JPS624701A - リポ多糖体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、リポ多糖体及びその製造法に関する。更に詳
しくは、抗腫瘍活性、免疫調節活性、細胞賦活活性、感
染防御活性等の生理活性を有するリポ多糖体、及び放線
菌及び／又はその類縁細菌からリポ多糖体を効率よく製
造する方法に関する。

［従来の技術］ 生型結核菌ＢＣＧ菌体或いは嫌気性プロピオニバクテリ
ウム菌体等が、従来から免疫増強剤として用いられ、抗
腫瘍活性を有することが知られているが、反面強い副作
用を発現することも明らかであり、臨床面への適用の障
害となっている。

そのため、これら有効性を示す菌体或いは類縁の菌体か
ら有効成分を取り出し、副作用成分を除く各種の試みが
なされてきた。

特に、ミコバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属
、ノカルジア属等の細菌の菌体成分とその活性に関する
研究が活発に行なわれ、各種の生理活性成分が単離、精
製され、更にその成分の修飾により活性を上昇させる試
みもなざれてきた。すなわち細胞壁骨格成分（特開昭５
４−２８８１３号他）、ムラミルジペプチド（特開昭５
２−１５６８１２号（１！り、ムラミルジペプチドの修
飾物（特開昭５６−４９３９６号他）、アジュバント活
性物質（特公昭５８−４０９号他）、熱水抽出物（特公
昭４８−４３８４２号他）、リポ多糖体を有効成分とす
る腫瘍免疫療法剤（特開昭５６−８３２０号他）は既に
開示されており、最近リポ多糖体およびその製造法（特
開昭５９−１６１３２０号）が開示された。

［発明が解決しようとする問題点］ しかし、これらのリポ多糖体はいずれも活性及び副作用
の点で必ずしも充分とはいえず、又その製造法も収率が
あまり高くなく、より一層の改善が望まれていた。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、大型結核菌ミコバクテリウム・ラベルク
ローシス、生型結核菌ミコバクテリウム・ボビス、更に
は非病原性嫌気性菌プロピオニバクテリウム・アクネス
等の細菌菌体について、副作用を示さず且つ抗腫瘍活性
、免疫調節活性、細胞幼若化活性等の有効性を示す成分
を、更に収量良く取得し且つ比活性の高い形に精製する
べく研究を続けてきた。

その結果、これらの菌体を非イオン性或いはイオン性界
面活性剤を用い、更には物理的破砕操作を加えることに
より、好収率で目的物が得られることを発見し、又粗リ
ポ多糖体を有機溶媒の組み合わせにより分画し、更に固
定化蛋白分解酵素により除蛋白することにより比活性を
数倍高め得ることを発見し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はＤ−アラビノースが１に対しＤ−マ
ンノースが１〜３なる構成の多糖体８Ｏ−９５（韓ｌ）
り％と、脂肪酸５〜２０（Ｗ／す）％とから成るリポ多
糖体、及び放線菌及び／又はその類縁細菌を培養して得
られる菌体を破砕し若しくは゛破砕しないで界面活性剤
溶液により抽出し、酵素消化、分子量分画、溶媒分画の
組合せにより精製することを特徴とするリポ多糖体の製
造法にかかるものである。

本発明のリポ多糖体の製造法について説明する。

適切な培地により好気的或いは嫌気的に培養して得た菌
体を、除菌濾過或いは遠心分離により集めて適切な方法
により滅菌し、或いは培養培地中で直接適切な方法によ
り滅菌して死菌体を得る。菌体をよく洗浄した後、凍結
融解、超音波処理、或いはフレンチプレス等の物理的手
段により破砕する。破砕は水懸濁液中であっても、界面
活性剤の水溶液に懸濁した状態で行なってもよい。破砕
された菌体は、水懸濁液中のものはこれに界面活性剤を
加え、界面活性剤存在下のものはそのまま、室温で撹拌
し、遠心分離により菌体層を除去し抽出液を得る。尚、
死菌体を破砕しない場合には、死菌体を界面活性剤水溶
液中で撹拌し、）濾過或いは遠心分離して抽出液を得る
。

こうして得た抽出液に適当な有機溶媒を加えて、粗多糖
体を沈殿させる。得られた粗多糖体を適当な緩衝塩類溶
液に乳濁させてアミラーゼ及びアミログリコシダーゼで
処理し、熱処理により酵素類を沈殿除去後、限外濾過若
しくは分子篩カラムにより、高分子として表現される粗
すポ多糖体画分を分取し、凍結乾燥する。

得られた粗リポ多糖体をピリジン−メタノール、クロロ
ホルム−メタノール等の適当な有機溶媒の組み合せによ
り分画して、混在するリン脂質等を除去する。蛋白質が
混在する場合は、適切な塩類溶液に溶かし、アクチナー
ゼＥ等の固定化蛋白分解酵素で処理して、凍結乾燥する
ことにより精製リポ多糖体を得る。

使用する菌は、放線菌目及びその類縁細菌［Ｂｅｒｇｅ
ｙ’Ｓ　Ｍａｎｕａｌ新版（１９７４）細菌分類方式に
分類される細菌］であればよく、使用する菌体はあらか
じめ適当な有機溶媒の組み合せにより脱脂操作を加えた
ものであってもよく、又適当な蛋白消化酵素により処理
したものであってもよい。

本発明のリポ多糖体の性状は、外観は白色乃至微灰白色
の粉末であり、蒸溜水若しくは生理食塩水にわずかに白
濁して溶けるが、有機溶媒には溶けない。本発明の物質
の組成はＤ−アラビノース及びＤ−マンノースを主たる
構成糖とする多糖体に、主としてＣ１４乃至Ｃ１０の脂
肪酸がエステル結合したものであり、多糖体８０〜９５
（訂臀）％及び脂肪酸５〜２０（Ｗ／Ｗ）％を含む。又
本物質は水系溶媒中では疎水的ミセル構造を形成してい
る・ものと考えられ、各種の分子量測定手段において、
極めて高分子でおるが如き挙動を示す。

本発明のリボ多糖体は、アルカリ水溶液、アルカリ緩衝
液によっても抽出され、同様の精製操作により取得でき
る。しかし強アルカリ或いは加熱弱アルカリによっては
、鹸化されて分子量約１２０００のアラビノマンナン、
分子量約７０００のマンナン及び脂肪酸のアルカリ塩を
与える。

［作　　用」 次に、以上の操作によって得られるリボ多糖体の生理活
性について、抗腫瘍活性、細胞幼若化活性、多クローン
性Ｂ細胞活性化能、食細胞活性化能の試験成績を詳しく
説明する。尚、供試物質としては、後記実施例１．２．
３により調製したリボ多糖体を使用し、対照には適宜必
要に応じて対応量の生理食塩水を用いた。

先ず腫瘍増殖抑制効果及び腫瘍退縮効果を指標とした抗
腫瘍活性の試験成績について説明する。

８週令のＣ５７ＢＬ／６１１ｔｌｔ性マウスの上腹部皮
下に、メチルコラントレン誘発同系！ＩＩ瘍ＭＣ−１を
１×１０”個／匹接種し、１ｕ１０匹として移植後１０
日目に、０．２ｍｌの生理食塩水に溶解さけた試料を腹
腔内に投与し、移植後２４日目に層殺し腫瘍を摘出して
重量を測定する。Ｔ／Ｃ値を次式により算出して、腫瘍
増殖抑制効果を判定した。対照群には同スケジュールで
生理食塩水０．２ｄを結果を表１に示す。

表１　抗腫瘍活性 本試験の結果、本発明のリポ多゛塘体は、いずれもマウ
ス同系腫瘍に対して極めて優れた増殖抑制作用及び退縮
作用を有することが判明した。

次に、細胞幼若化活性の試験成績について説明する。

８週令のＣ５７ＢＬ／６系雌性マウスの正常牌細胞を取
り出し、各実施例で得られたリボ多塘体各１０ｕａと共
に培養し、細胞にょる３Ｈ−デミジンの取込量を測定し
て、リポ多′塘体による細胞賦活作用を判定した。対照
としては、対応量の生理食塩水と共に培養したものを用
いた。各試験群共に同一の動物個体からの細胞を用いて
試験を行ない、５匹の動物個体について同試験を繰返し
た。

試験の結果を表２に示す。

本試験の結果、本発明のリボ多糖体は、いずれもマウス
の牌細胞のチミジン取り込みを著しく増強し、優れた細
胞賦活作用、細胞幼若化作用を有することが判明した。

表２　細胞幼若化作用 次に、多クローン性Ｂ細胞活性化試験の成績について説
明する。

１００週令ＣＤＦ＋系雌性マウスの正常牌細胞を取り出
し、各実施例で得られたリポ多糖偉容１０μ９と共に培
養し、抗トリニトロフェニル化ウマ赤血球プラーク形成
細胞を計数して活性を評価した。対照としては、対応量
の生理食塩水と共に培養したものを用いた。各試験群共
に同一の動物個体からの細胞を用いて試験を行ない、５
匹の動物個体について同試験を繰返した。

試験結果を表３に示す。

表　３　　多クローン性Ｂ細胞活性化能本試験の結果、
本発明のリポ多糖体はいずれも多クローン性Ｂ細胞活性
化能を有することが判明した。

次に、食細胞活性化作用の試験成績について説明する。

８週令のＢＡＬＢ／ｃ雄性マウスに各実施例で得られた
リポ多糖偉容１０ＪＪｇ（生理食塩水０．２ｙｐｌに溶
解）を腹腔内投与し、２日後に腹水を取り出し、腹腔細
胞のうちプラスチックシャーレに付着する細胞２Ｘ１０
’個に対して同系腫瘍（Ｍｅｔｈ）Ａ細胞ｌＸ１０’個
を加えて、ウシ胎仔血清添加培地中で２４時間培養後、
３日−チミジンを添加して更に１６時間培養した後、３
Ｈの取り込み量により腫瘍細胞の増殖に及ぼす活性化マ
クロファージの作用を判定し、これに基いて試料のマク
ロファージ活性化能を判定した。１群を１０匹とし、対
照群には対応量の生理食塩水を投与したちの試験の結果
を表４に示した。

表　４　　マクロファージによる腫瘍細胞増殖抑制作用
本試験の結果、本発明のリポ多糖体は、マウスのマクロ
ファージの活性化を促す物質であることが裏付けられた
。

［実　施　例］ 本発明を実施例によって更に詳しく説明するが、本発明
はこれらの実施例によって何ら限定を受けるものではな
い。

実施例１ ミコバクテリウム・ラベルクローシス青白Ｂ（）１ｙｃ
Ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　５
ｔｒａｉｎ　ＡｏｙａｍａＢ）をツートン培地中で３７
°Ｃ１５週間培養し、１００’Ｃ，２０分間加熱滅菌し
た後、）濾過、水洗して得られた死菌体を、１．５（Ｗ
／Ｗ）％トリトンＸ−１００水溶液（湿菌体重量の約５
倍量）に懸濁し、撹拌及び超音波処理により分散させた
後、更にフレンチプレス（１５００ｋｇ／ｃｍ２）によ
り菌体破砕を行なう。４０，０００ｘｇ　、３０分間遠
心分離して得られた上澄に９倍員のエチルアルコールを
加えて撹拌し、５，０００ｘｇ　、１５分間の遠心分離
により沈降する両分を集め、エチルアルコール、続いて
エチルエーテルで洗浄し乾燥する。得られた沈殿を酢酸
緩衝液中でアミラーゼ及びアミログリコシダーゼで処理
し、加熱後遠心分離して変性酵素を除く。限外）濾過に
より分子量１０万以上の両分を濃縮し、凍結乾燥して粗
リボ多糖体を得る。

本物質をピリジンに溶解してメチルアルコールを加えて
沈殿させる操作を３回繰返し、溶媒可溶画分を除去し、
次いでクロロホルム−メチルアルコールで洗浄する操作
を繰返して溶媒可溶画分を除去する。更に沈殿をリン酸
緩衝液に溶解し、リン酸緩衝液中でセファロース４Ｂに
固定化したアクチナーゼ日と振盪処理した後、固定化酵
素を）戸去し、）戸液を透析により脱塩し、凍結乾燥し
てリポ多糖体を得る。収率は湿菌体重量の０．３％であ
った。

分析の結果、本物質の組成はＤ−７ラビノース：Ｄ−マ
ンノース（１：　　２．５）を構成糖とする多糖体９１
　（Ｗ／Ｗ）％と、主としてバルミチン酸、ラベルクロ
ステアリン酸及びステアリン酸の飽和脂ｎ１５ｍ９（１
４ｈｌ）χから成るリポ多糖体であった。

実施例２ ミコバクテリウム・ボビスＢ　ＣＧ　（）ｌｙｃｏｂａ
ｃｔｅ−ｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ）をツートン培
地中で、３７°Ｃ１５週間培養し、濾過、滅菌して得ら
れた菌体を水洗後、アセトンで数回洗浄して脱脂、乾燥
し、水に懸濁させてフレンチプレス（１５００ｋａ／ｃ
ｍ２）により破砕する。終濃度１．５（Δ／讐）％とな
るようにトリ１〜ンＸ−１００を添加し、空温で２４時
間撹拌を続ける。遠心分＠（４０，０００Ｘ！ＩＩ　、
３０分）して得られた上澄を、実施例１と同様に操作し
て、リポ多糖体を得る。収率は乾燥菌体の約１％でめっ
た。

分析の結果、Ｄ−アラビノース：Ｄ−マンノース（１：
３）を主たる構成糖とする多糖体８８（Ｗ／Ｗ）％と、
バルミチン酸、ラベルクロステアリン酸を主とする飽和
脂肪酸１２（Δ／旧％とから成るリポ多糖体でめった。

実施例３ プロピオニバクテリウム・アクネスＣＣ−７（Ｐｒｏｐ
ｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕ　ａｃｎｅｓ　Ｃ−７）を肉
エキス添加修正チオグリコール酸液体培地中で４日間嫌
気条件下において静置培養し、遠心分離して得られた菌
体を水洗した後、１（Ｗ／Ｗ）％ラウリル硫酸すｌ〜ツ
リウム液に懸濁して、２０ＫｔｌＺの超音波細胞破砕装
置で５分間×６回処理した後、遠心分離（４０，０００
ｘｇ　、　３０分）して得られた上澄を、実施例１と同
様に操作し、リポ多糖体を得る。

収率は湿菌体重量の０．８％でめった。

分析の結果Ｄ−アラビノース：Ｄ−マンノース（１：　
　２．８＞を主たる構成糖とする多糖体８９四／Ｗ）％
、主としてＣＩ５〜Ｃ＋ａの脂肪酸１１（讐／慶）％の
組成でおった。

［発明の効果］ 本発明にかかるリポ多糖体は、放線菌目及び類縁の細菌
から得られ、Ｄ−アラビノース及びＤ−マンノースを主
たる構成糖とする多糖体にバルミチン酸及びラベルクロ
ステアリン酸を主とする脂肪酸がエステル結合したリポ
多糖体で市って、試験例により詳しく説明した如く抗腫
瘍効果、細胞幼若化能、免疫増強効果等の活性を有する
優れた物質であり、腫瘍免疫増強剤或いは免疫調節剤と
して実用化が期待される。

又、本発明の製造法により、菌体から比較的単純な操作
により、収率よくリポ多糖体が得られるため、工業的製
造にも有利である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）Ｄ−アラビノースが１に対しＤ−マンノースが１〜
   ３なる構成の多糖体８０〜９５（Ｗ／Ｗ）％と、脂肪酸
   ５〜２０（Ｗ／Ｗ）％とから成るリポ多糖体。 ２）放線菌及び／又はその類縁細菌を培養して得られる
   菌体を界面活性剤溶液により抽出し、酵素消化、分子量
   分画、溶媒分画の組合せにより精製することを特徴とす
   るリポ多糖体の製造法。 ３）放線菌及び／又はその類縁細菌を培養して得られる
   菌体を破砕した後、界面活性剤溶液により抽出し、酵素
   消化、分子量分画、溶媒分画の組合せにより精製するこ
   とを特徴とするリポ多糖体の製造法。