乳のペプトン化；陽性メラニン色素の生成；陰性 (4) 炭素源の利用性（プリドハム、ゴツドリープ
寒天培地）利用する；メソ−イノシトール、Ｄ−ガラ
クトース、デキストリン、マルトース、グリ
セロール利用が疑わしい；Ｌ−アラビノース、Ｄ−
フラクトース、ラフイノース、Ｄ−トレハロ
ース利用しない；Ｄ−キシロース、シユークロ
ース、Ｄ−マンニトール、ラクトース H829−MY10株の菌学的性質を要約すると、輪
生枝の生成、うす黄茶色の生育、白色の気菌糸そ
して可溶性色素非生産性が挙げられる。H829−
MY10株のこのような性状はストレプトバーテシ
リウム属のストレプトバーテシリウムオリボレ
テイキユリ（Streptoverticillium olivoreticuli）
の性状とよく一致する。すなわちストレプトバー
テシリウムオリボレテイキユリは第一次、第二
次輪生枝を生成し、うす黄茶色の基生菌糸を伸ば
し、生理機能不明の球状構造体を生成する。しか
しストレプトバーテシリウムオリボレテイキユ
リはクロモジエニツクな型に属する事、イノシト
ールをほとんど利用しない事よりH829−MY10株
とは異る。以上の事よりH829−MY10株はストレ
プトバーテシリウムオリボレテイキユリのサブ
エスピーと考えられ本発明者等はネオエナクチン
生産菌という事よりストレプトバーテシリウム
オリボレテイキユリ、サブエスピーネオエナクテ
イカスオオタニエトナカムラ
（Streptoverticillium olivoreticuli subsp.
neoenacticus）と命名した。 H829−MY10株は他のストレプトバーテシリウ
ム属またはストレプトミセス属の場合にみられる
ように、その性状が変化しやすく、例えば紫外
線、エツクス線、高周波、放射線、薬品等を用い
る人工的手段で変異しうるものであり、このよう
な変異株であつてもネオエナクチンまたはネオエ
ナクチン構成成分の生産能を有するものは全て本
発明の方法を使用する事が出来る。なお、本菌株
は、通商産業省技術院微生物工業技術研究所に寄
託されており、その微工研受託番号は微工研菌寄
第4376号（FERM−Ｐ 4376）である。本発明
の方法では、上記菌株を通常微生物が利用し得る
栄養物を含有する培地で培養する。栄養源として
は従来ストレプトミセス属の菌の培養に利用され
ている公知のものが利用できる。例えば炭素源と
してはグルコース、デンプン、グリセリン、デキ
ストリン、シユークロース、水あめ、糖みつ、大
豆油等を使用し得る。また窒素源としてソーヤミ
ール、乾燥乾母、コーンステイープリカー、小麦
胚芽、コツトンシードミール、硫酸アンモニウ
ム、硝酸ソーダ等を使用し得る。その他必要に応
じて炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カ
リ、リン酸塩、塩化マンガン、硫酸銅、硫酸第一
鉄、硫酸亜鉛等の無機塩を添加するほか、菌の発
育を助けネオエナクチンの生産を促進する有機お
よび無機物を適当に添加する事が出来る。培養法
としては一般に抗生物質生産の方法と同じく液体
培養が適している。培養は好気的条件下で行なわ
れ、培養に適当な温度は25〜35℃であるが、多く
の場合28℃付近で培養する。ネオエナクチンの生
産は振盪培養、タンク培養共に１〜３日で最高に
達する。以上述べた培養条件は使用する生産菌株
の特性に応じてそれぞれの最適条件を選択して適
用する事が出来る。ネオエナクチンは菌体および
培養液の両方に含まれるので両者から抽出を行
なう事が可能である。一例を示すと培養液から
はPH８において酢酸エチル抽出を行なう、または
培養液からアンバーライトXAD−に吸着さ
せ、含水メタノールで溶出される。また菌体からはメタノール抽出を行ない、減圧
下でメタノールを留去後PH８で酢酸エチル抽出を
行なう。両酢酸エチル抽出フラクシヨンに含まれ
るネオエナクチンはPH２において水層に逆転移で
きる。水層に移行したネオエナクチンはPH８で再
び酢酸エチルフラクシヨンに抽出される。この酢
酸エチル抽出フラクシヨンを減圧下、濃縮する事
により粘性の高い油状物質を得る。油状物質を1/
２０Ｍリン酸緩衝液（PH8.0）を飽和した酢酸エチ
ルに溶解し、1/20Ｍリン酸緩衝液（PH8.0）に浸
し風乾したセルロース粉末を同様な酢酸エチルを
用いて調製したカラムで展開する。ネオエナクチ
ンを含むフラクシヨンを集め少量の水で水洗し、
減圧下蒸発乾固し1/20Ｍリン酸緩衝液を飽和した
酢酸エチルに溶解する。これを再び同様なセルロ
ース粉末のカラムに展開する。ネオエナクチンを
含むフラクシヨンを集め少量の水で水洗し、減圧
下蒸発乾固し、ネオエナクチンの粉末を得る。ネ
オエナクチンの各種微生物に対する抗菌スペクト
ルは表４および５に示す通りである。最小発育阻
止濃度は37℃でグルコース入り普通寒天培地上で
求めた。

【表】

【表】上表より明らかなようにネオエナクチンは細菌
に対しほとんど抗菌力を示さないが、酵母および
カビに対し抗菌力を示す特性を有している。また
既知のポリエン系抗生物質、トリコマイシン、ア
ンホテリシンＢの抗菌力をコレステロールの存
在、非存在下において増強する。以上のような理
化学的性質および生物的性質を有するものは他の
既知物質に該当するものがなく、特異な性質を持
つた新抗生物質と認められる。また、ネオエナク
チンは酵母およびカビに対する作用だけではな
く、ガン細胞（例えばエールリツヒ腹水ガン細
胞）に対し、３_H−チミジンまたは３_H−ロイシン
のとり込みを抑制し、抗腫瘍作用を示す。次に本物質の製剤化について述べる。本物質は
抗真菌剤として使用する場合、疾患の種類および
症状に応じて、薬効を得るのに都合のよい形状で
使用でき、そして単独または製薬上許容しうる希
釈剤および他の薬剤との混合物として使用でき
る。本物質は投薬単位形で提供することができる。
有効薬量の有効成分が含有され、その形態として
は経口用として散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、
カプセル剤、シロツプ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、
乳剤などである。非経口用として注射液としての
アンプル、ピン形態などをとり得る。また、座剤
もとり得る。希釈液として固体、液体、半固体で
もよく、例えば次のものがあげられる。すなわ
ち、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩解
剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香
料、保存料、溶解補助剤、溶剤等である。具体的な例としてあげると乳糖、しよ糖、ソル
ビツト、マンニツト、でん粉、沈降性炭酸カルシ
ウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリ
ン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セ
ルロース又はその誘導体、アミロペクチン、ポリ
ビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、
生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレ
ングリコール、カカオ脂、ラウリン脂、ワセリ
ン、パラフイン、高級アルコール等である。本発明の抗真菌活性は既知のいかなる方法でも
製造し得る。本発明において用いられる組成物中
の活性成分は一般に0.01％から100wt.％好ましく
は0.05％から80wt.％含まれる。本発明の抗真菌剤は経口的または非経口的に投
与されるが経口投与が好ましい。経口的投与は舌
下投与を含有する。非経口投与は注射投与（例え
ば皮下、筋肉、静脈注射、点滴）、直腸投与など
を含む。本発明の抗真菌剤の投与量は動物か人間によ
り、また年令、個人差、病状などに影響されるの
で場合によつては下記範囲外量を投与する場合も
生ずるが、一般に人間を対象とする場合、本物質
の経口的投与量は体重１Kg、１日当り0.1〜500
mg、好ましくは１〜250mg、非経口的投与量は同
じく、0.01〜200mg、好ましくは0.1〜100mgを１
〜４回に分けて投与する。以下、本発明物質の実施例および製剤化例を示
し本発明をより詳細に説明する。下記製剤化例中
の部は重量を示す。実施例１ストレプトバーテシリウムオリボレテイキユ
リサブエスピーネオエナクテイカスH829−
MY10の保存用斜面寒天より菌１エーゼを１％マ
ルトース、0.2％酵母エキス、0.2％ポリペプトン
を含む液体培地（PH7.0）100mlに接種27℃、24時
間振盪培養したものを種菌とした。30容のジヤ
ーフアーメンターに1.5％可溶性デンプン、１％
グルコース、２％ソーヤミール、0.5％エビオ
ス、0.25％NaCl、0.3％CaCO₃、0.0008％
MnCl₂・4H₂O，、0.0007％CuSO₄・5H₂O，0.0002
％ZnSO₄・7H₂O，0.0001％FeSO₄・7H₂Oを含む
培地（PH7.6、滅菌前）15を仕込み常法により
培地を滅菌した。種菌300mlを移植し、通気量毎
分10、撹拌数250rpm、27℃で36時間通気撹拌
培養して培養菌体１Kgを得た。菌体を２倍容のメ
タノールで３度抽出し、抽出液を合わせ、減圧乾
固しシロツプとした。シロツプをPH８にして等量
の酢酸エチルで抽出を行なつた。酢酸エチル層に
抽出したネオエナクチンはPH2.0の水200mlで逆抽
出した。この水層を再びPH８とし等量の酢酸エチ
ルで抽出を行ない、酢酸エチル層を水洗した後、
減圧下蒸発乾固した。粗エナクチン量は804mgで
あつた。実施例２粗ネオエナクチン500mgを1/20Ｍリン酸緩衝液
（PH8.0）に浸した後風乾し1/20Ｍリン酸緩衝液
（PH8.0）で飽和した酢酸エチル（以下と略す）
を用いて調整したセルロース粉末のカラム（56×
２cm）に展開し、活性フラクシヨンを分取した。
活性フラクシヨンを水洗し、減圧下濃縮乾固し
93.6mgのネオエナクチンを得た。このネオエナク
チンを再び同様なセルロース粉末のカラム（87×
1.5cm）に展開し、活性フラクシヨンを分取し、
水洗後、減圧下濃縮乾固した。収量は43.3mgであ
つた。製剤化例１本物質（ネオエナクチン） 10（部）重質酸化マグネシウム 15 乳糖 75 を均一に混合して粉末または細粒状として350μ
以下の散剤とする。またこの散剤をカプセル容器
に入れてカプセル剤とした。製剤化例２本物質（ネオエナクチン） 45（部）澱粉 15 乳糖 16 結晶セルロース 21 ポリビニルアルコール３水 30 を均一に混合混和後、破砕造粒し乾燥し、ついで
篩別して1410〜177μの大きさの顆粒剤とする。製剤化例３製剤化例２と同様の方法で顆粒剤を作り、この
顆粒剤96部にステアリン酸カルシウム４部を加え
て圧縮成形して直径10mmの錠剤とする。製剤化例４製剤化例２の方法で得られた顆粒の90部に結晶
セルロース10部、ステアリン酸カルシウム３部を
加えて圧縮成形して直径８mmの錠剤とし、これに
シロツプゼラチン、沈降性炭酸カルシウム混合懸
濁液を加えて糖衣錠とする。製剤化例５本物質（ネオエナクチン） 0.6（部）非イオン系界面活性剤 2.4 生理食塩水 97 を加温混合後アンプルに入れ滅菌して注射剤とす
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はネオエナクチンのUV吸収を示す。第
２図はネオエナクチンのIR吸収を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１次の理化学的性状を有する抗真菌性物質ネオ
エナクチンおよびその官能性誘導体ならびにそれ
らの塩類を有効成分として含有する抗真菌剤。 (a) 元素分析値ネオエナクチンの元素分析値（元素分析によ
る百分率組成（平均値）％は下記の通りであ
る。Ｃ：63.47 Ｈ：10.04 Ｎ：7.44 （Ｏ：19.05）但し、ハロゲン元素および硫黄は検出されな
い。 (b) 融点ネオエナクチンの融点は、60.5乃至64.5℃で
ある。 (c) 紫外部吸収スペクトルネオエナクチンの紫外部吸収スペクトルは第
１図に示す通りである。また、各溶液中におけ
る吸収およびＥ^１％_１cmの値は以下の通りである。【表】 (d) 赤外部吸収スペクトル臭化カリウム錠剤法で測定したネオエナクチ
ンの赤外部吸収スペクトルは第２図に示す通り
である。 (e) 比旋光度ネオエナクチンのメタノール中に於ける比旋
光度は下記の通りである。〔α〕^１２ _Ｄ＝−14.2゜（Ｃ＝３）％ (f) 溶剤に対する溶解性ネオエナクチンの溶解性は下記の通りである。可溶：低級アルコール、酢酸エチル、エーテル、クロロホルム不溶：水、Ｎ−ヘキサン、石油エーテル (g) 呈色反応ネオエナクチンの呈色反応は下記の通りであ
る。ニンヒドリン反応＋ナフトレゾルシノール−リン酸反応＋ KMnO₄ ＋アンスロン−リン酸反応 − α−ナフトール−リン酸反応 − (h) Ｒ_f値ネオエナクチンのペーパークロマトグラフイ
ーおよびシリカゲルＧ薄層クロマトグラフイー
で各種展開溶媒で得られる単一スツポトのＲ_f
値は以下の通りである。（）ペーパークロマトグラフイー【表】（）シリカゲルＧ薄層クロマトグラフイー【表】 (i) 外観ネオエナクチンの外観は白色無定形の粉末で
ある。 (j) 酸、アルカリに対する安定性ネオエナクチンをPH9.0、100℃で５分間加熱
すると、ネオエナクチンの80％が失活する。し
かしながら、ネオエナクチンをPH2.6 100℃で
５分間加熱してもネオエナクチンのほぼ90％の
活性が保持される。