JPH0352959B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は５−フルオロトリプトフアン耐性を有
しかつアンスラニル酸要求性を有するバチルス属
に属する菌株を復帰変異せしめてアンスラニル酸
非要求性としたＬ−トリプトフアン生産能を有す
る微生物を用いたＬ−トリプトフアンの製造法に
関する。

Ｌ−トリプトフアンは必須アミノ酸として重要
な化合物であり、医薬品或いは食品、飼料の添加
剤として利用されている。

従来の技術及び発明が解決しようとする問題点 前述の如く、Ｌ−トリプトフアンは必須アミノ
酸として重要な化合物であり、特に栄養学的に不
足しやすい物質であるためその経済的な工業的製
造法の開発が強く望まれている。かかる観点から
従来種々の化学的又は微生物学的合成方法が提唱
されている。そのようなＬ−トリプトフアンの合
成方法の一例として微生物を用いてアンスラニル
酸やインドールなどの前駆物質からＬ−トリプト
フアンを製造する方法が知られている。

しかしながら、この場合に比較的多量のアンス
ラニル酸を培養系に添加すると、Ｌ−トリプトフ
アンの生合成が阻害されるため高濃度のＬ−トリ
プトフアン含有培養液を得ることが困難であり、
実用化の障害となつていた。このような状況下に
トリプトフアンアナログ体、例えば５−フルオロ
トリプトフアンや５−メチルトリプトフアンに耐
性を有する変異菌株を用いて、Ｌ−トリプトフア
ンによりトリプトフアン生合成系酵素の生産抑制
を解除して直接醗酵法によりＬ−トリプトフアン
を製造する方法が提案されている。しかしなが
ら、従来、トリプトフアン生合成系酵素の一つで
あるアンスラニル酸合成酵素へのＬ−トリプトフ
アンによる活性阻害を解除した例はなかつた。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、前記した従来のＬ−トリプトフ
アンの微生物学的製造法においてアンスラニル酸
合成酵素へのＬ−トリプトフアンによる活性阻害
を解除した例が無い現状に鑑み、しかもＬ−トリ
プトフアンの生産性を更に向上させるためにはこ
の阻害を解除することが必須と考えて、鋭意研究
を進めた結果、Ｌ−トリプトフアンによるアンス
ラニル酸合成酵素への活性阻害を解除したＬ−ト
リプトフアン生産性微生物菌株を取得することに
成功し、本発明をするに至つた。

即ち、本発明に従えば、５−フルオロトリプト
フアン耐性を有しかつアンスラニル酸要求性を有
するバチルス属に属する菌株を復帰変異せしめて
アンスラニル酸非要求性とした、Ｌ−トリプトフ
アン生産能を有するバチルス・アミロリクイフア
シエンスSD−43を培地に培養して培養中にＬ−
トリプトフアンを生成せしめ、これを採取するこ
とから成るＬ−トリプトフアンの製造法が提供さ
れる。

本発明に従つた５−フルオロトリプトフアン耐
性及びアンスラニル酸要求性を有するバチルス属
に属する菌株を復帰変異せしめてアンスラニル酸
非要求性とした、Ｌ−トリプトフアン生産能を有
するバチルス属に属する微生物バチルス・アミロ
リクイフアシエンスSD−43は以下のようにして
取得した。

すなわち、本発明者らは原株バチルス・アミロ
リクイフアシエンス（Bacillus
amyloliquefaciens）IAM1521を常法に従つてＮ
−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン（NTG）を用いて人工突然変異誘発処理し、
この変異処理株をトリプトフアンアナログとして
最低阻止濃度（MIC）以上の５−フルオロトリ
プトフアン（５−FT）を添加した寒天平板培地
（スピザイゼン培地）で生育させて生育した数百
のコロニーについてそれぞれＬ−トリプトフアン
の生産性を調べ、最もＬ−トリプトフアン生産能
の高い５−FT耐性（即ち、トリプトフアン濃度
の蓄積による微生物固有のフイードバツク抑制機
構を解除した）菌株を得る。この菌株は５−フル
オロトリプトフアンに対し5000ppm以上の耐性を
有する。

次に、この５−FT耐性及びＬ−トリプトフア
ン生産能を有する変異菌株を再び上と同様にして
NTGを用いて人工突然変異誘発処理し、処理後、
遠心分離（10000G×５分）し、菌体Ｍ／100トリ
ス緩衝液（PH7.0）に懸濁し遠心分離することを
３回繰返し、NTGを除去する。菌体部をアンス
ラニル酸20〜50ppmを含むスピザイゼン培地のよ
うな枯草菌用最小培地にて30〜40℃で１〜３時間
培養する。

培養後、遠心分離によつて集菌し、菌体部を上
記トリス緩衝液で洗浄し、更にトリス緩衝液中に
再懸濁して30〜40℃で１〜３時間振とうする。振
とう終了後、遠心分離によつて集菌し、トリス緩
衝液で洗浄した後、アンスラニル酸要求性菌株を
濃縮すべく、ペニシリン500〜2000ppmを含有す
る枯草菌用最小培地中に懸濁し、30〜40℃で30〜
90分、好ましくは40〜60分間振とうする。振とう
終了後、上と同様に集菌洗浄し、前記ペニシリン
含有枯草菌用最小培地にて同様の操作を３〜10回
繰り返してアンスラニル酸20〜50ppm含有枯草菌
用最小平板培地では生育するが、アンスラニル酸
無添加平板培地では生育しないアンスラニル酸要
求性菌株をスクリーニングする。最適条件では90
％以上に濃縮することが可能である。

次に、上で得たアンスラニル酸要求性菌株を前
記したようにしてNTGを用いて再度人工突然変
異誘発処理した後、前記したようにして遠心分離
により変異処理株を集菌しトリス緩衝液で洗浄
し、栄養培地で30〜40℃にて３時間培養する。培
養終了後、前記したようにして遠心分離により集
菌し、トリス緩衝液中に濃度１×10⁸個／mlにな
るように懸濁し、これを寒天16ｇを加えたスピザ
イゼン培地から成り、アンスラニル酸を含まない
枯草菌用最小平板培地に塗布し、30〜40℃で３日
間静置培養し、生育するコロニーの中からＬ−ト
リプトフアン生産能の高い菌株バチルス・アミロ
リクイフアシエンスSD−43を選択した。

この菌株は昭和59年８月14日に工業技術院微生
物工業技術研究所にバチルス・アミロリクイフア
シエンス（Bacillus amyloliquefaciens）SD−
43（微工研菌寄第7772号）として寄託した。この
菌株の菌学的性質は、原株バチルス・アミロリク
イフアシエンスIAM1521の菌学的性質と、５−
FT耐性を有しかつＬ−トリプトフアンによるア
ンスラニル酸合成酵素へのフイードバツク阻害が
解除されて、Ｌ−トリプトフアン生産性の非常に
高いことを除けば同じであつた。

本発明に従つてＬ−トリプトフアンを製造する
には、バチルス・アミロリクイフアシエンスSD
−43を培地中に培養することにより実施する。

本発明方法において使用することのできる培地
としては、前記微生物が培養により増殖し得るも
のであれば任意のものでよく、例えば炭素源とし
てはブドウ糖、糖蜜、蔗糖、デン粉、デン粉糖化
液、セルロース分解物などの糖類、酢酸、エタノ
ール等が用いられる。窒素源としてはアンモニ
ア、硫安、塩安、硝安、燐安などのアンモニウム
塩や尿素、硝酸塩等が適宜用いられる。無機塩と
しては燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン
等の塩類、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリ、
燐酸ソーダ、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガン、苛性カリ等の通常の工業用薬品で良
く、他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、硼
素、銅、コバルト、モリブデン等の塩類を加えて
も良い。また微量有機栄養素としてビタミン、ア
ミノ酸、核酸関連物質等は菌の生育上は特別に必
要とするものではないが、これらを添加したり、
コーンスチープリカー、肉エキス、酵母エキス、
ペプトン等の有機物を加えても良い。また、本発
明の微生物はその生育にアンスラニル酸を必要と
しないため、通常はアンスラニル酸無添加培地に
て培養されるが、Ｌ−トリプトフアンの生産性の
向上のため、培地中にアンスラニル酸を添加して
もその生育上は何等差支えはなく、その場合に
は、アンスラニル酸はソーダ塩、カリウム塩、ア
ンモニウム塩の水溶液や遊離酸のエチルアルコー
ルまたメチルアルコール溶液として添加すれば良
い。

本発明方法における培養は好気的条件下に、例
えば通気撹拌や往復振盪方法によつて培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一
般的に言えば、温度30〜40℃、PH6.0〜8.0及び18
〜72時間程度の条件で実施する。

培養液又は培養物からの目的のＬ−トリプトフ
アンの採取方法は慣用方法に従つて行うことがで
きる。例えば、遠心分離により菌体部を除いた培
養液上清からイオン交換樹脂処理法、活性炭処理
法等の操作を適宜組み合せてＬ−トリプトフアン
を単離晶析することができる。

実施例 以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものでないこと
はいうまでもない。

例 １（実施例） 下記組成の液体培地２を５のジヤーフアー
メンターに入れ、115℃で15分間加熱滅菌した。

液体培地組成 グルコース10％、硫安0.3％、Na₂HPO₄・
12H₂O0.5％、KH₂PO₄0.2％、MgSO₄・7H₂O0.1
％、FeSO₄・7H₂O5ppm、及びMnSO₄・４〜
6H₂O1ppm 次いで、この培養槽に、予じめ肉汁寒天培地に
て30℃で16時間培養したバチルス・アミロリクイ
フアシエンスSD−43を滅菌水10mlに懸濁して接
種し、溶存酸素量を0.5ppm以上に、グルコース
濃度を２％に、そしてPHを7.0に保ちながら、30
時間通気撹拌培養を行なつた。

このようにして得られた培養液中にはＬ−トリ
プトフアン13ｇ／が蓄積していた。

例 ２（比較例） 例１においてバチルス・アミロリクイフアシエ
ンスSD−43に代えて、バチルス・アミロクイフ
アシエンスSD−43の親株である５−FT耐性菌株
を用いた以外は例１と同様にして30時間通気撹拌
培養した。このようにして得られた培養液中には
Ｌ−トリプトフアン９ｇ／が蓄積していた。

発明の効果 本発明に従えば、Ｌ−トリプトフアン合成酵素
系の生産抑制と活性阻害解除によつて培地中に高
濃度のＬ−トリプトフアンの蓄積が達成される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ５−フルオロトリプトフアン耐性を有しかつ
   アンスラニル酸要求性を有するバチルス属に属す
   る菌株を復帰変異せしめてアンスラニル酸非要求
   性としたＬ−トリプトフアン生産能を有するバチ
   ルス・アミロリクイフアシエンスSD−43を培地
   に培養して培養物中にＬ−トリプトフアンを生成
   せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−ト
   リプトフアンの製造法。