JPS62500560A - アルファアミド化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 明　細　書 アルファアミド化酵素 発明の背景 核酸暗号配列から天然蛋白の前駆物質を翻訳し、これら前駆物質を細胞内処理（ 開裂および／または官能基の変性）することについては、各種文献に明示されて いる。

一般に、哺乳動物の細胞および他の真核細胞は、成る翻訳後の処理を行うことが できるが、原核生物では、そのような処理を行うことができない。大腸菌のよう な特定の原核生物は、組換型Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｒＤ　Ｎ　Ａ　）技術によって哺乳 動物の蛋白を生成する宿主として広く用いられている。なぜならばこのような原 核生物は、バッチ式発酵法で容易に培養することができ、かつ一般的にそれらの 特性が充分に決定されているからである。しかしながら、遺伝工学技術によって 生成された多くの哺乳動物の蛋白には、成る種の翻訳後の処理が必要であり、こ の処理は複雑な生体内における化学的、または酵素的処置を利用することにより 行わなければならないことがしばしばあり、このような化学的、または酵素的処 置はコストが高く、このため大ｉ生産に適用することができない。

成る種の処理活性は、蛋白のカルボキシル基末端保有アミノ酸の特殊なアミド化 （−ＣＯＯｌ−１基を一〇〇Ｎ８２基に変換すること）を伴う。多くの天然のホ ルモンおよびペプチドには、そのような変性が起り、蛋白が生物学的に活性でな ければならイ≧い場合、その変性がしばしば必須となる。、１つの例はカルシト ニンであり、この場合、天然のアミド化プロリンの代わりに非アミド化プロリン 残留物を使用すると、生物学的活性度は３，０００倍も減少する。

このＣ−末端（アルファ）アミド化を行う薬剤は、アミド化するアミノ酸のすぐ 次の位置にあるグリシン残基を認知する（Ｒ−Ｘ−（ｌｈ’、この式中、Ｒは蛋 白の本体部分であり、Ｘはアミド化されている残塁であり、ｒａｌｙＪはグリシ ン残基である）。グリシンは開裂され、実際アミン成分を末位から二番目のアミ ノ酸に付与し、これによりアミノ酸をアミド化する。

ペプチドおよび蛋白のカルボキシル末端基をアミド化することのできる酵素製剤 は、種々の文献に述べられている。

例えば、プラトブリー・エイ・エフ（Ｂｒａｄｂｕｒｙ＾、Ｆ、）等、ネイチｔ 　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、２９８号、　１９８２年、６８６〜６８８頁は、α− アミド化酵素活性がブタの下垂体に存在すると報告している。

フサイン・アイ（ｌｌｕｓａｉｎ　１．）およびテート・ニス・ニス（丁ａｔｅ 　Ｓ、Ｓ、）、ＦＥＢＳレターズ（ＬｅｔｔｅｒｓＬ　１５２巻、２号。

１９８３年、２７７〜２８１頁は、α−アミド化活性がウシの下垂体神経分泌性 顆粒中に存在すると述べた。

エイパー（［１ｐＤｅｒ）等、ＰＮ八へ、　８０巻、１９８３年、５１４４〜５ １４８頁は、α−アミド化酵素活性がラット下垂体の前葉、中葉および複葉に存 在すると報告した。

ゴメズ（Ｇｏｍｅｚ）等、ＦＥ［ＩＳレターズ、１６７巻、１号、１９８４年、 １６０〜１６４頁は、ラットの視床下部もまたα−アミド化酵素活性を含んでい ると断定した。

プラトブリー・ニー・エフおよびスミス・デー・ジー（Ｓｍｙｔｈｅ　Ｄ、Ｇ、 ）、ペプチドの構造および作用についての第８回アメリカ・ペプチド・シンポジ ウムの会報、編集者フルパイ・ブイ・ジエー（１ｌｒｕｂｙ　Ｖ、　Ｊ、　）お よびリッチ・ディー・エッチ（Ｒｉｃｈ　Ｏ，１１，）は、ラットの甲状腺にお けるα−アミド化酵素活性の存在について述べている。

マインズ・アール・イー（Ｍａｉｎｓ　Ｒ，Ｅ、）等、エンドクリノロジー（Ｅ ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１１４巻、１９８４年、　１５２２〜１５３０頁 は、ネズミの下垂体前葉（ＡＴＴ　−２０）から誘導された細胞系が培養中に紅 時的に見掛上減少するα−アミド化酵素活性を含んでいることを報告した。

アミド化ペプチドを含有するものとして公知の腺または器官は、アミド化反応に 触媒として作用することのできる酵素を含む。例えば、ホシザメ（５ｑｕａｌｕ ｓ　ａｃａｎｔｈｉａｓ）のような下等動物は下垂体抽出物中にアミド化ペプチ ドを含むことが、オドノヒュー・ティー・エル（０’Ｄｏｎｏｈｕｅ　Ｔ、　Ｌ 、　）等、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　、　３号、　１９８２年、３５３〜 ３９５頁に報告された。シェラ−・アール・エッチ（Ｓｃｈｅｌ　Ｉｅｒ　Ｒ， １１，）等、セル（Ｃｅｌｌ）　、　３２巻、　１９８３年、７〜２２頁は、海 洋に住むカタツムリ、アビルシア（Ａｏｙｌｓｉａｌ中にアミド化の認められる ペプチドの存在を報告した。この活性物質は自然界に明らかに遍在するけれども 、その物理学的および化学的な特徴については、殆んど公表されていない。この 理由はこれら神経内分泌器官内に存在する酵素が非常にわずかであるためである 。

今までにα−アミド化酵素の精製および特性決定については公表されていない。

しかしながら、部分的に精製した酵素製剤の物理的および化学的な性質は報告さ れている。

α−アミド化酵素のおよその分子量を報告した最初の著者は、プラトブリー・エ イ・エフ等であり、彼等はネイチャー、２９８号、　４９８２年、６８６〜６８ ８頁に報告している。彼等ハセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−１００ を用いて約６０．０００ドルトンの最小見掛分子量を提示した。

その後の研究により、酵素の分子量が６０．０００〜７０，０００ドルトンであ ることが提示された。これら研究に関する文献としては、フサイン・アイおよび テート・ニス・ニス、ＦＥＢＳレターズ、１５２巻、２号、　１９８３年、２７ ７〜２８１頁：エイバー・ビー・エイ、ＰＮＡＳ、１６７巻、１号、　１９８１ １年。

１６０〜１６４頁；およびキザー・ジエー・ニス（に１Ｚｅｒ　Ｊ、Ｓ、）等、 ＰＮＡＳ、　８１巻、　１９８４年、　３２２８〜３２３２頁がある。

エイバー等、　ＰＮＡＳ、　８０巻、　１９８３年、　５１４４〜５１４８頁は 、最大酵素活性を得るために、分子酵素の外に２つの共同因子、即ちアスコルビ ン酸とｔＡ（ＩＩ＞イオンが必要であることを報告した。

ペプチドの炭素末端基をアミド化する化学反応には、アミノ基の源が必要である 。プラトブリー・エイ・エフ等。

ネイチャー。２９８巻、　１９８２年、６８６〜６８８真においては、グリシン が開裂され、アミン成分を末位から二番目のアミノ酸に付与し、アミノ酸をアミ ド化することを明示している。アミン基供与体としてのグリシンの必要性は他の 著者によって実証された。

ランディモアー・エイ・イー−エフ（Ｌａｎｄｙｍｏｒｅ　Ａ、Ｅ、Ｎ、　）等 、ＢＢＲＣ，１１７巻、１号、　１９８３年、２８９〜２９３頁は、Ｄ−アラニ ンもまたアミド化反応においてアミン供与体として作用することを明示している 。キザー等によるその後の研究、即ちＰＮＡＳ、　８１巻、　１９８１１年、　 ３２２８〜３２３２頁は、α−アミド化反応に触媒として作用することのできる ラットの脳における２つの異なった酵素活性物質を示している。高分子１の酵素 （７０，０００ドルトン）は基質の炭素末端におけるグリシンに限定した特異性 を有する。低分子量酵素には、カルボキシル基を末端に有するアミノ酸としてβ −アラニンを含む基質が用いられる。

ブタの下垂体から抽出され、部分的に精製されたα−アミド化酵素に最適のｐｌ （は約７．０であり、このことはプラトブリー・エイ・エフおよびスミス・ディ ー・ジー、　ＢＢＲＣ。

１１２巻、２号、　１９８３年、３７２〜３７７頁に報告されている。

エイバー・ビー・エイ等、　ＰＭＡＳ、　８０巻、　１９８３年、　５１４４〜 ５１４８頁は、ラットの下垂体から部分的に精製されたアミド化酵素の最適ＤＨ が７であることを報告した上記結果を立証した。彼等はまた６、５以下または７ ．５以上のｐＨで酵素活性が急速に低下することを述べた。

上記文献のすべてにおいて、抽出物および部分的に精製した酵素混合物は、α− アミド化酵素に加えて使用可能な基質および生成物を減成する蛋白分解酵素を追 加的に含んでいた。

従って本発明の目的は、ペプチドまたはポリペプチド基質を生成するために、酵 素に特異な単クローン性抗体を製造するために、かつ酵素を暗号化する異種ＤＮ Ａを含む多細胞から隔離された原核生物または他の適切なｌＩｔＭｉ胞生物また は宿主細胞を育成するために有効に用いられる精製α−アミド化酵素を提供する ことである。本発明のこの目的および他の目的は、当業者にとって次の詳細な記 載から明らかになるであろう。

ｌ１至１を 本発明は精製α−アミド化酊累、その用途、酵素に特異な単クローン性抗体、お よび酵素を暗号化する異種遺伝性物質を含む多細胞から隔離された原核生物また は他の単細胞生物・または宿主細胞に関する。さらに詳しく述べると、６０．０ ００〜６５，０００ドルトンの分子量を有し、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル 上で行われる電気泳動法によって単一で均質で明確なバンドを表すように精製さ れ、かつ蛋白１η当り少なくとも５０ｍＵの特異な酵素活性度を有する精製ペプ チジル（ｐｏｔ）ｔｉｄｙｌ　）−グリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼに 関する（１Ｕは３７℃およびｐｌ＋７．０で１分間で１ミリｔｌＬ＋（７）Ｄａ ｎｓｙｌ　−Ｄ　−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＧＩＶ−Ｃ０ＯＨを１ミリモルのＤａｎｓ ｙｌ　−Ｄ　−Ｔｙｒ−Ｖａｉ−Ｃ０ＮＩ−１２に転化する指数である）。また 本発明は、遊離または固定の精製酵素、アスコルビン酸塩および銅の存在の下に おいて、この基質を酵素と反応させることにより、末端グリシン残塁を含むペプ チドまたはポリペプチド基質からα−アミド化ペプチドを製造する方法を提供す る。ざらに本発明は、精製酵素に対する単クローン性抗体の生成、およびペプチ ジル−グリシンα−アミド化モノオキシゲナーぜを暗号化する異種ＤＮＡを含む 多細胞から隔離された原核生物、他の単ｌ１ｌＩ１１生物または宿主細胞の発育 に関する技術を提供する。

発明の説明 ここに開示されるように、均質に精製されたα−アミド化酵素は、固体腫瘍組織 抽出物、腫瘍細胞系およびこのような細胞系の組織培地からサイズ剤排除および イオン交換クロマトグラフィーの組合せを採用する多段工程により得られる。

ロース・ビー・エイ（Ｒｏｏｓ　Ｂ、＾、）等、エンドクリノロジー、１９７９ 年、１５０巻、１号、２７〜３２頁に述べられているように、酵素が一へＧ／Ｒ ｉｊ　ｗｉｓｔａｒラット内において増殖した骨髄甲状腺癌から抽出された。こ の組織はｒＶ［−１００２８として寄託された。また酵素は他の源、即ちヒトお よびラットの骨髄甲状腺癌の細胞系から抽出された。ラットの細胞系７７（７４ ）は、ムシンスキー−エム（Ｈｕｓｚｙｎｓｋｉ　Ｈ，）等。

ＪＲＣ、１９８３年、２５８巻、１１６７８〜１１６８３頁に述べられているよ うに、連続継代によってラットの骨髄甲状腺癌から誘導された。この細胞系はＩ ＶＩ　−１００２９として寄託された。

ヒトの細胞系ＨＴＴ５４（３４）が、オハイオ州のリーブランド市ノフイ・エイ ・メジカル・センター（Ｖ、Ａ、Ｈｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ）においてビー ・エイ・ロース（Ｂ、　Ａ、　Ｒｏｏｓ　）により主要培養のためにヒト骨髄甲 状腺癌細胞を用いて増殖された。このヒト細胞系吋Ｔ５４（３４）は　ＩＶ＋　 −１００３１として寄託された。

ヒトおよびラットの両方からの明確な組織培地は、かなりなｍのα−アミド化酵 素活性を含んでいることが立証され、このことは酵素の一部が細胞から分泌され ていることを示している。

酵素は最初に粗原料をアニオン交換クロマトグラフィーで処理することにより得 られ、精製される。例えば、試料はファツトマン・リミテッド（Ｗｈａｔａ＋ａ ｎ　Ｌｉｎ＋１ｔｅｄ）から販売されているＤＥ−５２樹脂のような予備的アニ オン交換カラムに一度にＶｉ填される。次に、α−アミド化活性含有生成物はサ イズ剤排除クロマトグラフィーにおいて適切な分解能を有する樹脂、例えばファ ーマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ）から入手テキルセフアクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ−２，００ 超精密カラムにより処理される。

次に活性含有溶離留分は強力なアニオン交換マトリックスを用いるイオン交換ク ロマトグラフィーにより処理される。

使用される樹脂はファーマシア・ファイン・ケミカルズから入手できるモノ（Ｎ ｏｎｏ）　ＱＨＲ５／　５の強力なアニオン交換樹脂であり、酵素を均質に精製 するためには、このクロマトグラフィーのカラムを１回以上通過させることが必 要である。各精製段階においては、蛋白含有量およびα−アミノ化活性のレベル の両方についてモニターすることができる。この情報は酵素の相対純度の指示薬 として働く酵素の特定の活性を算出するために使用される。

得られた酵素は約６０，０００〜６５．０００ドルトンの分子量を有するペプチ ジル−グリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼである（ラットからの場合ＩＶ Ｉ−１００３２：ヒトからの場合ＩＶＩ　−１００３３）。酵素は蛋白１η当り 少なくとも約２５ｍｕ。

好ましくは少なくとも約５Ｏｎ＋Ｕの特定の酵素活性（蛋白ｌｌ１ｇ当りのα− アミド化活性の単位数）を表すように精製された。また酵素はドデシル硫酸ナト リウム／ポリアクリルアミドゲル（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）上の電気泳動後に単一で 均質で明確なバンドを表すように精製された。

精製されたペプチジル−グリシンα−アミノ化モノオキシゲナーゼは、末端グリ シン残基を有するポリペプチドのアルファカルボキシル基をアミド化するために 使用され、この場合、グリシンはアミノ基供与体として作用する。基質のペプチ ドまたはポリペプチドは、天然の源から精製され、またはその構成アミノ酸から 合成され、または組換型ＤＮＡ技術によって生成することができる。グリシンを 末端に有するポリペプチドは、有効量の酵素の存在の下において酵素と結合され る。必要な酵素の聞は、次に列挙したように、この技術分野において周知の幾か の変数によって決まる。即ち、与えられた酵素製剤の特定の活性度、転化される 基質の同および化学的性質、転化時間、反応混合物の温度およびｌ）Ｈである。

なお、これら変数は限定的なものではない。与えられた状況において要求される 正確な酵素の量にＥｕＷを及ぼす他の変数については、当業者により選定される 。通常、計１ｆｆｌの酵素が用いられるが、過剰過の酵素は反応に１［を与えな い。銅イオンが存在することもまた必要であり、この銅イオンは銅塩から供給さ れるが、この銅塩のアニオンは上記反応に悪ＦＰ＝響を及ぼさないものである。

酵素が蛋白１　ｍｇ当り約１ｍＵの特定の酵素活性度を有する時、最大α−アミ ド化は４．７ｕＨ銅イオンのａ度で起こる。酵素の純度が増加するにつれて、外 因性銅イオンの所要温度が低くなる。また、酵素の活性度はアスコルビン酸イオ ンの存在により高められ、このアスコルビン酸イオンはその塩により供給するこ とができ、この塩のカチオンが上記反応に悪影響を及ぼさない限り、どのような 塩も使用可能である。蛋白１■当り約５０ｍＵの特定の酵素活ゼ１度を有する精 製酵素に対して、最大α−アミド化が約５．５ｍＨのアスコルビン酸塩濃度で起 こる。α−アミド化の活性度はカタラーゼの添加により増加される。α−アミド 化反応における最適ｐｌ＋は６．５〜７．５である。

ペプチジル−グリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼは充分に精製されている ので、標準的な方法によって酵素に対する単クローン性抗体を（９ることが可能 である。この単クローン性抗体により、骨髄甲状腺癌から酵素を回収する方法が 容易となり、またはこの回収方法の代わりに免疫吸収精製法が全体的に取って代 わる。また酵素は充分に精製されているので、そのアミノ酸の配列順序を決定す ることができる。この情報は酵素を暗号化する遺伝物質を隔離するために、かつ この後、ペプチドグリシンα−アミド化酵素を暗号化するＤＮＡを含んでいない 多細胞生物から隔離された通切な単細胞生物または宿主細胞に上記遺伝物質を取 込むために必要である。このことは標準的な組換型ＤＮＡ方法により行われ、こ のＤＮＡ方法については、例えばマニアティス・イー・エフ（Ｈａｎｔａｔｉｓ 　Ｅ、Ｆ、）等、モレキュラー・クローニング（Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎ ｉｎｇ）　：エイ・ラボラトリー−’？ニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ）、　Ｄ−ルド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）　、　１９８２年、またはつ・アール・ニド（Ｗｕ　Ｒ，ｅｄ、 ）、メソツズ・イン・エンジモロジー（Ｈｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ）、　１３８５．アカデミツク・ブレス（八ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ ）　、　１９７９年に述べられている。ペプチジル−グリシンα−アミド化酵素 を暗号化する異種ＤＮＡを含有する得られた細胞により、充分な量の酵素が生成 され、生体内において翻訳後のα−アミド化を行うことができ、かつこれら細胞 が生体内においてペプチドまたはポリペプチドを変性することができる。

本発明の精製酵素のα−アミド化活性は放射性ヨウ素化Ｄ　−Ｔｙｒ−Ｖａｔ　 −Ｇ　ｌｙの物質を用いて立証され、配列順序がメラミン細胞のカルボキシル末 端基に類似するペプチドはホルモン前駆物質を刺激した。効力検定は１００ｍＨ ＴＥＳ（Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチルコメチル−２−アミノエタンスルホン酸 ）緩ＷＪ液中においてｐｔｕ、ｏで３７℃で３時間ン交換クロマトグラフィーに よって基質から分離されＩこ。

またアミド化酵素活性は、カルシトニン、即ち（Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　〕力ｊレシト ニン（２６〜３２）のカルボキシル末端益の配列順序に類似する合成基質を用（ １で立証された。

本発明はその好ましい具体例について述べられｌこ力（、多くの変化および変更 は当業者にとって明らｈ＼である。

国際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上における電気泳動後に単一で均質で明確 なバンドを表すように精製された約６０，０００〜６５，０００ドルトンの分子 量を有するペプチジルーグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ。
2. ２．蛋白１ｍｇ当り少なくとも約５００Ｕの特定酵素活性度を有する請求の範囲 第１項記載のペプチジルーグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ。
3. ３．固体支持材に固定された請求の範囲第１項記載のペプチジルーグリシンα− アミド化モノオキシゲナーゼ。
4. ４．骨髄甲状腺癌から抽出された請求の範囲第１項記載のペプチジルーグリシン α−アミド化モノオキシゲナーゼ。
5. ５．組換型ＤＮＡにより生成されたペプチジル−グリシンα−アミド化モノオキ シゲナーゼ。
6. ６．動物組織抽出物をアニオン交換クロマトグラフィーで処理し、得られたα− アミド化活性を含む特質をサイズ剤排除クロマトグラフィーで処理し、このサイ ズ剤排除クロマトグラフィーは約６０．０００〜６５，０００ドルトンの分子量 を有する物質を分離することのできるクロマトグラフィー用触質を使用しており 、その後α−アミド化活性を含む溶離留分を強力なアニオン交換クロマトグラフ ィーで処理することから成る請求の範囲第１項記載のペプチジルーグリシンα− アミド化モノオキシゲナーゼを製造する方法。
7. ７．動物組織抽出物が骨髄甲状腺癌組織、または骨髄甲状腺癌細胞系、またはそ のような細胞系からの組織培地、またはこれらの組合せから得られる請求の範囲 第６項記載の方法。
8. ８．アミノ供与残基を末端基とするペプチドまたはポリペプチドからα−アミド 化ペプチドを生成する方法において、ペプチジルーグリシンα−アミド化モノオ キシゲナーゼの存在の下で上記基質を酵素と反応させることから成る方法。
9. ９．さらに銅イオンの存在の下において行われる請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．アミノ供与残基がグリシンである請求の範囲第８項記載の方法。
11. １１．さらにアスコルビン酸イオンおよび／またはカタラーゼの存在の下で行わ れる請求の範囲第８項記載の方法。
12. １２．ＰＨが約６．５〜７．５で行われる請求の範囲第８項記載の方法。
13. １３．アスコルビン酸塩の量が基質の量を一定の状態で超過するが、反応を抑制 する程ではない請求の範囲第１１項記載の方法。
14. １４．基質が組換型ＤＮＡで生成され、または天然の、または合成のペプチドま たはポリペプチドである請求の範囲第８項記載の方法。
15. １５．ペプチジル−グリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを暗号化する異種 ＤＮＡを含む多細胞生物からの単細胞生物または宿主細胞である宿主細胞。
16. １６．単細胞生物である請求の範囲第１５項記載の宿主細胞。
17. １７．原核生物である請求の範囲第１６項記載の宿主細胞。
18. １８．大腸菌から誘導される請求の範囲第１７項記載の原核生物宿主細胞。