JPS6269990A - 発現ベクタ−ｐＴＰ６４−１ - Google Patents
発現ベクタ−ｐＴＰ６４−１Info
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- JPS6269990A JPS6269990A JP60210813A JP21081385A JPS6269990A JP S6269990 A JPS6269990 A JP S6269990A JP 60210813 A JP60210813 A JP 60210813A JP 21081385 A JP21081385 A JP 21081385A JP S6269990 A JPS6269990 A JP S6269990A
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- ptp64
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- dihydrofolate reductase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、高効率発現ジヒドロ葉酸還元酵素を暗号化す
る遺伝子を含有し、第１図において示されるＤＮＡ配列
を有する組換えプラスミドに関するものである。この特
定ＤＮＡ配列及び組換えプラスミドの産業上の利用分野
としては、微生物工業９発酵工業、医薬品工業等の分野
に好適である。
る遺伝子を含有し、第１図において示されるＤＮＡ配列
を有する組換えプラスミドに関するものである。この特
定ＤＮＡ配列及び組換えプラスミドの産業上の利用分野
としては、微生物工業９発酵工業、医薬品工業等の分野
に好適である。
従来の技術
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩にともなって、プ
ロモーター・クローニング用ベクターなど多機能プラス
ミドベクターの開発が行なわれるようになった。このよ
うなプラスミドベクターを利用する上で、利用し易さを
決める退嬰な要因としてプラスミドの選択マーカー及び
マーカー遺伝子の構造・機能などの問題が上げられる。
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩にともなって、プ
ロモーター・クローニング用ベクターなど多機能プラス
ミドベクターの開発が行なわれるようになった。このよ
うなプラスミドベクターを利用する上で、利用し易さを
決める退嬰な要因としてプラスミドの選択マーカー及び
マーカー遺伝子の構造・機能などの問題が上げられる。
ジヒドロ葉酸還元酵素は、ジヒドロ葉酸を還元しテトラ
ヒドロ葉酸を生成する反応を触媒する酵素であり９葉酸
補酵素生合成系の重要な酵素である。トリメトプリムは
、サルファ剤同様葉酸補酵素生合成系の阻害剤であるが
、この薬剤はジヒドロ葉酸還元酵素と強力に結合し酵素
活性を阻害する。このことにより、培地中にトリメトプ
リが存在すると細菌は生長することができなくなる。と
ころが、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をプラスミド等に
組込み、遺伝子のコピー数を増大させるなどして、菌体
中のジヒドロ葉酸還元酵素量を高めると、細菌はトリメ
トプリムに対して耐性を獲得する（Ｍ、 Ｊｗａｋｕｒ
ａ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 ＢｉｏｃｈｅｍｉＳｔｒｙ
ｖｏｌ。
ヒドロ葉酸を生成する反応を触媒する酵素であり９葉酸
補酵素生合成系の重要な酵素である。トリメトプリムは
、サルファ剤同様葉酸補酵素生合成系の阻害剤であるが
、この薬剤はジヒドロ葉酸還元酵素と強力に結合し酵素
活性を阻害する。このことにより、培地中にトリメトプ
リが存在すると細菌は生長することができなくなる。と
ころが、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子をプラスミド等に
組込み、遺伝子のコピー数を増大させるなどして、菌体
中のジヒドロ葉酸還元酵素量を高めると、細菌はトリメ
トプリムに対して耐性を獲得する（Ｍ、 Ｊｗａｋｕｒ
ａ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、 ＢｉｏｃｈｅｍｉＳｔｒｙ
ｖｏｌ。
９１、ｐｐ、１２０５（１９８２））。この性質を利用
することにより、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子がプラス
ミドの選択マーカー（すなわち、トリメトプリム耐性マ
ーカー）として利用され、この１伝子を絹込んだプラス
ミドベクターを用いて、実際、遺伝子のクローニングが
行なわれている。（特許出願昭５６−１４３５２０．及
びＭ、 工ｗａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 Ｊ。
することにより、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子がプラス
ミドの選択マーカー（すなわち、トリメトプリム耐性マ
ーカー）として利用され、この１伝子を絹込んだプラス
ミドベクターを用いて、実際、遺伝子のクローニングが
行なわれている。（特許出願昭５６−１４３５２０．及
びＭ、 工ｗａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ｖｏｌ、９２ 、 ｐｐ
、 ６１５ （１９８２） ）。
、 ６１５ （１９８２） ）。
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を用いたトリメトプリム耐
性マーカーは、遺伝子の大きさが約５００塩基対と小さ
いこと、遺伝子中に利用しやすい制限酵素部位があるこ
と、遺伝子の発現蛍とトリメトプリム耐性の強さに非常
によい相関関係が存在することから優れた選択マーカー
であり、広範囲な利用が期待されている（Ｍ、 Ｉｗａ
ｋｕｒａ、 ｅｔ ａ！、 Ｊ。
性マーカーは、遺伝子の大きさが約５００塩基対と小さ
いこと、遺伝子中に利用しやすい制限酵素部位があるこ
と、遺伝子の発現蛍とトリメトプリム耐性の強さに非常
によい相関関係が存在することから優れた選択マーカー
であり、広範囲な利用が期待されている（Ｍ、 Ｉｗａ
ｋｕｒａ、 ｅｔ ａ！、 Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉａｔｒｙ、 ｖｏｌ、９３． ｐｐ、
９２ （１９８３） ）。
９２ （１９８３） ）。
問題点
しかしながら、上記のような遺伝子の利用法は。
細菌遺伝子から分離してきた遺伝子ＤＮＡを適当に短＜
シ、そのまま適当なプラスミドに組込んで利用しようと
いうものであり、より高度な機能を持たせたプラスミド
ベクターを開発し有効利用を計る場合、１点が生じた。
シ、そのまま適当なプラスミドに組込んで利用しようと
いうものであり、より高度な機能を持たせたプラスミド
ベクターを開発し有効利用を計る場合、１点が生じた。
例えば＋ Ｅ−ｃｏｌ＋のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子をそのまま多コピープラスミドに組み込んだ場合、遺
伝子のコピー数に応じたせいぜい１０〜３０倍程度にし
か菌体内蓄積量を増大することができない。また、適当
な制限酵素切断部位が存在しないため組換えを行なう際
繁雑な操作が必要であるなどの間ぶ点があった。
子をそのまま多コピープラスミドに組み込んだ場合、遺
伝子のコピー数に応じたせいぜい１０〜３０倍程度にし
か菌体内蓄積量を増大することができない。また、適当
な制限酵素切断部位が存在しないため組換えを行なう際
繁雑な操作が必要であるなどの間ぶ点があった。
発明の目的
すでに本発明者は、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を効果
的に利用できる構造に構築しなおすことを目的としてジ
ヒドロ葉酸ａ元酵素タンパクを暗号化する部分はそのま
まで、かつ、その周辺のＤＮＡ配列がもとのＥ−ｃｏｌ
ｉの遺伝子と異なった配列を有する遺伝子を構築しこの
遺伝子を含有するプラスミドｐＴＰ６３−２１を作成し
ている（特許出願 ６０−１１３６９２ ）。しかしな
がら、この遺伝子はプロモーターを待たないため宿主で
あるＥ、ｃｏｌｉで発現することができない。本発明は
。
的に利用できる構造に構築しなおすことを目的としてジ
ヒドロ葉酸ａ元酵素タンパクを暗号化する部分はそのま
まで、かつ、その周辺のＤＮＡ配列がもとのＥ−ｃｏｌ
ｉの遺伝子と異なった配列を有する遺伝子を構築しこの
遺伝子を含有するプラスミドｐＴＰ６３−２１を作成し
ている（特許出願 ６０−１１３６９２ ）。しかしな
がら、この遺伝子はプロモーターを待たないため宿主で
あるＥ、ｃｏｌｉで発現することができない。本発明は
。
ｐＴＰ６３−２１に適切なプロモーターを導入すること
によりジヒドロ葉酸還元酵素を安定に効率よく生産する
遺伝子を構築することを目的としておこなわれ、鋭意研
究の結嘔、ジヒドロ葉酸還元酵素を菌体内タンパクの１
５％以−ヒに及ぶまで大計にＥ、ｃｏｌｉ細菌内に著積
させることが可能な組換えプラスミドｐＴＰ６４−１を
作成し１発明を完成させるに至ったのである。
によりジヒドロ葉酸還元酵素を安定に効率よく生産する
遺伝子を構築することを目的としておこなわれ、鋭意研
究の結嘔、ジヒドロ葉酸還元酵素を菌体内タンパクの１
５％以−ヒに及ぶまで大計にＥ、ｃｏｌｉ細菌内に著積
させることが可能な組換えプラスミドｐＴＰ６４−１を
作成し１発明を完成させるに至ったのである。
発明の嘴成
本発明のプラスミドｐＴＰ６４−１は、５２９９塩基対
の大きさを有し、宿主であるＥ、ｃｏｌｉをトリメトプ
リムおよびアンピシリン耐洗に形質転換することができ
、第１図に示される塩基配列によつ丁茜中七＋１１斤州
畑Ｕ−暑イ丹７ぐトーで本スープラスミドｐ Ｔ Ｐ
６４−１は９．制限酵素ＥｃｏＲＩ。
の大きさを有し、宿主であるＥ、ｃｏｌｉをトリメトプ
リムおよびアンピシリン耐洗に形質転換することができ
、第１図に示される塩基配列によつ丁茜中七＋１１斤州
畑Ｕ−暑イ丹７ぐトーで本スープラスミドｐ Ｔ Ｐ
６４−１は９．制限酵素ＥｃｏＲＩ。
ＰｓｔＩ 、 Ｃ１ａＩ ｔ Ｂｇｔ ｎ、 ｐｖｕｎ
、、 Ｂｅｔ Ｉ によって。
、、 Ｂｅｔ Ｉ によって。
各々１箇所切断され＋ Ｈｘｎｄ ＩＩ［ｔ Ｈｐａ
Ｌ Ａａｔ ＩＩによって各々２箇所切断される。これ
らの制限酵素のうちＣ１ａＩ、 ＨｐａＩ、 Ｂｇｌ
ＩＩ、 Ｈｉｎｄ ｍの切断部は、ジヒドロ葉酸還元酵
素の構造遺伝子とこれを転写開始するプロモーターとの
間に位置し９組換え体を作成する上で好都合となってい
る。
Ｌ Ａａｔ ＩＩによって各々２箇所切断される。これ
らの制限酵素のうちＣ１ａＩ、 ＨｐａＩ、 Ｂｇｌ
ＩＩ、 Ｈｉｎｄ ｍの切断部は、ジヒドロ葉酸還元酵
素の構造遺伝子とこれを転写開始するプロモーターとの
間に位置し９組換え体を作成する上で好都合となってい
る。
第１図は、ｐＴＰ６４−１の全塩基配列を示す図であ〜
す２本鎖ＤＮＡのうち片方の配列だけを示している。第
１図の配列のうち５２５８番目から５２８５番目の配列
はＥ、 ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼのコンセンサス
プロモーター配列でありジヒドロ葉酸還元酵素構造遺伝
子（５７番目から５３３番目の配列）の高効率発現に関
与している。このプロモーター配列は、プラスミドｐＴ
Ｐ５２−１ （巌倉正寛、第２回次世代基盤技術シンポ
ジウム−バイオテクノロジー−子り、−＋集、ｐ、５５
７２（１９８５）に記載）の制限酵素ｐｓｔＩとＣ１
ａ Ｉとの切断によって得られる２本のＤＮＡ断片のう
ち小さい方に存在し、このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴ
Ｐ６３−２１のＰｓｔＩとＣ１ａ Ｉとの切断によって
得られる２本のＤＮＡ断片のうち大きい方のＤＮＡ断片
とを結合することによって、プラスミドｐＴＰ６３−２
１とプラスミドｐＴＰ５２−１とからｐＴＰ６４−１を
創製することができる。
す２本鎖ＤＮＡのうち片方の配列だけを示している。第
１図の配列のうち５２５８番目から５２８５番目の配列
はＥ、 ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼのコンセンサス
プロモーター配列でありジヒドロ葉酸還元酵素構造遺伝
子（５７番目から５３３番目の配列）の高効率発現に関
与している。このプロモーター配列は、プラスミドｐＴ
Ｐ５２−１ （巌倉正寛、第２回次世代基盤技術シンポ
ジウム−バイオテクノロジー−子り、−＋集、ｐ、５５
７２（１９８５）に記載）の制限酵素ｐｓｔＩとＣ１
ａ Ｉとの切断によって得られる２本のＤＮＡ断片のう
ち小さい方に存在し、このＤＮＡ断片をプラスミドｐＴ
Ｐ６３−２１のＰｓｔＩとＣ１ａ Ｉとの切断によって
得られる２本のＤＮＡ断片のうち大きい方のＤＮＡ断片
とを結合することによって、プラスミドｐＴＰ６３−２
１とプラスミドｐＴＰ５２−１とからｐＴＰ６４−１を
創製することができる。
ｐ Ｔ Ｐ ６４−１の創製に用いられる技法は、実施
例に述べられるように、全て従来の組換えＤＮＡ技術に
従い効率的に竹なうことができるが、プラスミドの創製
方法によって本発明は左右されるものではない。
例に述べられるように、全て従来の組換えＤＮＡ技術に
従い効率的に竹なうことができるが、プラスミドの創製
方法によって本発明は左右されるものではない。
本発明のプラスミドｐ Ｔ Ｐ ６４−１は、Ｅ、ｃｏ
ｌｉＫ１２Ｃ６００株に導入されて安定状態に保たれ。
ｌｉＫ１２Ｃ６００株に導入されて安定状態に保たれ。
ｐ Ｔ Ｐ ６４−１を含有するＥ、ｃｏｌｉ Ｋｌ
２Ｃ６００株は微工研にＦＥＲＭ Ｐ−８４５１とし
て寄託されている。ｐＴＰ６４−１を含有するＥ−ｃｏ
ｌｔ Ｋ１２Ｃ６００株は、プラスミドを含有しない
Ｅ。
２Ｃ６００株は微工研にＦＥＲＭ Ｐ−８４５１とし
て寄託されている。ｐＴＰ６４−１を含有するＥ−ｃｏ
ｌｔ Ｋ１２Ｃ６００株は、プラスミドを含有しない
Ｅ。
ｃｏｌｉＫ１２ｃ６００株の約８００倍以上のまた。同
一のプロモーターを有するｐＴＰ５２−１を含有するＥ
、ｃｏｌｉＫ１２Ｃ６００株の約５倍以上のジヒドロ葉
酸還元酵素を生産し、その含、ｌは菌体内タンパクの１
５％以上にまで及ぶ。
一のプロモーターを有するｐＴＰ５２−１を含有するＥ
、ｃｏｌｉＫ１２Ｃ６００株の約５倍以上のジヒドロ葉
酸還元酵素を生産し、その含、ｌは菌体内タンパクの１
５％以上にまで及ぶ。
発明の効果
ｐＴＰ６４−１を含有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２
Ｇ６００株は、菌体内タンパクの１５％以上に及ぶまで
ジヒドロ葉酸還元酵素を菌体内に著積することができ、
ジヒドロ葉酸還元酵素を生産する為の菌体として浸れて
いる。またこのような特定タンパクを多量に生産する遺
伝子を発現効率の悪い遺伝子に結合することにより発現
効率を改良することが可能であることは既に明らかであ
る（巌倉正寛、第２回次世代基盤技術シンポジウム−バ
イオテクノロジー−子稿集、ｐ、５５−７２ （１９８
５））。
Ｇ６００株は、菌体内タンパクの１５％以上に及ぶまで
ジヒドロ葉酸還元酵素を菌体内に著積することができ、
ジヒドロ葉酸還元酵素を生産する為の菌体として浸れて
いる。またこのような特定タンパクを多量に生産する遺
伝子を発現効率の悪い遺伝子に結合することにより発現
効率を改良することが可能であることは既に明らかであ
る（巌倉正寛、第２回次世代基盤技術シンポジウム−バ
イオテクノロジー−子稿集、ｐ、５５−７２ （１９８
５））。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
ｐＴＰ６４−１の作製
各々Ｏ，００１ｍｇのプラスミドｐＴＰ６３−２１およ
びｐＴＰ５２−１を制限酵素Ｃ１ａＩ及びＰｓｔ Ｉを
用いて切断後、それぞれ１％アガロースゲルを気泳動法
により分離した。各々大小２本づつのＤＮＡ断片が得ら
れた。ｐＴＰ６３−２１の方では大きい断片を、ｐＴＰ
５２−１の方では小さい断片を切り出し９両者を透析チ
ューブに入れ１ ｍｌ の５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
ＣＩ、 ｐＨ８，０を加えシールし、電気溶出法（ｅｉ
ｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ法ｖ Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら。
びｐＴＰ５２−１を制限酵素Ｃ１ａＩ及びＰｓｔ Ｉを
用いて切断後、それぞれ１％アガロースゲルを気泳動法
により分離した。各々大小２本づつのＤＮＡ断片が得ら
れた。ｐＴＰ６３−２１の方では大きい断片を、ｐＴＰ
５２−１の方では小さい断片を切り出し９両者を透析チ
ューブに入れ１ ｍｌ の５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｈ
ＣＩ、 ｐＨ８，０を加えシールし、電気溶出法（ｅｉ
ｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ法ｖ Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら。
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｊｎｇ Ａ Ｌｏｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＋ ｐｐ、 １６４Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ （１９８２）、文献１）により、ゲルからＤＮＡを
回収し、エタノールでＤＮＡを沈殿後、減圧下に沈殿を
乾燥した。得られたＤＮＡを０．０５ｍｔのりガーゼ用
反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ＋＋ ｐＨ７，４
，５ｎＭ ＭｇＣｌ２．１０ ｍＭジチオトレイトール
、 ０．５ ｒｎＭ ＡＴＰ）に溶解した後、０．５
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加え。
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ＋ ｐｐ、 １６４Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ （１９８２）、文献１）により、ゲルからＤＮＡを
回収し、エタノールでＤＮＡを沈殿後、減圧下に沈殿を
乾燥した。得られたＤＮＡを０．０５ｍｔのりガーゼ用
反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ＋＋ ｐＨ７，４
，５ｎＭ ＭｇＣｌ２．１０ ｍＭジチオトレイトール
、 ０．５ ｒｎＭ ＡＴＰ）に溶解した後、０．５
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加え。
冷蔵庫中（約４−１０°Ｃ）で、１８時間、ＤＮＡの連
結反応を行なわせた。この反応物を、形質転換法（ｔｒ
ａｎｂｆｏｒｍａＮｏｎ ｍｅｔｈｏｄ 、上記文献１
． ｐｐ、２５０）に従って、 Ｅ、 ｃｏｌｔ
Ｋｌ ２Ｃ６００株に取り込ませた。
結反応を行なわせた。この反応物を、形質転換法（ｔｒ
ａｎｂｆｏｒｍａＮｏｎ ｍｅｔｈｏｄ 、上記文献１
． ｐｐ、２５０）に従って、 Ｅ、 ｃｏｌｔ
Ｋｌ ２Ｃ６００株に取り込ませた。
この処理をした菌体を、５０ｍｇ／ｍｌ及び５０ｍｇ／
ｍｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培地（１１中に、
１ｇのグルツース、１ｇのリン酸２カリウムｅ５ｇのイ
ーストエキス、５ｇのポリペプトン。
ｍｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培地（１１中に、
１ｇのグルツース、１ｇのリン酸２カリウムｅ５ｇのイ
ーストエキス、５ｇのポリペプトン。
及び１５ｇの寒天を含む寒天培地）上に塗布し。
３７℃で２４時間培養することにより、１００個以上の
コロニーを得ることができた。これらのコロニーから、
適当に１個選び、菌体を培養し。
コロニーを得ることができた。これらのコロニーから、
適当に１個選び、菌体を培養し。
ＴａｎａｋａとＷｅｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ、Ｔａｎａ
ｋａ、 Ｂ、 Ｗｅｉｓｂｌｕｍ；Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｇｙ、 ＶＯＩ １２１． Ｉ）ｐ、 ３５４ （１
９７５））にしたがってプラスミドを調製した。得られ
たプラスミド、を制限酵素ＥｃｏＲＩ、 Ｐｓｔ Ｉ、
Ｃ１ａｎ、 ＢｇｔＩＩ。
ｋａ、 Ｂ、 Ｗｅｉｓｂｌｕｍ；Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｇｙ、 ＶＯＩ １２１． Ｉ）ｐ、 ３５４ （１
９７５））にしたがってプラスミドを調製した。得られ
たプラスミド、を制限酵素ＥｃｏＲＩ、 Ｐｓｔ Ｉ、
Ｃ１ａｎ、 ＢｇｔＩＩ。
ＰｖｕＩ［、ＨｉｎｄＩｕ、 ＨｐａＩ 、 Ａａｔｎ
によって切断を試みたところ、各々１．１，１．１，
１，２，２゜２箇所切断されることが明らかとなった。
によって切断を試みたところ、各々１．１，１．１，
１，２，２゜２箇所切断されることが明らかとなった。
遷られたプラスミドをｐＴＰ６４−１とへした。ｐＴＰ
６４−１の全塩基配列を、マキサム−ギルバート法及び
ジデオキシ法に従って決定した。その結宋。
６４−１の全塩基配列を、マキサム−ギルバート法及び
ジデオキシ法に従って決定した。その結宋。
第１図に示す塩基配列が明らかとなり、プラスミドｐ’
ｒｐ６４−１は５２９９塩基対より成り立っていること
が明らかとなった。また、得られた塩基配列からプラス
ミドｐＴＰ６４−１が制限酵素ＢｃｌＩ切断部位を１箇
所（第１図の配列中５８番目から６３番目までの、ＴＧ
ＡＴＣＡ、よりなる配列）有することが判明した。
ｒｐ６４−１は５２９９塩基対より成り立っていること
が明らかとなった。また、得られた塩基配列からプラス
ミドｐＴＰ６４−１が制限酵素ＢｃｌＩ切断部位を１箇
所（第１図の配列中５８番目から６３番目までの、ＴＧ
ＡＴＣＡ、よりなる配列）有することが判明した。
実施例２
ｐＴＰ６４−１を含有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋｌ ２Ｃ
６００株のジヒドロ葉酸還元酵素生産性 ｐＴＰ６４−１を含有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６
００株を５０ｍ１の５０ ｍｇ／ｍｌのアンピシリンナ
トリウムを含む栄養培地（１＋中にｐ５ｇのＮａＣ１，
８ｇのバクトペプトン、５ｇのイーストエキスを含む液
体培地、ｐＨ７，４）中で３７°Ｃで一晩培養後。
６００株のジヒドロ葉酸還元酵素生産性 ｐＴＰ６４−１を含有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６
００株を５０ｍ１の５０ ｍｇ／ｍｌのアンピシリンナ
トリウムを含む栄養培地（１＋中にｐ５ｇのＮａＣ１，
８ｇのバクトペプトン、５ｇのイーストエキスを含む液
体培地、ｐＨ７，４）中で３７°Ｃで一晩培養後。
菌体を遠心分離により集め、５０ｍ１の５０ｍＭＱン酸
カリウム緩衝液ｐ Ｈ７，０で洗菌した後、 ２ｍｌの
同一緩衝液に懸濁し、超音波破砕により細胞を破砕した
後、２００００回転／分、３０分の遠心分離により上清
を得た。えられた上清のジヒドロ葉酸還元酵素活性を測
定したところ、８．３ユニツト／ ｍｇタンパクという
値Ｃあった。同様にしてｐＴＰ５２−１を含有するＥ、
ｃｏｌｉＫ１２Ｃ６００株及びプラスミドを含有しない
Ｅ−ｃｏｌｔ Ｋｌ ２Ｇ６００株のジヒドロ葉酸還元
酵素生産性を調べたところ。
カリウム緩衝液ｐ Ｈ７，０で洗菌した後、 ２ｍｌの
同一緩衝液に懸濁し、超音波破砕により細胞を破砕した
後、２００００回転／分、３０分の遠心分離により上清
を得た。えられた上清のジヒドロ葉酸還元酵素活性を測
定したところ、８．３ユニツト／ ｍｇタンパクという
値Ｃあった。同様にしてｐＴＰ５２−１を含有するＥ、
ｃｏｌｉＫ１２Ｃ６００株及びプラスミドを含有しない
Ｅ−ｃｏｌｔ Ｋｌ ２Ｇ６００株のジヒドロ葉酸還元
酵素生産性を調べたところ。
１．６および０．０１０ユニツト／ ｍｇタンパクとい
う値であった。このことから、ｐＴＰ６４−１を含有す
るＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００株は、ｐＴＰ５２−１
を含有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋｌ ２Ｃ６００株及びプ
ラスミドを含有しないＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００
株のそれぞれ約５および８００倍のジヒドロ葉酸還元酵
素生産性を有していることが示された。８．３ユニツト
／■タンパクのジヒドロ葉酸還元酵素活性を有する上清
をドデシル硫酸ナトリウム存在化のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分離後、コマジ−ブリリアントブ
ルーでタンパクを染色し、デンシトメーターで染色バン
ドを分析したところ、ジヒドロ葉酸Ｉで元酵素タンパク
が全タンパクの約１５％以上含まれていることが判明し
た。
う値であった。このことから、ｐＴＰ６４−１を含有す
るＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００株は、ｐＴＰ５２−１
を含有するＥ、 ｃｏｌｉ Ｋｌ ２Ｃ６００株及びプ
ラスミドを含有しないＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００
株のそれぞれ約５および８００倍のジヒドロ葉酸還元酵
素生産性を有していることが示された。８．３ユニツト
／■タンパクのジヒドロ葉酸還元酵素活性を有する上清
をドデシル硫酸ナトリウム存在化のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分離後、コマジ−ブリリアントブ
ルーでタンパクを染色し、デンシトメーターで染色バン
ドを分析したところ、ジヒドロ葉酸Ｉで元酵素タンパク
が全タンパクの約１５％以上含まれていることが判明し
た。
第１図は、ｐＴＰ６４−１の全塩基配列を示した図であ
り、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤ Ｎ Ａ ６１配列だ
けを、５′末端から３′末端の方向に記述している。図
中符号は、核酸塩基を表わし、Ａはアデニン、Ｃはシト
シン、Ｇグニアンは、Ｔチミンを示している。図中番号
はｐ Ｔ Ｐ ６４−１に唯一存在する制限酵素Ｃ１ａ
Ｉ切断認識部位、ＡＴＣＧＡＴの最初の′Ａ″を１番と
して数えた番号を示している。 １ ・ 第１図の１ 第１図の２ 第１図の３ 第１図の４ 第１図の６ ＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧ ＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡ Ｇ
Ｔ丁ＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴ ＧＴＡＧ
ＡＴＡＡＣＴ第１図の７ ＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡ ＣＡＡＴＴＡＧＴＴＡ第 ＣＴＡＴＴ １図の８
り、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤ Ｎ Ａ ６１配列だ
けを、５′末端から３′末端の方向に記述している。図
中符号は、核酸塩基を表わし、Ａはアデニン、Ｃはシト
シン、Ｇグニアンは、Ｔチミンを示している。図中番号
はｐ Ｔ Ｐ ６４−１に唯一存在する制限酵素Ｃ１ａ
Ｉ切断認識部位、ＡＴＣＧＡＴの最初の′Ａ″を１番と
して数えた番号を示している。 １ ・ 第１図の１ 第１図の２ 第１図の３ 第１図の４ 第１図の６ ＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧ ＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡ Ｇ
Ｔ丁ＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴ ＧＴＡＧ
ＡＴＡＡＣＴ第１図の７ ＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡ ＣＡＡＴＴＡＧＴＴＡ第 ＣＴＡＴＴ １図の８
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて安定に複製され、宿主である
Ｅ．ｃｏｌｉにトリメトプリム耐性及びアンピシリン耐
性を与えることができ、５２９９塩基対の大きさを有し
、第１図において示されるＤＮＡ配列を有する組換えプ
ラスミドｐＴＰ６４−１。 ２、特許請求範囲第１項記載の組換えプラスミドｐＴＰ
６４−１を含有し、ジヒドロ葉酸還元酵素を菌体内タン
パクの１５％以上蓄積するという特徴を有するＥ．ｃｏ
ｌｉ Ｋ１２Ｃ６００株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60210813A JPS6269990A (ja) | 1985-09-24 | 1985-09-24 | 発現ベクタ−ｐＴＰ６４−１ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60210813A JPS6269990A (ja) | 1985-09-24 | 1985-09-24 | 発現ベクタ−ｐＴＰ６４−１ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6269990A true JPS6269990A (ja) | 1987-03-31 |
| JPH0148756B2 JPH0148756B2 (ja) | 1989-10-20 |
Family
ID=16595548
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60210813A Granted JPS6269990A (ja) | 1985-09-24 | 1985-09-24 | 発現ベクタ−ｐＴＰ６４−１ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6269990A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01144992A (ja) * | 1987-11-30 | 1989-06-07 | Agency Of Ind Science & Technol | 融合タンパク質の作成方法 |
| JPH01144974A (ja) * | 1987-11-30 | 1989-06-07 | Agency Of Ind Science & Technol | ジヒドロ葉酸還元酵素 |
-
1985
- 1985-09-24 JP JP60210813A patent/JPS6269990A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01144992A (ja) * | 1987-11-30 | 1989-06-07 | Agency Of Ind Science & Technol | 融合タンパク質の作成方法 |
| JPH01144974A (ja) * | 1987-11-30 | 1989-06-07 | Agency Of Ind Science & Technol | ジヒドロ葉酸還元酵素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0148756B2 (ja) | 1989-10-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |