JPS5831327B2 - 動物用医薬組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗生物質Ａ−２３１５、更に詳しくは新規中性
含窒素抗生物質Ａ−２３１５を含有するヒトを除く動物
用医薬組成物に関する。

本発明の抗生物質Ａ−２３１５はアクチノプレーンズ属
に属する新規微生物、特にアクチノプレーンズ・フィリ
ッピネンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓｐｈｉｌｉｐ
ｐｉｎｅｎｓｉｓ ） ＮＲＲＬ ５４６２を深部好気
性条件下で、活性物質が実質的量で得られるまで培養す
ることによって得られる。

生成した抗生物質は培養液を沢過し、好ましくはこれを
有機溶媒で抽出し、活性アルミナまたはシリカゲル上刃
ラムクロマトグラフィーで精製することにより、無定形
固体として単離することができる。

本発明の抗生物質Ａ−２３１５は抗菌剤として有用であ
って、特にダラム陽性のストレプトコッカス菌に対して
著しい抗菌活性を示す。

また、抗生物質Ａ−２３１５は歯触症および歯根膜症を
誘発する微生物を抑制する効果を有する。

なおまた、抗生物質Ａ−２３１５は家禽飼料に配合する
とき発育を促進せしめる効果があり、加うるに植物用殺
菌剤として有用である。

抗生物質Ａ−２３１５は白色、無定形固体であって、質
量スペクトル分析によれば分子量５０３．２６３８であ
り、元素分析結果は次のとおりである：Ｃ１６１，５１
％；Ｈ１７，５１％；Ｎ、３．６９％：０．２１．５３
％。

上記分子量および元素分析結果に基づき、Ａ−２３１５
に対して実験式：Ｃ２６Ｈ３７Ｎ３０７が与えられる。

水−ジメチルホルムアミド６６％中、Ａ−２３１５の電
気滴定の結果から、測定し得る基の存在は認められない
。

メタノール溶媒（メタノール容量当りＡ−２３１５の濃
度０．３７５重量％）中、２７℃におけるＡ２３１５の
比旋光度は一１３２°である。

クロロホルム中におげろＡ−２３１５の赤外吸収スペク
トルは、次の極大吸収を有する（単位波長ミクロン、Ｗ
は「弱」、ｍは「中程度」、Ｓは「強」を表わす） ：
２．８１ （ｗ）、２．９９（ｗ〜ｍ）、３．３８（
ｍ）、５．８２（ｍ）、６．０２（ｓ）、６．２０（ｗ
）、６．３０（ｍ）、６．４０（ｗ）、６．６６ （ｒ
ｒｒ−ｓ ）、６．８２（ｗ）、６．９４（ｗ〜ｍ）、
７．０５（ｗ）、７．３０ （ｗ −ｍ ）、７．７１
（ｗ）、ｓ、 ｓ ｓ （ｗ−ｍ ）、９．１１ （ｗ
−ｍ ）、１０．４１ （ｍ ）、１０．８９ （ｗ−
ｍ ）、１１．１４（Ｗ〜ｍ）μＯ 抗生物質Ａ−２３１５の９５％エタノール中における紫
外吸収スペクトルは２１４ｍμ （ε４０．２００）において最大吸収を示し、その吸収
値（Ｅ１％）は７９９である。

１ｃｒＩ′Ｌ 抗生物質Ａ−２３１５はメタノール、エタノール、高級
アルコール、その他大抵の有機溶媒に可溶であるが、水
には微ｌ溶である。

下記溶媒系のペーパークロマトグラフィに検出微生物と
してサルシナ・ルテアを使用し、抗生物質Ａ−２３１５
のＲｆ値を測定した結果を次に示す： Ｒｆ値 溶 媒 系 ０．１９ ｙｌチルエチルケトン：ベンゼン：水（
１：５：１）、（上層）。

０．９１ 水飽和ブタノール ０．９１ 水飽和ブタノールおよび２％ｐ−）ル エンスルホン酸 ０．５６ 水飽和メチルイソブチルケトン ０．６０ 水飽和メチルイソブチルケトンおよび ２％ｐ−トルエンスルホン酸 ０．８３ 水：メタノール：アセトン（１２：３： １）を水酸化アンモニウムでｐＨ １０，５に調節し、次いでリン酸でｐＨ ７，５に調節。

え※０．７５ メチルイソブチルケトン１％、水酸化 アンモニウム０．５％−水。

０．７２ リン酸水素カリウム１７．４グ ール３０ｍ１／水１０００１７１１０ エタノ ０．６５ 塩化ナトリウム７％−メチルエチルケ トン２，５％−水 ０．８４ プロパツール：水（１：９）０．９０
ブタノール：エタノール：水（１３，５：１５：１５０
） 抗生物質Ａ−２３１５をアミノ酸分析すれば装置のアラ
ニンを放出する。

抗生物質Ａ−２３１５は２種の水酸基を含み、これを常
套の方法たとえハヒリジン中、無水酢酸でアセチル化す
ることにより、そのエステル誘導体を形成せしめること
がテキル。

このエステル誘導体も抗生物質として有用である。

前記のごとき物理的データと構造解明のための研究に基
づき、Ａ−２３１５に対し下記のごとき仮定的構造を提
案することができる。

この構造は確信をもって決定されるものではないが、事
実に基づく仮説として単的に表わされるものと理解する
ことができる。

抗生物質Ａ−２３１５はある種の微生物の発育を抑制す
る作用を有する。

抗生物質Ａ−２３１５の微生物発育を抑制する濃度は種
々の試験方法により決定することができる。

試１験法および試験結果を次に示す。

（１）円形平板スクリーニング試験法 寒天平板に試験微生物を接続したものを使用する。

直径６間の円形板（容量０．０２ｒｒＬｌ）に抗生物質
溶液のｆｏｇ’２希釈液を飽和させる。

円形板の含有量は使用する溶液濃度の１１５０、即ち１
５００μ？ ／ ｍｌ濃度の溶液から抗生物質３０μ２
の固形板含量が得られる。

上記のごときディスクプレートを使用し、抗生物質Ａ−
２３１５の微生物抑制試験をした結果を第１表に示す。

実験的に感染せしめたマウスの治療効果試験を行うに先
立って、抗生物質Ａ−２３１５の病原性グラム陽性微生
物に対する希釈培養液の効果を確認するため試験を行っ
た。

す。

その結果を第■表に示 実験的に細菌に感染せしめたマウスに抗生物質Ａ−２３
１５を皮下投与し、生体内試験を行った結果、Ａ−２３
１５は抗微生物活性を有することが見出された。

感染マウスに対し、抗生物質Ａ−２３１５の２投与量を
投与した時のＥＤ５ｏ値（供試動物の５０％を生存せし
めうる有効投与量（ワレン・ウィックら著ジャーナル・
オプ・バクテリオロジー第８１巻２３３〜２３５頁（１
９６１年）参照））を次に示す。

スタフィロコッカス・アラレ ９０■／に９ウス
３０５５ ストレプトコッカス・ピオゲ ８３１ｎｆｊ／に
９ネス シフロコツカス・ニューモニ ＞ １ ’６６ ｍ９
／ｋｙ工（パークＩ） マウスに対し抗生物質Ａ−２３１５を経口もしくは皮下
投与し、その急性毒性を試験した結果、そのＬＤｏ値は
５００１ｎ９／に９より犬、マウスに対し抗生物質Ａ−
２３１５を履腔内に投与し、その急性毒性を試験した結
果、そのＬＤ、。

値は４００即／に９より犬であった。

抗生物質Ａ−２３１５の他の有用性は家禽に対し病原性
を有する微生物：ミコプラズマ・ガリセプテイクム（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ
）に対し抗菌活性を有することである。

タイロシンに対し抵抗性を有する上記菌に対する抗生物
質Ａ−２３１５の活性は特に重要な点である。

この点について、希釈培養液の生体外試験によって決定
された最少抑制濃度を第■表に示す。

ひよこにおけるミコプラズマ・ガリセプテイクム感染の
治療： ミコプラズマ・ガリセプテイクム（ＭＧ）に感染したひ
よこに、エタノールに溶解したＡ−２３１５を５Ｉｖ／
−羽（１５０ｍ９／に９ ）の割合で注射することによ
り治療した。

１６日後にひよこを殺し、体重増加、生存ひよこにおけ
る肺胞のうの病変およびＭＧ抗体の出現率からＡ−２３
１５が有効であることがわかった。

更に、ミコプラズマ・ガリセプテイクムに感染した鶏に
抗生物質Ａ−２３１５を投与した場合には、若干体重が
増加し、且つ生残り鶏中に気嚢の障害例が減少する。

ポリエチレングリコール２００中に配合して抗生物質製
剤を調製し、これを鶏の首に皮下注射したところ、初期
に死亡した鶏中、首の部分に僅かに出血があった外は、
毒性の徴候は認められなかった。

結果を第■表に示す。第■表から明らかなように、本発
明は家禽におけるミコプラズマに起因する症状に対し有
効なる抗菌剤を提供するものである。

抗生物質Ａ２３１５を約５０〜５００■／に９（動物体
重）の投与量で非経口的もしくは経口的に投与するとき
、家禽がミコプラズマから保護される。

呼吸器病に対し予防あるいは治療目的のために使用する
ときは、適当濃度の抗生物質Ａ−２３１５を通常の動物
飼料に配合するのが好都合である。

本発明の他の利点は、抗生物質Ａ−２３１５が歯根膜症
の進行を助長する微生物の発育を抑制する効果を有する
ことである。

希釈培養液試験によれば、Ａ−２３１５はその１〜２μ
り／ｒｒＬｌノ濃度で菌蝕性微生物：ストレプトコッカ
ス・ムタンズ（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａ
ｎｓ ）の発育を抑制し、また０、１μｆ／ｒｕｌ以下
の濃度で歯触性線維状桿菌を抑制する。

抗生物質Ａ−２３１５溶液は次の試験で例証されるごと
く、歯触性微生物を抑制する効果がある：シュクロース
５％を含有する栄養液を試験管に入れ、歯触性微生物を
接種してこれを培養する。

栄養液表面下まで達するように細いガラス棒を上記試験
管内に挿入し、３７℃で一夜培養して人工的な斑点の層
（主として細胞およびデキストランから成る。

）をガラス棒の表面上に形成せしめる。次いで種々の濃
度のＡ−２３１５を含む溶液中にこのガラス棒を挿入し
、５．１０および１５分間抗生物質溶液に接触せしめる
。

その後このガラス棒を滅菌脱イオン水に浸してすすぎ、
シュクロースおよびブロモチモールブルーを含む無接種
媒体中、３７℃で一夜培養する。

かかる操作によりシュクロースを含む媒体中、微生物が
発育した時に生成する酸のため、ブロモチモールブルー
が緑から黄に変色することを指媒として微生物発育の有
無を検出する。

発育が検出されないときは抗生物質が微生物を死滅せし
めたことを示す。

上記試験法により、歯触性ストレプトコッカスｓｐ、を
使用して斑点層を形成したガラス棒を作威し、これを抗
生物質Ａ−２３１５の０．１％溶液に５分間程度接触せ
しめた結果、Ａ−２３１５は上記歯触性菌に対して有効
であることが見出された。

この抗生物質Ａ−２３１５は歯触性微生物および歯根膜
症に関連する微生物に対し活性を有するから、これらの
症状を抑制し得る濃度においては腔用予防剤たとえば歯
磨き用ペースト、粉剤もしくはゲルあるいは口腔洗浄剤
などに配合するのが適当である。

一般にＡ−２３１５約１〜１５％を含有する製剤が歯触
性微生物を抑制するために有効である。

抗生物質Ａ−２３１５の他の有用なる特性は動物の肥育
目的を改善し得る性質である。

Ａ−２３１５を４５．４Ｐ／）ンの濃度で肥育鶏の飼料
に添加して使用するとき、添加から１０日後の平均体重
増加量が１５９１であるのに対し、添加しないものの平
均体重増加は１４３１であった。

抗生物質Ａ−２３１５を与えた鶏の飼料変換率（給飼量
／体重増加量）は１．４４であるのに対し、抗生物質を
与えなかった鶏のそれは１．５３である。

抗生物質Ａ−２３１５の体重増加を促進せしめる性質は
肥育目的のため特に有用である。

この抗生物質を発育促進剤として使用するときは、これ
を適当な濃度で通常の動物飼料中に配合するのが好都合
である。

抗生物質Ａ−２３１５を飼料トン当り約２０〜５０ｆの
濃度で動物に投与するとき、発育促進剤として典型的効
果を有する。

本発明の抗生物質Ａ−２３１５の他の利点は植物用殺菌
剤として有用であることである。

４００ｐｐｍの濃度の抗生物質Ａ−２３１５により、豆
さび病菌（ウロミセス・ファゼオリ・バリエタス・テイ
ピカ（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｓｅｏｉｉ ｖａ
ｒ °ｔｙｐｉｃａ））を接種した豆類植物体を保護し
、炭痕病菌（コレトトリクム・ラゲナリウム（Ｃｏｌｌ
ｅｔｏｔｒｉｃＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕ ） ）を
接種１−たきゆうり植物体を保護することができる。

いづれの場合も植物に対する毒性は僅かしか観察されな
かった。

植物体を保護するため、抗生物質Ａ−２３１５の有効殺
菌投与量を種々の方法、たとえば所望に応じ適当な溶媒
、担体、乳化剤、湿潤剤または表面活性剤を使用し、液
体スプレー剤もしくは粉剤として使用することができる
。

個々の条件を考慮する必要があるが、約２００〜５００
ｐｐｍの量で植物体に投与するとき、Ａ−２３１５が典
型的に抗菌剤として有用である。

上記特性から明らかなごとく、抗生物質Ａ −２３１５
は病原微生物の発育を抑制するため有用である。

従って上記利用法に加うるに、該抗生物質２％程度を含
む溶液はガラス製品の殺菌、歯科的および外科的諸設備
、器具類の殺菌、並びにたとえば病院、食品処理機など
における滅菌状態を維持する必要のある場所における壁
、床、テーブルの表面殺菌に有効である。

本発明の新規抗生物質はアクチノプレーンズ属微生物の
Ａ−２３１５生態菌株を適当な培地中、好気的深部培養
条件下に、培地が実質的に抗生物質活性を含むまで培養
することによって製造することができる。

培地中に蓄積された抗生物質は当該技術で理解され、使
用されている種々の分離および精製法を適用することに
よりこれを回収することができる。

本発明の新規微生物であるアクチノプレーンズ・フィリ
ッピネンシスＮＲＲＬ５４６２は、カンサス州ベルビレ
（Ｂｅ１ｌｖｉｌｌｅ 、 Ｋａｎｓａｓ ）の穀物畑
で採取した土壌試料から分離した。

スプン一杯分を超えないほどの少量の土壌を滅菌ヘトリ
皿に入れ、滅菌水で浸した。

どろが静まったら直ちに、煮沸したキビ（Ｐ ａｓｐａ
ｌｕｍ ）草の葉２．３枚を、丁度表面に浮いているか
または一部だけが沈んでいる様な状態になる様に皿に入
れた。

４ないし７日後、双眼解剖顕微鏡（×約１００）を用い
、強い直射光下でこれらの葉を調べた。

アクチノプレーンズは、水の表面の空気中に形成した白
いきらきら光る胞子のうによって確認された。

次いで、胞子のうをつげた葉の小片を切り取り、３％の
平らな寒天に移した。

１個の胞子のうを切り取り、純培養を誘導した。

この純粋な貯蔵培養菌を、常法により種々の培養培地に
移植して成長特性および胞子のう形成を調べた。

また、アクチノプレーンズは金繍梅科（Ｌｉ ｑｕｉｄ
ａｍｂａｒ）の花粉を用いて分離することもできる。

この花粉は表面または表面直下に浮かぶので煮沸した葉
よりも好都合であり、また、アクチノプレーンズは３な
いし４日で花粉表面に現れる。

アクテノプレーンズを付けた花粉は、双眼解剖用顕微鏡
下でこれをつまみあげ、平面寒天に移し、そして純培養
を調製するためＶＣ１個の胞子の５を切りとるのが簡単
である。

この分離法はコーチ（Ｃｏｕｃｈ ）Ｋよって記載され
ている（ Ｔｒａｎｓ 。

ｏｆ Ｎ−Ｙ、Ａｃａｄ−ｏｆ Ｓｃｉ 、 １６
３１５−３１８（１９５４））。

抗生物質Ａ−２３１５生産のため有用なる微生物は分類
学的にアクチノプレーンズ・フィリッピネンシス・コー
チ（Ａ ｃ ｔ １ｎｏｐ １ａｎｅ ５ｐｈｉｌｉｐ
ｐｉｎｅｎｓｉｓ Ｃｏｕｃｈ ）と命名される新菌
株としての特色を有する。

アクチノプレーンズ属は放線菌目のアクチノプレーンズ
科の１属である。

アクチノプレーンズ科はコーチ（Ｃｏｕｃｈ ）により
最初に記載された（ジャーナル・オブ・エリシャ・ミツ
チェル・サイエンテフイク・ソサイエテイ第６５巻３１
５〜３１８頁（１９４９年）、同書第６６巻８７〜９２
頁（１９５０年）、トランザクションズ・オブ・ニュー
ヨーク・アカデミ−・オブ・サイエンス第１６巻３１５
〜３１８頁（１９５４年）、ジャーナル・オブ・エリシ
ャー・ミツチェル・サイエンテフイク・ソサイエテイー
第７１巻１４８〜１５５頁および２６９頁（１９５５年
）、バーシーズ・マニュアル・オブ・デイタミネイテブ
・バクチリオロジー第７版８２５〜８２９頁（１９５７
年）、ジャーナル・オブ・エリシャー・ミッチェル・サ
イエンテフィク・ソサイエテイ第７９巻５３〜７０（１
９６３年）参照）。

アクチノプレーンズ属のＡ−２３１５生脆菌株の菌学的
研究に取入れられた方法はザ・インターナショナル・ス
トレプトミセス・プロジェクトにより推奨される方法並
ひに分類学で通常使用される補足試験法と同様なもので
ある。

（シャーリング（Ｅ、Ｂ、Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）およびゴ
ツトリーブ（Ｄ。

Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）著ｒメソヅ・フォア・キャラクタラ
イゼイション・オブ・ストレプトミセス・スペイシーズ
」インターナショナル・プレテン・オブ・システミク・
バクテリオロジー第１６巻３１３〜３４０頁（１９６６
年）参照）。

次に本発明において使用するアクチノミセス・フィリッ
ピネンシスＮＲＲＬ ５４６２菌の菌学的特性について
述べる。

形態学的特性： 発育菌糸体 合成および半合成寒天培地上の菌糸は最初、短く、僅か
に分枝しており、隔膜を有し、その直径は０．２〜１．
２μｍである。

約２週間後のコロニは寒天培地中により深く広がった菌
糸基質から垂直的に延びてよく識別できる塊より成るも
のであるかあるいは垂直的菌糸が不明瞭で、より短く、
僅かにムコイド状の塊より成ることもある。

よく識別できる垂直的菌糸塊を有するコロニーにおいて
、菌糸体は緻密で僅かに発育した皮状発育体を形成する
。

より短い菌糸を有するコロニーの菌糸体は明瞭なドーム
形の発育体を形成する。

いかなる培地上でも気生菌糸は生育しない。

胞子溝はドーム形コロニー表面上で多数形成される。

胞子溝 半合成アミオーヘンセン寒天上で豊富に胞子溝を形成す
る。

これは１７〜１９°Ｃで接種約２〜４週間後に現われる
。

非常に短い胞子嚢柄（寒天表面上菌糸の端末部分）上に
胞子溝が１個づつ形成される。

胞子溝は球形、やや球形もしくは僅かに扇形のこともあ
り、比較的小形で直径４〜１０μｍである。

胞子溝は球形に近い胞子嚢胞子２０〜４０個を含み、こ
の胞子は胞子嚢中で不明確な１個もしくはそれ以上のコ
イル状をなして配夕１ルている。

胞子嚢胞子は成熟゛時の直径約１．０μ椛である。

胞子溝の裂開は個々の胞子溝の完全または部分的破壊に
より起ると考えられる。

水中に入れて１０〜１５分後、典型的球形に膨潤し始め
、嚢・壁の崩壊により胞子を放出する。

通常、胞子は直ちに運動することはないが、約５分以内
に低部の硬毛によって活発に運動するようになる。

培地上の外観： ザペツク溶液−寒天 発育は良好。

４週間で１接種点から直径約０．７５Ｃｒ／Ｌのコロニ
ーを形成する。

気生菌糸は観察されない。

コロニーは一般に平らで、中心部が僅かに隆起している
。

コロニーの色は温和なオレンジ色である。

まれに胞子溝が観察される。ペプトンーザペツク溶液−
寒天 発育は良好。

４週間で１接種点から直径約１．０儂のコロニーを形成
する。

気生菌糸は観察されない。

コロニーは僅かに隆起し、幾らから旋状もしくは不規則
なでこぼこがある。

胞子溝は観察されない。

アミオ・ヘンセン−寒天 発育はかなり良好。

４週間で１接種点から直径約０．５ＣｒｒＬのコロニー
を形成する。

気生菌糸は観察されない。

コロニーは円形、十字形または星形で、中心部に陥没も
しくは割れ目を有する。

コロニーの色は暗灰色ないし灰白色である。

胞子溝は１７〜１９℃で培養したコロニー上に多数、比
較的高い温度で培養したコロニー上に少数形成される。

種々の培地上の培養特性を第７表に示す（略号ＩＣＰは
インターナショナル・ストレプトミセス・プロジェクト
・メデア（シャーリング・アンド・ゴツトリープ）を示
す）。

ＮＲＲＬ ５４６２の細胞膜化学はアクチノプレーンズ
・フィリッピネンシス・スツアミスッロ・アンド°グツ
ダー（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｐｈｉｌｉｐｐｉｎ
ｅｎｓｉｓＳｚａｎｉｓｚｌｏ ａｎｄ Ｇｏｏｄｅ
ｒ ） １９６７のそれと非常に類似する。

細胞膜を１００℃で１８時間、６Ｎ塩酸１ｍｌで加水分
解した後、得られた残漬のアミノ酸およびアミノ−糖自
動分析を行った結果、細胞膜中にグルコサミン、ムラミ
ン酸、グリシン、アラニンおよび２・６−ジアミノピメ
リン酸※ ※（ＤＡＰ）が多量に存在することが判明した。

２・６−ジアミツー３−ヒドロキシ−ピメリン酸（ＨＤ
ＡＰ）が存在しないことは著しい特色である。

アクチノフレーンズ・フィリッピネンシスＮＲＲＬ５４
６２とアクチノプレーンズ・フィリッピネンシス・スツ
アミスツロ・アンド・ブラダ−の細胞膜中のアミノ酸を
比較した結果を第■表に示す。

細胞膜を１００℃で２時間、２Ｎ硫酸２ｍｌで加水分解
した後、得られた残漬のペーパークロマトグラフィーを
行った結果、細胞膜中に検出し得る量でグルコース、ガ
ラクトース、マンノース、アラビノース、キシロースお
よびラムノースなどの単糖類の存在することが確認され
ｔうこれらの糖類はアクチノプレーンズ・フィリッピネ
ンシス・スツアミスツロ・アンド・ブラダ−中にも見出
される。

生理学的性質： （１）カタラーゼ生産＊１ ＋（２）
ゼラチンの液化 ＋（３）メラニン
様色素の生成＊２ ＩＳＰ 應１ ＋ ＩＳＰ Ａ６ ＋ ＩＳＰ Ａ、７ ＋改良ＩＳＰ
１６７ （４）ＮａＣ１耐性（％）＊３１ （５）スターチの加水分解＊４ ＋（６）
脱脂牛乳の加水分解 ＋ （７）脱脂牛乳のペプトン化 （８）生育温度範囲＊５ １０〜３７℃ ＊ １ ： Ｂｌａｚｅｖｉｃの方法（Ｂ １ａｚｅｖ
ｉｃ −Ｄ−Ｊ。

およびＧ −Ｍ 、Ｅｄｅｒｅｒ 、ｌ ９７５、’
Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ □ｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｔｅｓｔｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ？Ｊ ｏｈｎ Ｗｉ ｌａｙ ａｎｄ
Ｓ ｏｎｓ ・Ｉ ｎｃ −１ＮｅｗＹｏｒｋ、ｐｌ
３６ ）に従い、新鮮な寒天斜面培地の表面にＨ２Ｏ２
を加え、酸素 の放出を観察することにより測定した。

＊２：メラニン様色素生産（クロモジエネシティー）は
Ｉ ＳＰ Ａｌ （トリプトン−イーストエキスブロ
ス培地）、 ｌ５ＰＡ６（ペプトン−イーストエ キス鉄寒天培地）、ｌ５ＰＡ７（チ ロシン寒天培地）および改良ＩＳＰ ＆７（チロシンを除去した培地）につ いて調べた。

＊３：ＮａＣ１耐性は、ＩＳｐ Ａ２培地に、所望の
濃度になるまでＮａＣ１を添加す ることにより測定した。

＊４：スターチの加水分解はＩＳＰ Ａ、４（無機塩
類−スターチ寒天培地）プレ ート上、スターチの存在を沃素で検出 することにより測定した。

＊５：生育温度範囲は、所定の温度でｌ５ＰＡ２のブレ
ートを１４日間インキュベ ートすることにより測定した。

Ａ−２３１５を生産する微生物を前記分類学的記載に基
づきアクチノプレーンズ・フィリッピネンシス・コーチ
という新菌株として分類した。

この菌はグルコース・アスパラギン寒天培地上で胞子溝
を生産せず、３種の培地上で色が僅かに異なる点におい
て、この種に関する従来の刊行物における記載とは異な
るが、これらの差異は菌株間の変異を示すものであって
、種間差異を示すものではない。

抗生物質Ａ−２３１５を生産するために有用なアクチノ
プレーンズ属微生物の菌株はアメリカ合衆国イリノイ州
６１６０４ペオリアに住所を有する農務省ジ・アグリカ
ルチュラル・リサーチ・サービス・ノーザン・マーケツ
テング・アンド・ニュートリジョン・リサーチ・デビジ
ョンにアクチノプレーンズ・フィリッピネンシスＮＲＲ
Ｌ５４６２として寄託されており、一般に分離可能であ
る。

また、本菌株は千葉市稲毛東５丁目８番１号、工業技術
院微生物工業技術研究所に委託番号第２１８１号として
寄託されている。

前記のごとく、アクチノプレーンズ・フィリッピネンシ
ス・ＮＲＲＬ５４６２はこれを培地中で発育させること
により抗生物質Ａ−２３１５を生差することができる。

培地としては種々の培地を使用できるが、生産上の経済
性、抗生物質の生産量、抗生物質分離の容易性などの点
から、ある特定の培地を使用するのが好ましい。

たとえば、炭水化物源としてグルコースが好ましく、窒
素源として大豆粉が好ましい。

培地に配合すべき栄養無機塩はナトリウム、カリウム、
アンモニウム、カルシウム、リン酸、塩酸、硫酸、酢酸
、炭酸などのイオンを生ずることのできる常套の塩であ
ってよい。

加うるに、発育要素源たとえばデイステラーズソリュー
ブル、酵母エキスを包含せしめることによって好都合な
結果を得ることができる。

他の一般の微生物の生長および発育に必要な微量の必須
元素もまた本発明で使用するアクチノプレーンズ属の微
生物用培地に含有せしめる必要がある。

かかる微量元素は通常、他の培地成分の添加に伴って不
純物として供給される。

培地の初期ｐＨは広範囲に変えることができる。

しかし、微生物の接種に先立ち、培地のｐＨを６．５〜
７．３の範囲に調節するのが好ましく、この範囲は使用
する培地に依存する。

最終ｐＨ値は少なくともある程度、培地の初期ｐＨ１培
地に存在せしめた緩衝剤、微生物の培養時間により決定
される。

実質的な収量で抗生物質Ａ−２３１５を生産するために
は、好ましくは大型タンクを使用し、深部好気性条件下
に発酵させる。

少量の抗生物質を得るときは振盪フラスコによって発酵
を行う。

大型タンクに微生物を胞子型で接種したときは通常、接
種から抗生物質産生までに時間のずれがあるから、かか
る場合は発育用接種材料を使用するのが好ましい。

この発育用接種材料は少容量の培地に微生物の胞子型ま
たは菌糸体の小片を接種し、新鮮で且つ発育活性を有す
る培養菌を得ることにより製せられる。

次いでこの発育用接種材料を更に大きいタンクに移す。

この発育用接種材料を発育させるための培地は更に大規
模な発酵に使用するものと同一のものであってよいが、
他の培地を使用してもよい。

Ａ−２３１５を生産する微生物は約２０〜４０℃で発育
させることができる。

約３０℃でＡ２３１５の最適生産を行うことができる。

液中、好気培養法で通常行われているように、滅菌空気
を培地に吹き込む。

微生物を能率的に発育せしめて抗生物質Ａ−２３１５を
得るためには、Ａ−２３１５生産タンク中に導入する空
気容量は培地１容当り約０．１容量分とするのが好まし
い。

空気容量は培地１容当り約０．２〜０．８容量分とする
とき最適発育を与える。

発酵処理の間、発酵液の試料を採取し、本発明の抗生物
質に敏感であることが知られている微生物に対する抗生
物質活性を試験することにより、抗生物質の産生を監視
することができる。

この試験に使用される微生物の１例としてサルシナ・ル
テナを挙げることができる。

この生物学的試験法は寒天平板培地上置形紙試験法によ
って好都合に行うことができる。

大型タンクまたは振盪フラスコ発酵において通常、２〜
６日以内に本発明抗生物質の最高生産量を与える。

通常２０〜９６時間以内に最高抗生物質活性が与えられ
る。

抽出および吸着法により、培地中に存在しうる他の物質
から抗生物質Ａ−２３１５を分離、回収することができ
る。

濾過後、最初にＡ−２３１５を回収するためには、抽出
法が好ましい。

濾過した塩基性発酵液から抗生物質を分離するための適
当な溶媒はクロロホルムであるが、通常使用する他の溶
媒であっても満足な結果が得られる。

次いでＡ−２３１５を更に精製するため、吸着剤たとえ
ば活性炭、ポリアミド樹脂、シリカゲル、セファデック
スＬＨ−２０、アンバーライトＸＡＤ重合吸着剤を使用
、吸着および溶出法を行うことにより好都合にＡ−２３
１５を分離することができる。

次に参考例および実施例を挙げ本発明を更に具体的に説
明する。

但し、本発明方法の技術的範囲が実施例に記載の範囲に
制限されるものと理解されてはならない。

参考例 Ｉ Ａ、振盪フラスコ発酵によるＡ−２３１５の製造：組成
： 予め煮沸処理後、乾燥したオー）ミール ６０．１’；完全に粉砕した醸造用乾燥酵母２．５２；
リン酸水素カリウム１．０ｆ；ザペツク（Ｃｚａｐｅｋ
）の鉱物原料＊５．Ｏｍｌ；寒天２５４０グ；脱イオ
ン水１１００．０ｒｎ１０ （＊ザペツクの鉱物原料の組成：硫酸第一鉄・７水塩（
濃塩酸２ｍｌ溶液中）２．０Ｐ；塩化カリウム１００．
０Ｐ；硫酸マグネシウム・７水塩ｉｏｏ、ｏｙ；脱イオ
ン水を加え全量を１０００ｒｆＬｌに調製。

）上記組成を有する寒天斜面培地上、アクチノプレーン
ズ・フィリッピネンシスＮＲＲＬ５４６２培養物を調製
する。

即ち上記組成の培地を水酸化ナトリウム溶液でｐＨ約６
．２〜７．３に調節する。

オートクレーブ中、１２０℃（圧力１５〜２０ボンド）
で３０分間処理して滅菌する。

この処理によりｐＨ６，７の培地を製る。この培地から
常套の方法に従って斜面培地を製する。

得られた斜面培地にアクチノプレーンズ・フィリッピネ
ンシスＮＲＲＬ５４６２を接種し、３０℃で１０〜４０
日間培養する。

培養物はこれを培地上で胞子形成せしめる目的を有する
ものでないから、潜在的発育中心点の数を増加せしめる
ため、平らで鋭利な接種針で菌糸体業落を柔らかにする
必要がある。

この培養物に肉汁を加え、これを滅菌枠で注意しながら
混ぜ合わせて菌糸懸濁物を作る。

この懸濁物を凍結乾燥用の管６個に入れ、凍結乾燥菌株
を調製する。

次の組成を有する発育培地５０７７２１に上記凍結乾燥
ペレット１個を接種するニ ゲルコース１０．０グ；ポテトスターチ３０．Ｏｔ；大
豆粉２０．０？：脱脂綿実粉２０．０？：炭酸カルシウ
ム２．０ｆ；水道水１１００ｒＩｌ１０接種を終った発
育培地を２５０ｒｎｌフラスコ中、回転振盪機上２５０
ｒｐｍで回転しながら３０℃で７２時間培養する。

前記と同一の組成を有する第２段工程の発育培地２００
ｍ１に、前段で培養した発育用培地１０ｍ１を接種する
。

第２段工程の培地を１０１００Ｏフラスコ中、回転振盪
機上２５ Ｏｒｐｍで回転しながら３０℃で２４時間培
養する。

Ｂ、タンク発酵によるＡ−２３１５の製造ニゲルコース
１．０％：ポテトスターチ４．０％；糖蜜０．５％；可
溶性肉ペプトン４．０％；酵素−加水分解カゼイン０．
４％：大豆粉１．０％：硫酸マグネシウム０３％；炭酸
カルシウム０．２％；消泡剤（グラ・コーニング）０．
０２％；水道水を加え全量を２５０００ｍｌにする。

上記組成を有する抗生物質製造用滅菌培地２５０００Ｔ
Ｌｌに、前記Ａに記載の第２段工程で製せられた発育用
培地２００ｍ１を接種して培養する。

即ち先ず、培地をオートクレーブ中、圧力１５〜２０ポ
ンド、温度１２０℃で３０分間滅菌した後、培地をｐＨ
６，４に調節する。

接種した製造用培地を４００００ｍ１発酵タンク中、３
０℃で４日間発酵させる。

この間、発酵培地容量に対し、１分間当り１／２容の速
度で滅菌空気を通して発酵培地を通気し、常套の攪拌機
（４００ｒｐｍ）で攪拌する。

Ｃ，Ａ−２３１５の分離 上記Ｂの操作により、２５０００ｍｌタンク培養物から
得られた全発酵液に濾過助剤を加えてこれを濾過する。

濾液を２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８，５に調節する。

得られた溶液をクロロホルム２／３容で抽出する。

クロロホルム抽出物を減圧下に濃縮し、攪拌しながら石
油エーテル（スケリソルプＦ）２０容を徐々に加える。

沈殿を濾取し、減圧下に乾燥して粗抗生物質３１３１を
得る。

この粗抗生物質を酢酸エチル１００ｍ１に溶解し、塩基
性アルミナ（ドイツ国エシュウエーゲ市所在、エム・ウ
エルム社製）カラム（直径２の、長さ１００ＣｒｒＬ）
に通す。

ガラムを酢酸エチル３００ＴＩｌｌで洗い、酢酸エチル
：エタノール（１９：１）で溶出して活性物質Ａ−２３
１５を含む分画を得る。

これらの分画を集め、減圧下に蒸発乾燥する。

この残渣を少量のクロロホルムに溶解し、溶液を石油エ
ーテル（スケリソルプＦ）２０容に加えて活性物質を沈
殿させる。

沈殿を濾取し、減圧下に乾燥して抗生物質Ａ２３１５を
１，６３１得る。

試験微生物としてサルチナ・ルテナを使用し、濾紙−円
形寒天−プレート試験法により、またシリカゲル上、展
開系として酢酸エチル：エタノール（９：１）を使用す
る薄層クロマトグラフィーおよびバイオオートグラフィ
ー用微生物としてサルチナ・ルテナを使用する試験法に
よって活性物質の溶出を監視するか、または活性物質を
検出するためにヨー素蒸気処理もしくは硫酸スプレー法
を行う。

参考例 ２ シリカゲルを使用する抗生物質Ａ−２３１５の精製： 前記実施例ＩＣの操作に従って活性物質を石油エーテル
で沈殿させ、抗性物質Ａ−２３１５の粗生成物５１を分
離する。

この生成物を酢酸エチル約１０ｒｎｌおよび充分量のメ
タノールに溶解して清澄な溶液を得る。

この溶液をシリカゲル（メルク製）（酢酸エチル充填）
３００５’を含むカラム（直径５ｃｒｒＬ、長さ９０ｃ
ｍ）に加える。

次いでカラムを酢酸エチル２５０００ｍＡ’で洗い、不
純物を除く。

酢酸エテル：エタノール（９５：５）を溶出液とし、Ａ
−２３１５活性成分をカラムから溶出する。

これらの活性分画を合し、減圧下に濃縮乾固し、白色粉
末として２．ＯｆのＡ−２３１５を得る。

上記溶媒系を使用して溶出し、淡黄色粉末として更に０
，８グのＡ−２３１５を得る。

実施例 １ 豚赤・痢のＡ−２３１５による制御： 豚赤痢は結腸に限定される豚の下痢疾患であり、トレポ
ネーマ・ヒオジセンテリアエ（Ｔ ｒｅｐｏｎｅｍａｈ
ｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ ）によって発病する。

この病気は世界中でみられ、死亡および成長阻害のため
経済的損失をもたらしている。

豚赤痢は、豚赤痢にかかった豚から調製した結腸の掻爬
物および内容物の塩水懸濁液を豚に経口投与して感染さ
せることにより、簡単に発病させることができる。

３２頭の離乳した豚を、１つの豚小屋に入れた豚の平均
体重が他の小屋のものと同じ程度になる様に、１つの小
屋に４頭づつ入れた。

２つの小屋の豚に＆ｉ、Ａ−２３１５を１００グ／ｌの
割合で含有する飼料を与えた。

同様に、別の２つの小屋の豚には５０Ｓ’／ｌ、さらに
もう２つの小屋の豚には２５Ｐ／ｌのＡ−２３１５を含
む飼料を与えた。

残りの２つの小屋の豚にはＡ−２３１５を含まない同じ
飼料を与えた。

２．３日後、全ての豚に結腸物質を経口投与した。

毎日豚の生死を観察し、６週間後に生き残った豚を殺し
た。

死んだ豚の全てについて、豚赤痢を示す結腸の病変を検
査した。

その結果を以下の第■表に示す。

第■表から明らかな様に、Ａ−２３１５は２５Ｐ／ｌの
投与量で豚赤痢の制御に有効であることがわかる。

別のロットのＡ−２３１５を用い、５０．２５および１
０ｆ／ｌの割合で投与するほかは上記と同じ試験を行な
ったところ、全ての投与量において極めて有効であると
いう結果を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 抗生物質Ａ−２３１５を必須成分として含有するヒ
   トを除く動物用抗菌剤組成物。