JPH0572921B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、リポ多糖体及びその製造法に関す
る。更に詳しくは、抗腫瘍活性、免疫調節活性、
細胞賦活活性、感染防御活性等の生理活性を有す
るリポ多糖体、及び放線菌及び／又はその類縁細
菌からリポ多糖体を効率よく製造する方法に関す
る。 ［従来の技術］ 牛型結核菌BCG菌体或いは嫌気性プロピオニ
バクテリウム菌体等が、従来から免疫増強剤とし
て用いられ、抗腫瘍活性を有することが知られて
いるが、反面強い副作用を発現することも明らか
であり、臨床面への適用の障害となつている。 そのため、これら有効性を示す菌体或いは類縁
の菌体から有効成分を取り出し、副作用成分を除
く各種の試みがなされてきた。 特に、ミコバクテリウム属、プロピオニバクテ
リウム属、ノカルジア属等の細菌の菌体成分とそ
の活性に関する研究が活性に行なわれ、各種の生
理活性成分が単離、精製され、更にその成分の修
飾により活性を上昇させる試みもなされてきた。
すなわち細胞壁骨格成分（特開昭54−28813号
他）、ムラミルジペプチド（特開昭52−156812号
他）、ムラミルジペプチドの修飾物（特開昭56−
49396号他）、アジユバント活性物質（特公昭58−
409号他）、熱水抽出物（特公昭48−43842号他）、
リポ多糖体を有効成分とする腫瘍免疫療法剤（特
開昭56−8320号他）は既に開示されており、最近
リポ多糖体およびその製造法（特開昭59−161320
号）が開示された。 ［発明が解決しようとする問題点］ しかし、これらのリポ多糖体はいずれも活性及
び副作用の点で必ずしも充分とはいえず、又その
製造法も収率があまり高くなく、より一層の改善
が望まれていた。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、人型結核菌ミコバクテリウム・
ツベルクローシス、牛型結核菌ミコバクテリウ
ム・ボビス、更には非病原性嫌気性菌プロピオニ
バクテリウム・アクネス等の細菌菌体について、
副作用を示さず且つ抗腫瘍活性、免疫調節活性、
細胞幼若化活性等の有効性を示す成分を、更に収
量良く取得し且つ比活性の高い形に精製するべく
研究を続けてきた。 その結果、これらの菌体を非イオン性或いはイ
オン性界面活性剤を用い、更には物理的破砕操作
を加えることにより、好収率で目的物が得られる
ことを発見し、又粗リポ多糖体を有機溶媒の組み
合わせにより分画し、更に固定化蛋白分解酵素に
より除蛋白することにより比活性を数倍高め得る
ことを発見し、本発明を完成した。 すなわち、本発明はＤ−アラビノースが１に対
しＤ−マンノースが１〜３なる構成の多糖体80〜
95（Ｗ／Ｗ）％と、脂肪酸５〜20（Ｗ／Ｗ）％とか
ら成るリポ多糖体、及びミコバクテリウム属及び
プロピオニバクテリウム属の細菌を培養して得ら
れる菌体を破砕し若しくは破砕しないで界面活性
剤溶液により抽出し、アミラーゼ及びアミログリ
コシダーゼによる酵素消化、分子量10万以上の分
画を得る限外ろ過法、溶媒分画の組合わせにより
精製することを特徴とするリポ多糖体の製造法に
かかるものである。 本発明のリポ多糖体の製造法について説明す
る。 適切な培地により好気的或いは嫌気的に培養し
て得た細菌を、除菌過或いは遠心分離により集
めて適切な方法により滅菌し、或いは培養培地中
で直接適切な方法により滅菌して死菌体を得る。
菌体をよく洗浄した後、凍結融解、超音波処理、
或いはフレンチプレス等の物理的手段により破砕
する。破砕は水懸濁液中であつても、界面活性剤
の水溶液に懸濁した状態で行なつてもよい。破砕
された菌体は、水懸濁液中のものはこれに界面活
性剤を加え、界面活性剤存在下のものはそのま
ま、室温で撹拌し、遠心分離により菌体屑を除去
し抽出液を得る。尚、死菌体を破砕しない場合に
は、死菌体を界面活性剤水溶液中で撹拌し、過
或いは遠心分離して抽出液を得る。 こうして得た抽出液に適当な有機溶媒を加え
て、粗多糖体を沈殿させる。得られた粗多糖体を
適当な緩衝塩類溶液に乳濁させてアミラーゼ及び
アミログリコシダーゼで処理し、熱処理により酵
素類を沈殿除去後、限外過若しくは分子篩カラ
ムにより、高分子として表現される粗リポ多糖体
画分を分取し、凍結乾燥する。 得られた粗リポ多糖体をピリジン−メタノー
ル、クロロホルム−メタノール等の適当な有機溶
媒の組み合せにより分画して、混在するリン脂質
等を除去する。蛋白質が混在する場合は、適切な
塩類溶液に溶かし、アクチナーゼＥ等の固定化蛋
白分解酵素で処理して、凍結乾燥することにより
精製リポ多糖体を得る。 使用する菌は、ミコバクテリウム属及びプロピ
オニバクテリウム属の細菌であればよく、使用す
る菌体はあらかじめ適当な有機溶媒の組み合せに
より脱脂操作を加えたものであつてもよく、又適
当な蛋白消化酵素により処理したものであつても
よい。 本発明のリポ多糖体の性状は、外観は白色乃至
微灰白色の粉末であり、蒸溜水若しくは生理食塩
水にわずかに白濁して溶けるが、有機溶媒には溶
けない。本発明の物質の組成はＤ−アラビノース
及びＤ−マンノースを主たる構成糖とする多糖体
に、主としてC₁₄乃至C₁₉の脂肪酸がエステル結合
したものであり、多糖体80〜95（Ｗ／Ｗ）％及び
脂肪酸５〜20（Ｗ／Ｗ）％を含む。又本物質は水
系溶媒中では疎水的ミセル構造を形成しているも
のと考えられ、各種の分子量測定手段において、
極めて高分子であるが如き挙動を示す。 本発明のリポ多糖体は、アルカリ水溶液、アル
カリ緩衝液によつても抽出され、同様の精製操作
により取得できる。しかし強アルカリ或いは加熱
弱アルカリによつては、鹸化されて分子量約
12000のアラビノマンナン、分子量約7000のマン
ナン及び脂肪酸のアルカリ塩を与える。 ［作用］ 次に、以上の操作によつて得られるリポ多糖体
の生理活性について、抗腫瘍活性、細胞幼若化活
性、多クローン性Ｂ細胞活性化能、食細胞活性化
能の試験成績を詳しく説明する。尚、供試物質と
しては、後記実施例１、２、３により調製したリ
ポ多糖体を使用し、対照には適宜必要に応じて対
応量の生理食塩水を用いた。 先ず腫瘍増殖抑制効果及び腫瘍退縮効果を指標
とした抗腫瘍活性の試験成績について説明する。 ８週令のC57BL／６雌性マウスの上腹部皮下
に、メチルコラントレン誘発同系腫瘍MC−１を
１×10⁵個／匹接種し、１群10匹として移植後10
日目に、0.2mlの生理食塩水に溶解させた試料を
腹腔内に投与し、移植後24日目に屠殺し腫瘍を摘
出して重量を測定する。Ｔ／Ｃ値を次式により算
出して、腫瘍増殖抑制効果を判定した。対照群に
は同スケジユールで生理食塩水0.2mlを投与した。 Ｔ／Ｃ（％）＝投与群の平均腫瘍重量／対照群の平均腫
瘍重量×100 結果を表１に示す。

【表】

【表】 本試験の結果、本発明のリポ多糖体は、いずれ
もマウス同系腫瘍に対して極めて優れた増殖抑制
作用及び退縮作用を有することが判明した。 次に、細菌幼若化活性の試験成績について説明
する。 ８週令のC57BL／６雌性マウスの正常脾細胞
を取り出し、各実施例で得られたリポ多糖体各
10μgと共に培養し、細胞による³H−チミジンの
取込量を測定して、リポ多糖体による細胞賦活作
用を判定した。対照としては、対応量の生理食塩
水と共に培養したものを用いた。各試験群共に同
一の動物個体からの細胞を用いて試験を行ない、
５匹の動物個体について同試験を繰返した。 試験の結果を表２に示す。 本試験の結果、本発明のリポ多糖体は、いずれ
もマウスの脾細胞のチミジン取り込みを著しく増
強し、優れた細胞賦活作用、細胞幼若化作用を有
することが判明した。

【表】 次に、多クローン性Ｂ細胞活性化試験の成績に
ついて説明する。 10週令のCDF₁系雌性マウスの正常脾細胞を取
り出し、各実施例で得られたリポ多糖体各10μg
と共に培養し、抗トリニトロフエニル化ウマ赤血
球プラーク形成細胞を計数して活性を評価した。
対照としては、対応量の生理食塩水と共に培養し
たものを用いた。各試験群共に同一の動物個体か
らの細胞を用いて試験を行ない、５匹の動物個体
について同試験を繰返した。 試験結果を表３に示す。

【表】 本試験の結果、本発明のリポ多糖体はいずれも
多クローン性Ｂ細胞活性化能を有することが判明
した。 次に、食細胞活性化作用の試験成績について説
明する。 ８週令のBALB／ｃ雄性マウスに各実施例で
得られたリポ多糖体各10μg（生理食塩水0.2ml溶
解）を腹腔内投与し、２日後に腹水を取り出し、
腹腔細胞のうちプラスチツクシヤーレに付着する
細胞２×10⁴個に対して同系腫瘍（Meth）Ａ細胞
１×10³個を加えて、ウシ胎仔血清添加培地中で
24時間培養後、3H−チミジンを添加して更に16
時間培養した後、3Hの取り込み量により腫瘍細
胞の増殖に及ぼす活性化マクロフアージの作用を
判定し、これに基いて試料のマクロフアージ活性
化能を判定した。１群を10匹とし、対照群には対
応量の生理食塩水を投与したものを用いた。活性
化率は次式により算出した。 活性化率（％）＝対照群の平均取込量−投与群の平均取
込量／対照群の平均取込量×100 試験の結果を表４に示した。

【表】 本試験の結果、本発明のリポ多糖体は、マウス
のマクロフアージの活性化を促す物質であること
が裏付けられた。 ［実施例］ 本発明を実施例によつて更に詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例によつて何ら限定を
受けるものではない。 実施例 １ ミコバクテリウム・ツベルクローシス青山Ｂ
（Mycobacterium tuberculosis strain Aoyama
Ｂ）をソートン培地中で37℃、５週間培養し、 100℃、20分間加熱滅菌した後、過、水洗し
て得られた死菌体を、1.5（Ｗ／Ｗ）％トリトンＸ
−100水溶液（湿菌体重量の約５倍量）に懸濁し、
撹拌及び超音波処理により分散させた後、更にフ
レンチプレス（1500Kg／cm²）により菌体破砕を行
なう。40000×ｇ、30分間遠心分離して得られた
上澄に９倍量のエチルアルコールを加えて撹拌
し、5000×ｇ、15分間の遠心分離により沈降する
画分を集め、エチルアルコール、続いてエチルエ
ーテルで洗浄し乾燥する。得られた沈殿を酢酸緩
衝液中でアミラーゼ及びアミログリコシダーゼで
処理し、加熱後遠心分離して変性酵素を除く。限
外過により分子量10万以上の画分を濃縮し、凍
結乾燥して粗リポ多糖体を得る。 本物質をピリジンに溶解してメチルアルコール
を加えて沈殿させる操作を３回繰返し、溶媒可溶
画分を除去し、次いてクロロホルム−メチルアル
コールで洗浄する操作を繰返して溶媒可溶画分を
除去する。更に沈殿をリン酸緩衝液に溶解し、リ
ン酸緩衝液中でセフアロース4Bに固定化したア
クチナーゼＥと振盪処理した後、固定化酵素を
去し、液を透析により脱塩し、凍結乾燥してリ
ポ多糖体を得る。収率は湿菌体重量の0.3％であ
つた。 分析の結果、本物質の組成はＤ−アラビノー
ス：Ｄ−マンノース（１：2.5）を構成糖とする
多糖体91（Ｗ／Ｗ）％と、主としてパルミチン酸、
ツベルクロステアリン酸及びステアリン酸の飽和
脂肪酸９（Ｗ／Ｗ）％から成るリポ多糖体であつ
た。 実施例 ２ ミコバクテリウム・ボビスBCG
（Mycobacterium bovis BCG）をソートン培地
中で、37℃、５週間培養し、過、滅菌して得ら
れた菌体を水洗後、アセトンで数回洗浄して脱
脂、乾燥し、水に懸濁させてフレンチプレス
（1500Kg／cm²）により破砕する。終濃度1.5（Ｗ／
Ｗ）％となるようにトリトンＸ−100を添加し、
室温で24時間撹拌を続ける。遠心分離（40000×
ｇ、30分）して得られた上澄を、実施例１と同様
に操作して、リポ多糖体を得る。収率は乾燥菌体
の約１％であつた。 分析の結果、Ｄ−アラビノース：Ｄ−マンノー
ス（１：３）を主たる構成糖とする多糖体88
（Ｗ／Ｗ）％と、パルミチン酸、ツベルクロステ
アリン酸を主とする飽和脂肪酸12（Ｗ／Ｗ）％と
から成るリポ多糖体であつた。 実施例 ３ プロピオニバクテリウム・アクネスＣ−７
（Propionibacterium acnes Ｃ−７）を肉エキス
添加修正チオグリコール酸液体培地中で４日間嫌
気条件下において静置培養し、遠心分離して得ら
れた菌体を水洗した後、１（Ｗ／Ｗ）％ラウリル
硫酸ナトリウム溶液に懸濁して、20KHzの超音波
細胞破砕装置で５分間×６回処理した後、遠心分
離（40000×ｇ、30分）して得られた上澄を、実
施例１と同様に操作し、リポ多糖体を得る。収率
は湿菌体重量の0.8％であつた。 分析の結果Ｄ−アラビノース：Ｄ−マンノース
（１：2.8）を主たる構成糖とする多糖体89（Ｗ／
Ｗ）％、主としてC₁₅〜C₁₈の脂肪酸11（Ｗ／Ｗ）
％の組成であつた。 ［発明の効果］ 本発明にかかるリポ多糖体は、放線菌目及び類
縁の細菌から得られ、Ｄ−アラビノース及びＤ−
マンノースを主たる構成糖とする多糖体にパルミ
チン酸及びツベルクロステアリン酸を主とする脂
肪酸がエステル結合したリポ多糖体であつて、試
験例により詳しく説明した如く抗腫瘍効果、細胞
幼若化能、免疫増強効果等の活性を有する優れた
物質であり、腫瘍免疫増強剤或いは免疫調節剤と
して実用化が期待される。 又、本発明の製造法により、菌体から比較的単
純な操作により、収率よくリポ多糖体が得られる
ため、工業的製造にも有利である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｄ−アラビノースが１に対しＤ−マンノース
   が１〜３なる構成の多糖体80〜95（Ｗ／Ｗ）％と、
   脂肪酸５〜20（Ｗ／Ｗ）％とから成るリポ多糖体。 ２ ミコバクテリウム属及びプロピオニバクテリ
   ウム属の細菌を培養して得られる菌体を界面活性
   剤溶液により抽出し、アミラーゼ及びアミログリ
   コシダーゼによる酵素消化、分子量10万以上の分
   画を得る限外ろ過法、溶媒分画の組合せにより精
   製し、Ｄ−アラビノースが１に対しＤ−マンノー
   スが１〜３なる構成の多糖体80〜95（Ｗ／Ｗ）％
   と、脂肪酸５〜20（Ｗ／Ｗ）％とから成るリポ多
   糖体を得ることを特徴とするリポ多糖体の製造
   法。 ３ ミコバクテリウム属及びプロピオニバクテリ
   ウム属の細菌を培養して得られる菌体を破砕した
   後、界面活性剤溶液により抽出し、アミラーゼ及
   びアミログリコシダーゼによる酵素消化、分子量
   10万以上の分画を得る限外ろ過法、溶媒分画の組
   合せにより精製し、Ｄ−アラビノースが１に対し
   Ｄ−マンノースが１〜３なる構成の多糖体80〜95
   （Ｗ／Ｗ）％と、脂肪酸５〜20（Ｗ／Ｗ）％とから
   成るリポ多糖体を得ることを特徴とするリポ多糖
   体の製造法。