JPH01144992A - 融合タンパク質の作成方法 - Google Patents
融合タンパク質の作成方法Info
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- JPH01144992A JPH01144992A JP62302153A JP30215387A JPH01144992A JP H01144992 A JPH01144992 A JP H01144992A JP 62302153 A JP62302153 A JP 62302153A JP 30215387 A JP30215387 A JP 30215387A JP H01144992 A JPH01144992 A JP H01144992A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、
ＤＨＦＲと略す。）遺伝子を改変した遺伝子を含有する
組換えプラスミドｐＴＰ７０−１（特許 昭６ｌ−３１
２８３６）中の改変ＤＨＦＲ遺伝子の３′末端側に、遺
伝暗号の読み取り枠を合うようにして異種遺伝子を導入
することにより、異種遺伝子産物をＤＨＦＲと融合した
タンパク質として、かつＤＨＦＲ活性を有する融合タン
パク質として効率よく生産させること特徴とする融合タ
ンパク質の作成方法に関するものである。
ＤＨＦＲと略す。）遺伝子を改変した遺伝子を含有する
組換えプラスミドｐＴＰ７０−１（特許 昭６ｌ−３１
２８３６）中の改変ＤＨＦＲ遺伝子の３′末端側に、遺
伝暗号の読み取り枠を合うようにして異種遺伝子を導入
することにより、異種遺伝子産物をＤＨＦＲと融合した
タンパク質として、かつＤＨＦＲ活性を有する融合タン
パク質として効率よく生産させること特徴とする融合タ
ンパク質の作成方法に関するものである。
本発明の産業上の利用分野としては、微生物工業２発酵
工業、医薬品製造の分野に好適である。
工業、医薬品製造の分野に好適である。
従来の技術
ＤＨＦＲは、ジヒドロ葉酸を還元しテトラヒドロ葉酸を
生成する反応を触媒する酵素であり１葉酸補酵素生合成
系の重要な酵素である。トリメトプリムは、サルファ剤
同様葉酸補酵素生合成系の阻害剤であるが、この薬剤は
ＤＨＦＲと強力に結合し、酵素活性を阻害する。このた
め、培地中にトリメトプリムが存在すると大腸菌などの
細菌は成長することができなくなる。ところが、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子をプラスミド等に組み込み、遺伝子のコピー数
を増大させるなどして菌体中の高めてやると。
生成する反応を触媒する酵素であり１葉酸補酵素生合成
系の重要な酵素である。トリメトプリムは、サルファ剤
同様葉酸補酵素生合成系の阻害剤であるが、この薬剤は
ＤＨＦＲと強力に結合し、酵素活性を阻害する。このた
め、培地中にトリメトプリムが存在すると大腸菌などの
細菌は成長することができなくなる。ところが、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子をプラスミド等に組み込み、遺伝子のコピー数
を増大させるなどして菌体中の高めてやると。
細菌はトリメトプリムに対して耐性を獲得する（Ｍ、
Ｉｗａｋｕｒａ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、 ｖｏ１９１゜ｐ、Ｉ２０５（１９８２
））。この性質をもちいて、ＤＨＦＲ遺伝子がプラスミ
ドの選択マーカーとして利用され。
Ｉｗａｋｕｒａ ｅｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、 ｖｏ１９１゜ｐ、Ｉ２０５（１９８２
））。この性質をもちいて、ＤＨＦＲ遺伝子がプラスミ
ドの選択マーカーとして利用され。
ＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを用い
て、実際遺伝子のクローニングが行われている（特許
昭５６−１４３５２０． Ｍ、Ｉｗａｋｕｒａｅｔ ａ
ｔ、、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ｖｏｌ、９
２．ｐ、８１５（１９８２））。
て、実際遺伝子のクローニングが行われている（特許
昭５６−１４３５２０． Ｍ、Ｉｗａｋｕｒａｅｔ ａ
ｔ、、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ｖｏｌ、９
２．ｐ、８１５（１９８２））。
ＤＨＦＲ遺伝子を用いたトリメトプリム耐性マーカーは
、遺伝子の大きさが約５００塩基対と小さいこと、遺伝
子中に利用しやすい制限酵素部位があること、遺伝子の
発現量とトリメトプリム耐性の強さとに非常に良い相関
間係が存在することなどから優れた遺伝マーカーであり
、広範囲な利用が期待されている。本発明者らは、大腸
菌のＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだ種々のベクターを開発
している（特許 第１３６９２８８号、第１３６９２９
１号、時開 昭５７−１１０９９９．特開６９−１３５
８８９．時開 昭５８−１３３７６９゜時開 昭６０−
１８４３８８．特開 昭６０−１９９３８５、時開 昭
６２−６９９９０．特開昭６２−１２６９８４．特許
昭６１−３１２８３６など）。
、遺伝子の大きさが約５００塩基対と小さいこと、遺伝
子中に利用しやすい制限酵素部位があること、遺伝子の
発現量とトリメトプリム耐性の強さとに非常に良い相関
間係が存在することなどから優れた遺伝マーカーであり
、広範囲な利用が期待されている。本発明者らは、大腸
菌のＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだ種々のベクターを開発
している（特許 第１３６９２８８号、第１３６９２９
１号、時開 昭５７−１１０９９９．特開６９−１３５
８８９．時開 昭５８−１３３７６９゜時開 昭６０−
１８４３８８．特開 昭６０−１９９３８５、時開 昭
６２−６９９９０．特開昭６２−１２６９８４．特許
昭６１−３１２８３６など）。
ＤＨＦＲ遺伝子の３′末端側に遺伝暗号の読み取り枠を
合うようにして異種遺伝子を導入することにより、異種
遺伝子産物をＤＨＦＲと融合したタンパク質として発現
生産しようとする方法としては、枯草菌のＤＨＦＲ遺伝
子を利用した方法が。
合うようにして異種遺伝子を導入することにより、異種
遺伝子産物をＤＨＦＲと融合したタンパク質として発現
生産しようとする方法としては、枯草菌のＤＨＦＲ遺伝
子を利用した方法が。
本発明者らにより行われている（特許 昭６１−２３４
００３、特許 昭６１−２４９２６０．特願 昭６２−
０７９３７７、 特許 昭６２−０７９３７８、
特許 昭６２−０８５４０６゜特許 昭６２−０９２８
８１など）。
００３、特許 昭６１−２４９２６０．特願 昭６２−
０７９３７７、 特許 昭６２−０７９３７８、
特許 昭６２−０８５４０６゜特許 昭６２−０９２８
８１など）。
問題点
しかしながら、枯草菌のＤＨＦＲ遺伝子の３″末端側に
遺伝暗号の読み取り枠を合うようにして異種遺伝子を結
合し、異種遺伝子産物をＤＨＦＲとの融合タンパク質と
して発現生産しようとする方法においては、遺伝子の発
現効率がそれほどでもなく２作られる融合タンパク質の
菌体内生産量は９面体タンパク質のせいぜい数％程度で
ある。
遺伝暗号の読み取り枠を合うようにして異種遺伝子を結
合し、異種遺伝子産物をＤＨＦＲとの融合タンパク質と
して発現生産しようとする方法においては、遺伝子の発
現効率がそれほどでもなく２作られる融合タンパク質の
菌体内生産量は９面体タンパク質のせいぜい数％程度で
ある。
このことから２発現効率を高め生産量を上げることが解
決しなければならない問題として残されていた。
決しなければならない問題として残されていた。
本発明者らは、すでに、大腸菌のＤＨＦＲ遺伝子につい
ては、酵素タンパク質を大量に生産させる朝換えプラス
ミドｐＴＰ６４−１を作成している（時間 昭６２−６
９９９０）。ｐＴＰ６４−１を有する大腸菌においては
、ＤＨＦＲが菌体タンパク質の約１５％もしくはそれ以
上生産されている。
ては、酵素タンパク質を大量に生産させる朝換えプラス
ミドｐＴＰ６４−１を作成している（時間 昭６２−６
９９９０）。ｐＴＰ６４−１を有する大腸菌においては
、ＤＨＦＲが菌体タンパク質の約１５％もしくはそれ以
上生産されている。
しかしながら、大腸菌のＤＨＦＲ遺伝子においては、遺
伝子の３′末端側に異種遺伝子を導入した場合、ＤＨＦ
ＲＨＦ溝性を失うことなく融合タンパク質として発現さ
れるか否かに間しては全く未知であった。
伝子の３′末端側に異種遺伝子を導入した場合、ＤＨＦ
ＲＨＦ溝性を失うことなく融合タンパク質として発現さ
れるか否かに間しては全く未知であった。
発明の目的
本発明の目的は、上記問題点を解決するために。
ＤＨＦＲのカルボキシ末端側に異種遺伝子産物が融合し
た融合タンパク質を効率良く生産する方法を確立するこ
とにある。
た融合タンパク質を効率良く生産する方法を確立するこ
とにある。
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＤＨＦＲ遺伝子を遺伝
マーカーとして容易に利用する目的で開発したｐＴＰ７
０−１のＤＨＦＲ遺伝子が、遺伝子の３′末端の配列を
人工的に改変しても酵素活性を有する改変ＤＨＦＲを菌
体タンパク質の約２０％程度発現生産するという事実に
着目し、上記問題点が解決できることを明らかにし１本
発明を完成させた。
マーカーとして容易に利用する目的で開発したｐＴＰ７
０−１のＤＨＦＲ遺伝子が、遺伝子の３′末端の配列を
人工的に改変しても酵素活性を有する改変ＤＨＦＲを菌
体タンパク質の約２０％程度発現生産するという事実に
着目し、上記問題点が解決できることを明らかにし１本
発明を完成させた。
発明の構成
本発明は、ｐＴＰ７０−１を利用したＤＨＦＲと異種遺
伝子産物との融合タンパク質の作成方法に関するもので
ある。
伝子産物との融合タンパク質の作成方法に関するもので
ある。
第１図は、ｐＴＰ７０−１の全塩基配列を示した図であ
る。第２図は、ｐＴＰ７０−１が作るＤＨＦＲのアミノ
酸配列を示した図である。ｐＴＰ７０−１に唯一存在す
る制限酵素ＢａｍＨ１部位（第１図の５３２番目から５
３７番目の配列）の配列は。
る。第２図は、ｐＴＰ７０−１が作るＤＨＦＲのアミノ
酸配列を示した図である。ｐＴＰ７０−１に唯一存在す
る制限酵素ＢａｍＨ１部位（第１図の５３２番目から５
３７番目の配列）の配列は。
ＤＨＦＲのカルボキシ末端から２から４番目（アミノ末
端から１５９から１６１番目、第２図参照）のアミノ酸
配列を暗号化する。ＢａｍＨＩは、付着末端（ＣＱｈｅ
ｓｉｖｅ ｅｎｄ）を生じる制限酵素であることから、
末端の相補性を利用して切断部位に異種ＤＮＡを導入す
ると、第１図の５３２番目と５３３番目の間にＤＮＡが
導入され、かつその配列は。
端から１５９から１６１番目、第２図参照）のアミノ酸
配列を暗号化する。ＢａｍＨＩは、付着末端（ＣＱｈｅ
ｓｉｖｅ ｅｎｄ）を生じる制限酵素であることから、
末端の相補性を利用して切断部位に異種ＤＮＡを導入す
ると、第１図の５３２番目と５３３番目の間にＤＮＡが
導入され、かつその配列は。
５’−Ｇ（５２２番目）ＧＡＴＣ−（異種ＤＮＡ）−Ｇ
Ａ Ｔ ＣＣ（５３７番目）−３′という共通配列を持
つことになる。従って、異種ＤＮＡが導入されることに
より９作られる融合タンパク質は、第２図に示されるＤ
ＨＦＲのアミノ酸配列のうち、一番目のメチオニン（Ｎ
ｅｔ）から１６０番目のイソロイシン（１１ｅ）までの
アミノ酸配列が全く共通で、１６０番目以降に異種Ｄ
Ｎ Ａ由来のアミノ酸配列をしている融合タンパク質が
作られる。
Ａ Ｔ ＣＣ（５３７番目）−３′という共通配列を持
つことになる。従って、異種ＤＮＡが導入されることに
より９作られる融合タンパク質は、第２図に示されるＤ
ＨＦＲのアミノ酸配列のうち、一番目のメチオニン（Ｎ
ｅｔ）から１６０番目のイソロイシン（１１ｅ）までの
アミノ酸配列が全く共通で、１６０番目以降に異種Ｄ
Ｎ Ａ由来のアミノ酸配列をしている融合タンパク質が
作られる。
本発明ではこの特徴を利用して、ＤＨＦＲと異種遺伝子
産物との融合タンパク質の作成方法を示している。
産物との融合タンパク質の作成方法を示している。
融合タンパク質の作成は、 （■）融合遺伝子の作成、
即ち、ｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲ遺伝子の３′末端側へ
の異種遺伝子が結合した遺伝子を有する組換えプラスミ
ドの作成、（ＩＩ）、Ｉ換えプラスミドの大腸菌への導
入、（■）大腸菌で発現した融合遺伝子産物である融合
タンパク質の検出。
即ち、ｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲ遺伝子の３′末端側へ
の異種遺伝子が結合した遺伝子を有する組換えプラスミ
ドの作成、（ＩＩ）、Ｉ換えプラスミドの大腸菌への導
入、（■）大腸菌で発現した融合遺伝子産物である融合
タンパク質の検出。
により行うことができる。
（１）融合遺伝子の作成
ｐＴＰ７０−１のＢａｒｎＨＩ部位を用いたＤＨＦＲ遺
伝子との融合遺伝子の作成法としては、ΦＢａｍＨ１に
よる切断によって生じる付着末端を利用し、ＤＨＦＲ遺
伝子の読み取り枠を合わせて融合遺伝子を作成する方法
、■ＢａｍＨＩによって切断した後、ＤＮＡポリメラー
ゼもしくは逆転写酵素を用いて平滑末端にし、ＤＨＦＲ
遺伝子の読み取り枠を合わせ、異種ＤＮＡをプラントエ
ンドライゲションにより結合し融合遺伝子を作成する方
法、■ＢａｍＨＩによって切断した後、ヌクレアーゼＳ
１もしくは１本鎖ＤＮＡを特異的に切断するヌクレアー
ゼを用いて平滑末端にし、 ＤＨＦＲ遺伝子の読み取
り枠を合わせ、異種ＤＮＡをプラントエンドライゲショ
ンにより結合し融合遺伝子を作成する方法、■ＢａｍＨ
Ｉによフて切断した後、エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１
などのエキソヌクレアーゼ平滑末端にし、異種ＤＮＡを
プラントエンドライゲションにより結合し融合遺伝子を
作成する方法などの方法を行うことができる。
伝子との融合遺伝子の作成法としては、ΦＢａｍＨ１に
よる切断によって生じる付着末端を利用し、ＤＨＦＲ遺
伝子の読み取り枠を合わせて融合遺伝子を作成する方法
、■ＢａｍＨＩによって切断した後、ＤＮＡポリメラー
ゼもしくは逆転写酵素を用いて平滑末端にし、ＤＨＦＲ
遺伝子の読み取り枠を合わせ、異種ＤＮＡをプラントエ
ンドライゲションにより結合し融合遺伝子を作成する方
法、■ＢａｍＨＩによって切断した後、ヌクレアーゼＳ
１もしくは１本鎖ＤＮＡを特異的に切断するヌクレアー
ゼを用いて平滑末端にし、 ＤＨＦＲ遺伝子の読み取
り枠を合わせ、異種ＤＮＡをプラントエンドライゲショ
ンにより結合し融合遺伝子を作成する方法、■ＢａｍＨ
Ｉによフて切断した後、エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１
などのエキソヌクレアーゼ平滑末端にし、異種ＤＮＡを
プラントエンドライゲションにより結合し融合遺伝子を
作成する方法などの方法を行うことができる。
これらの方法は７組換えＤＮＡを行っている当事者であ
ればなんの問題もなく容易に行うことができる。実施例
においては、■ＢａｍＨＩによる切断によって生じる付
着末端を利用し、大腸菌の染色体ＤＮＡを５ａｕ３ＡＩ
で切断して得られるＤＮＡ断片を利用して種々の分子量
を有する融合タンパク質を作成できることを示している
。
ればなんの問題もなく容易に行うことができる。実施例
においては、■ＢａｍＨＩによる切断によって生じる付
着末端を利用し、大腸菌の染色体ＤＮＡを５ａｕ３ＡＩ
で切断して得られるＤＮＡ断片を利用して種々の分子量
を有する融合タンパク質を作成できることを示している
。
（ｎ）！換えプラスミドの大腸菌への導入（Ｉ）で作ら
れた組換えプラスミドの大腸菌細胞への導入は、いわゆ
るトランスホーメーション法によフて行うことができる
。Ｍｉ換えプラスミドのトランスホーメーション法とし
ては種々の方法が知られているが、本発明で作られるｐ
ＴＰ７０−１を用いて作られた組換えプラスミドの大腸
菌への導入は１組換えＤＮＡを行っている当事者であれ
ばなんの問題もなく容易に行うことができ。
れた組換えプラスミドの大腸菌細胞への導入は、いわゆ
るトランスホーメーション法によフて行うことができる
。Ｍｉ換えプラスミドのトランスホーメーション法とし
ては種々の方法が知られているが、本発明で作られるｐ
ＴＰ７０−１を用いて作られた組換えプラスミドの大腸
菌への導入は１組換えＤＮＡを行っている当事者であれ
ばなんの問題もなく容易に行うことができ。
トランスホーメーションの方法にはよらない。
ｐＴＰ７０−１を用いて作られた朝換えプラスミドが導
入された大腸菌は、寒天培地を用いて容易に検出するこ
とができる。ｐＴＰ７０−１は。
入された大腸菌は、寒天培地を用いて容易に検出するこ
とができる。ｐＴＰ７０−１は。
遺伝マーカーとして、アンピシリン耐性とトリメトプリ
ム耐性を有する。アンピシリン耐性は、ＤＨＦＲ遺伝子
との融合遺伝子を作る際に全く操作を受けないことから
２組換えプラスミドにもそのまま受は継がれる。また、
トリメトプリム耐性を付与する遺伝子であるＤＨＰＲ遺
伝子は、」二記（１）の融合遺伝子の作成操作によって
作られるＤＨＦＲのカルボキシ末端側に異種ペプチドも
しくはタンパク質が結合してもＤ ＨＦ 、Ｒ酵素活性
を失わないことから、トリメドブラム耐性を付与する能
力を有している。従って、ｐＴＰ７０−１を用いて作ら
れた組換えプラスミドが導入された大腸菌は、アンピシ
リンおよびトリメトプリムに対して耐性を示す。寒天培
地として、形質転換に用いる大腸菌が生長できる培地に
アンピシリンおよびトリメトプリムを加えた培地を用い
ると、この培地に生長する形質転換株は、ｐＴＰ７０−
１を用いて作られた組換えプラスミドが導入された大腸
菌である。
ム耐性を有する。アンピシリン耐性は、ＤＨＦＲ遺伝子
との融合遺伝子を作る際に全く操作を受けないことから
２組換えプラスミドにもそのまま受は継がれる。また、
トリメトプリム耐性を付与する遺伝子であるＤＨＰＲ遺
伝子は、」二記（１）の融合遺伝子の作成操作によって
作られるＤＨＦＲのカルボキシ末端側に異種ペプチドも
しくはタンパク質が結合してもＤ ＨＦ 、Ｒ酵素活性
を失わないことから、トリメドブラム耐性を付与する能
力を有している。従って、ｐＴＰ７０−１を用いて作ら
れた組換えプラスミドが導入された大腸菌は、アンピシ
リンおよびトリメトプリムに対して耐性を示す。寒天培
地として、形質転換に用いる大腸菌が生長できる培地に
アンピシリンおよびトリメトプリムを加えた培地を用い
ると、この培地に生長する形質転換株は、ｐＴＰ７０−
１を用いて作られた組換えプラスミドが導入された大腸
菌である。
（Ｉ［Ｉ）大腸菌で発現した融合遺伝子産物である融合
タンパク質の検出 ｐＴＰ７０−１は、改変ＤＨＦＲ大量に作らせることが
できる。ｐＴＰ７０−１を含有する大腸菌を、ＹＴ＋Ａ
ｐ培地で対数生長期の後期から定常期まで培養した面体
を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、５
ＤＳ−ＰＡＧＥと略す。）用のサンプル調製液（実施例
３参照）に懸濁・溶菌し、−これを５ＤＳ−ＰＡＧＥで
分離し。
タンパク質の検出 ｐＴＰ７０−１は、改変ＤＨＦＲ大量に作らせることが
できる。ｐＴＰ７０−１を含有する大腸菌を、ＹＴ＋Ａ
ｐ培地で対数生長期の後期から定常期まで培養した面体
を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、５
ＤＳ−ＰＡＧＥと略す。）用のサンプル調製液（実施例
３参照）に懸濁・溶菌し、−これを５ＤＳ−ＰＡＧＥで
分離し。
タンパク質をクマジーブリリアントブルーで染色すると
１分子量約２０，０００のところにもっとも明瞭なバン
ド（メインバンド）が示される。
１分子量約２０，０００のところにもっとも明瞭なバン
ド（メインバンド）が示される。
ｐＴｐ １０４−４を用いて作成した組換えプラスミド
を含有する大腸菌は、ＤＨＦＲの融合タンパク質を大量
に作ることができ２作られた融合タンパク質は、ｐＴＰ
７０−１を含有する大腸菌が作る改変ＤＨＦＲと同様に
して、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検出することができる
。５ＤＳ−ＰＡＧＥの方法は、 Ｌａｅｍｍｌｉの方法
に従って容易に行うことができる。５ＤＳ−ＰＡＧＥに
おいては９分子量が小さいタンパク質の泳動度が大であ
り９分子量の大きいタンパク質の泳動度とが小である。
を含有する大腸菌は、ＤＨＦＲの融合タンパク質を大量
に作ることができ２作られた融合タンパク質は、ｐＴＰ
７０−１を含有する大腸菌が作る改変ＤＨＦＲと同様に
して、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検出することができる
。５ＤＳ−ＰＡＧＥの方法は、 Ｌａｅｍｍｌｉの方法
に従って容易に行うことができる。５ＤＳ−ＰＡＧＥに
おいては９分子量が小さいタンパク質の泳動度が大であ
り９分子量の大きいタンパク質の泳動度とが小である。
また、泳動度と分子量との間には非常に良い相関関係が
あることが知られている。このことから。
あることが知られている。このことから。
融合タンパク質の分子量を推定することができ。
導入した遺伝子の配列と考え併せて、目的の融合タンパ
ク質であるか否かを判定することが可能である。
ク質であるか否かを判定することが可能である。
次に本発明の実施例および参考例を示す。
実施例１
融合タンパク質の作成
約１μｇのｐＴＰ７０−１を、ＢａｍＨＩで切断した後
、アルカリホスファターゼ処理をした。アルカリホスフ
ァターゼ処理したＤＮＡをフェノール処理することによ
り、共存する酵素タンパク質を変性除去し、その後エタ
ノールでＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを７０％
エタノールで洗った後、エタノールを除き、減圧下に沈
澱を乾燥させた。
、アルカリホスファターゼ処理をした。アルカリホスフ
ァターゼ処理したＤＮＡをフェノール処理することによ
り、共存する酵素タンパク質を変性除去し、その後エタ
ノールでＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを７０％
エタノールで洗った後、エタノールを除き、減圧下に沈
澱を乾燥させた。
約５μｇの大腸菌染色体ＤＮＡを、５ａｕ３Ａ！で切断
した後、エタノールでＤＮＡを沈澱させた。
した後、エタノールでＤＮＡを沈澱させた。
沈澱したＤＮＡを７０％エタノールで洗った後。
エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥させた。
乾燥させたＤＮＡを、それぞれ、５０μｍのリガーゼ用
反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４，５
ｍＭ ＭｇＣｌ２゜１０ｍＭジチオトレイトール、５
ｍＭ ＡＴＰ）に溶解後２両者を合わせ、これに５ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加えて、２５’Ｃで、４
時間ＤＮＡの連結反応を行わせた。この反応物を、形質
転換法（ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏ
ｄ、上記文献ｌに記載）に従って。
反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４，５
ｍＭ ＭｇＣｌ２゜１０ｍＭジチオトレイトール、５
ｍＭ ＡＴＰ）に溶解後２両者を合わせ、これに５ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加えて、２５’Ｃで、４
時間ＤＮＡの連結反応を行わせた。この反応物を、形質
転換法（ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏ
ｄ、上記文献ｌに記載）に従って。
大腸菌に取り込ませた。この処理をした面体を。
５０ｍｇ／Ｉのアンとシリンナトリウムおよび１０ｍｇ
／Ｉのトリメトプリムを含む栄養寒天培地 （培地ｌｌ
中に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウム、５
ｇのイーストエキス、５８のポリペプトン。
／Ｉのトリメトプリムを含む栄養寒天培地 （培地ｌｌ
中に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウム、５
ｇのイーストエキス、５８のポリペプトン。
１５８の寒天を含む。）上に塗布し、３７°Ｃて２４時
間培養することにより、約５００のコロニーを得ること
ができた。これらのコロニーから適当に２０個選び、１
．５ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に、５ｇのＮａ
Ｃ１，５ｇのイーストエキス。
間培養することにより、約５００のコロニーを得ること
ができた。これらのコロニーから適当に２０個選び、１
．５ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に、５ｇのＮａ
Ｃ１，５ｇのイーストエキス。
８ｇのトリプトン、５０ｍｇのアンピシリンナトリウム
を含む。）で、３７＠Ｃ，１晩、菌体を培養した。培養
液を、各々エッペンドルフ遠心管にとり。
を含む。）で、３７＠Ｃ，１晩、菌体を培養した。培養
液を、各々エッペンドルフ遠心管にとり。
１２．０００回転回転下１０分間遠心分離し、菌体を沈
澱として集めた。これに、０．１ｍｌの電気泳動用サン
プル調製液（０，０６２５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐ
Ｈ６，８，２％のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）。
澱として集めた。これに、０．１ｍｌの電気泳動用サン
プル調製液（０，０６２５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐ
Ｈ６，８，２％のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）。
ｌｏｚのグリセリン、５χの２−メルカプトエタノール
。
。
帆００１％のブロムフェノールブルーな含む。）を加え
、菌体を！！！、濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、
菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（ｌＪ、に、ｌａｍｍ
ｌ ｉ ；Ｎａｔｕｒｅ、 ｖｏｌ、２２７． ｐ、６
８０（１９７０））に従って分析した。
、菌体を！！！、濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、
菌体を溶かした。この処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（ｌＪ、に、ｌａｍｍ
ｌ ｉ ；Ｎａｔｕｒｅ、 ｖｏｌ、２２７． ｐ、６
８０（１９７０））に従って分析した。
標準サンプルとしてｐＴＰ７０−１を含有する大腸菌に
同様な処理をしたもの、および分子量マーカーとしてラ
クトアルブミン（分子量１４，２００） 。
同様な処理をしたもの、および分子量マーカーとしてラ
クトアルブミン（分子量１４，２００） 。
トリプシンインヒビター（分子ｆｆｉ ２０，１０
０）、）リプシノーケン（分子ｆｆ１２４，０００）
、カルボニックアンヒドラーゼ（分子ｆｆ１２９，００
０） 、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（分子量３６，０００） 。
０）、）リプシノーケン（分子ｆｆ１２４，０００）
、カルボニックアンヒドラーゼ（分子ｆｆ１２９，００
０） 、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（分子量３６，０００） 。
卵アルブミン（分子［４５，０００） 、および牛血清
アルブミン（分子量６６．０００）を含むサンプルをポ
リアクリルアミド濃度のｌＯから２０％濃度勾配ゲルで
泳動した。その結果、調べた４０個のコロニーのうち、
３２個ではｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲバンドが消失いそ
れより明らかに分子量が大きくなったタンパク質（おの
おのの菌体で新たに現れたタンパク質のバンドの位置は
異なっていた。）を新たに生産していた。分子量マーカ
ータンパク質の泳動度と比較することにより、それらの
タンパク質の分子量は、約２１．０００から約３５ 、
０００の間の値であった。ｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲ（
分子量１８．３７９）は、この条件で分子盟約２０ 、
０００のタンパク質として泳動した。従って、大腸菌の
染色体ＤＮＡの５ａｕ３ＡＩ切断断片を融合することに
よって２手ＨＦＲのカルボキシ末端側に１分子量約１．
０００から約１５，０００のペプチドもしくはタンパク
質が融合した融合タンパク質が生成したことが示された
。融合タンパク質を生産する大腸菌は、いずれもトリメ
トプリム耐性であることから、融合タンパク質は、ＤＨ
ＦＲ活性を有することが明らかである。
アルブミン（分子量６６．０００）を含むサンプルをポ
リアクリルアミド濃度のｌＯから２０％濃度勾配ゲルで
泳動した。その結果、調べた４０個のコロニーのうち、
３２個ではｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲバンドが消失いそ
れより明らかに分子量が大きくなったタンパク質（おの
おのの菌体で新たに現れたタンパク質のバンドの位置は
異なっていた。）を新たに生産していた。分子量マーカ
ータンパク質の泳動度と比較することにより、それらの
タンパク質の分子量は、約２１．０００から約３５ 、
０００の間の値であった。ｐＴＰ７０−１のＤＨＦＲ（
分子量１８．３７９）は、この条件で分子盟約２０ 、
０００のタンパク質として泳動した。従って、大腸菌の
染色体ＤＮＡの５ａｕ３ＡＩ切断断片を融合することに
よって２手ＨＦＲのカルボキシ末端側に１分子量約１．
０００から約１５，０００のペプチドもしくはタンパク
質が融合した融合タンパク質が生成したことが示された
。融合タンパク質を生産する大腸菌は、いずれもトリメ
トプリム耐性であることから、融合タンパク質は、ＤＨ
ＦＲ活性を有することが明らかである。
また、新たに出現したタンパク質のバンドのクマジブリ
リアントブルーによる染色の状態から。
リアントブルーによる染色の状態から。
タンパク質の生成量が推定されるが、いずれもｐＴＰ７
０−１のＤＨＦＲのバンドと同程度かその以上であり、
融合タンパク質が安定に生産されることか示された。
０−１のＤＨＦＲのバンドと同程度かその以上であり、
融合タンパク質が安定に生産されることか示された。
さらに９本実施例では、大腸菌の染色体ＤＮＡをＳａｕ
人■で切断して得られるＤＮＡ断片を融合遺伝子の作成
に用いており、得られた融合タンパク質は、たまたま遺
伝子の読み取り枠が一致いその読み取り枠上で翻訳停止
暗号が出現するまでの配列が、融合したことによって得
られたものと考えられる。
人■で切断して得られるＤＮＡ断片を融合遺伝子の作成
に用いており、得られた融合タンパク質は、たまたま遺
伝子の読み取り枠が一致いその読み取り枠上で翻訳停止
暗号が出現するまでの配列が、融合したことによって得
られたものと考えられる。
従って２本発明の方法は、導入されるＤＮＡ配列に規制
されないことが示唆される。
されないことが示唆される。
発明の効果
本発明に、従えば、ＤＨＦＲのカルボキシ末端側に有用
ペプチドもしくはタンパク質を融合することが容易であ
る。大腸菌の菌体で不安定なペプチドもしくはタンパク
質の生産には、融合タンパク質として生産されることが
期待されており、本発明は、ＤＨＦＲと融合タンパク質
を作らせることによる有用ペプチドもしくはタンパク質
の大量生産に貢献することが大である。
ペプチドもしくはタンパク質を融合することが容易であ
る。大腸菌の菌体で不安定なペプチドもしくはタンパク
質の生産には、融合タンパク質として生産されることが
期待されており、本発明は、ＤＨＦＲと融合タンパク質
を作らせることによる有用ペプチドもしくはタンパク質
の大量生産に貢献することが大である。
第１図は、ｐＴＰ７０−１の全塩基配列を示した図であ
り、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、５
′末端から３′末端の方向に記述している。図中符号は
、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、
Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は
、ｐＴＰ７０−ｉに２筒所存在する制限酵素ＣＩａＩ切
断認識部位のうち制限酵素ＨｉｎｄｌＩＩ切断部位に近
い方のＣ１ａｌ切断認識部位の１５’ ＡＴＣＧＡＴ
−３’ 、 の最初の” Ａ”を１番として数えた番号
を示している。 第２図は、ｐＴＰ７０−１中に存在するり、ＨＦＲを暗
号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配
列を示す図である。図中符号は、核酸塩基およびアミノ
酸を表し、Ａはアデニンを。 Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを。 Ａｌａはアラニンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓｎは
アスパラギンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｃｙｓは
システィンを、Ｇｌｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタ
ミン酸を、 Ｇｌｙはグリシンを、Ｉ（ｉｓはヒスチ
ジンを、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを
、Ｌｙｓはリジンを。 Ｍｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、
Ｐｒｏはプロリンを、Ｓｅｒはセリンを。 Ｔｈｒはトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔ
ｙｒはチロシンを、Ｖａｌはバリンを示している。図中
番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗合化す
るＡＴＧコドンの”Ａ”を１番として数えた番号を示し
ている。 ＡＴＣＧＡＴＧＴＴＡ ＡＣＡＧＡＴＣＴＡＡ ＧＣＴ
ＴＡＡＣＴＡＡＡＣＴＴＣＣＡＴＧＡ ＴＣＡＧＴＣＴ
ＧＡＴ ＴＧＣＧＧＣＧＴＴＡｌｌｏ １
２０ １３０ＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡ
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ＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡ ＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＣ
ＡＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＣ
ＡＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＧ ＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧ
ＴＡＡＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧ ＴＧＧＴ
ＧＡＣＧＴＡ ＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡ
ＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＡＣＴＡ
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ＡＴＣＧＣＧＴＴＡＴＣＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＧＣ
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ＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧ
ＡＡＧＴＣＧＧＴＧ ＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧ
ＡＴＴＧＧ ＣＧＧＣＧＧＴＣＧＣＡＡＡＣＴＧＴＡＴ
ＣＴＧＡＣＧＣＡＴＡＴＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＣＡＴ
ＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＴＣＡ ＧＣＴＣＣＴＴＣ
ＣＧＡＣＴＴＡＴＧＡＣＴ ＧＴＣＴＴＣＴＴＴＡＣＧ
ＣＴＣＴＧＧＧＴ ＣＡＴＴＴＴＣＧＧＣｌｏｌｏ
１０２０ ＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴ ＣＧＣＴＴＧＣＧＧＴＣＴＴＣ
ＧＴＣＡＣＴ ＧＧＴＣＣＣＧＣＣＡｌｌｌｏ
１１２０ ＴＣＧＣＣＧＧＣＡＴ ＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＣＧＣ
ＧＡＧＧＣＴ ＧＧＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧ
ＡＣＣＧＡＴＧＣＣＣＴＴ ＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣＧＴ
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ＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴ ＣＧＴＡＧＧＡＣＡ
Ｇ ＧＴＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴ ＴＴ
ＣＧＣＴＧＧＡＧ ＣＧＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＴＣＧＧ
ＡＡＴＣＴＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＡＡＧＣＣ
ＣＡＡＡＣＧＴＴＴ ＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧ ＣＡＧＧ
ＣＣＡＴＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＣＴ ＡＣＧＴＣＴＴＧ
ＣＴ ＧＧＣＧＴＴＣＧＣＧＣＣＣＣＡＴＴＡＴＧ Ａ
ＴＴＣＴＴＣＴＣＧ ＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧｌどＨＪ
ｌどどＵ ＣＡＴＣＧＧＧＡＴＧ ＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣ。 ＡＣＣＡＴＣＡＧＧＧ ＡＣＡＧＣＴＴＣＡＡ １ＴＣ
ＧＡＴＣＡＣＴＧ ＧＡＣＣＧＣＴＧＡＴ１ＣＡＣＡＴ
ＧＧＡＡＣＧＧＧＴＴＧＧＣＡＴ １ＧＣＣＴＣＣＣＣ
ＧＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＣ１ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧ Ｇ
ＣＧＧＣＡＣＣＴＣ１ＧＣＣＡＡＴＣＡＡＴ ＴＣＴＴ
ＧＣＧＧＡＧ 。 第 ｌ Ｉとｊす ＡＧＧＣＣＡＴＧＣＴ ＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧ ＧＴＡ
ＧＡＴＧＡＣＧＧＧＡＴＣＧＣＴＣＧ ＣＧＧＣＴＣＴ
ＴＡＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＴＣＧＴＣＡＣＧＧＣＧ Ａ
ＴＴＴＡＴＧＣＣＧ ＣＣＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＡＴＴ
ＧＴＡＧＧ ＣＧＣＣＧＣＣＣＴＡ ＴＡＣＣＴＴＧＴ
ＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＡ ＧＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＴ
ＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＡＡＣＧＧＡＴ ＴＣＡＣＣＡ
ＣＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴ
ＧＣＧＣＡＡＡＣＣＡ ＡＣＣＣＴＴＧＧＣＡ図
の ２ ＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴ ＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＴＧＡ
ＧＧＡＣＣＣＧＧＣＴＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＡＴ
Ａ ＣＧＣＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣ
ＡＡＣＡＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＧＴＣＡ
ＧＣＣＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣ
ＧＣＴＧＧＣＡ ＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＡ
ＧＴＴ ＧＴＴＴＡＣＣＣＴＣＡＴＣＡＧＴＡＡＣＣＣ
ＧＴＡＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＧＣＡＴＧＡ
ＴＣＧＴ ＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＣ
ＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴ ＡＧＣＡＧＡＡＴＧＡＣＧＴＧ
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ＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＣＧ ＧＴＴＴＣＣＧＴＧＴ Ｔ
ＴＣＧＴＡＡＡＧＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＧ
ＴＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＡ
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ＴＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＣＣＣＧ ＣＣＧＣＡＴＣＣＡ
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ＧＴＴＣＡＴＣＧＣＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＧＴＴＴＣＡ
ＴＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＡＣＣＣＣＣＡＴＧＡＡ ＣＡ
ＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＣＴＴ
ＡＡＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＧ ＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＣ
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ＡＣＣＡＡＡＣＡＴＧＧＣＣＣＧＣＴ ＴＴＡＴＣＡＧ
ＡＡＧ ＣＣＡＧＡＣＡＴＴＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧ
ＣＧＧＡＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＴＡＣＧＣＴＧ
ＡＴＧＡ ＧＣＴＴＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧ
ＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴ ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡ ＧＣＴ
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ＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴ図 の
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ＴＴＧＴＡＣＴ ＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣ１ＧＴＡＡＧＧ
ＡＧＡＡ ＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴ ＋ＣＴＣＧＣＴＧＣ
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１７Ｒ１ｎ ７Ｒ７ｎ 丁ＡＴＡＣＴＧＧＣＴ ＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧ Ｇ
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ＧＣＴＧＣＧＧＣＧ ＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡ ＧＣＴＣ
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ＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣ蛎ＡＧＧＣＣＡＧＧ ＡＡ
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ＴＴＧＴＴＴ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＣＴＴ
ＴＧ ＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧ Ｇ
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”（６７ｎＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡ
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ＣＴＧＧＣＣＣＣＡ ＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴ”（６’（
ｎ ”（６４（１Ｆ６５（１ＧＡＴＡＣＣ
ＧＣＧＡ ＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧ
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ＧＣＧＡＧＴＴＡ ＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣ
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Ａ図 の ５ ＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧ ＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡ ＧＴＡ
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ＧＣＴ ＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧ
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ＴＣＡＴ７１４１（１ｌＬ４．）（１４４’ｔｎＡＡＧ
ＴＣＡＴＴＣＴ ＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＧＴＣＡＡＣＡ
ＣＧＧ ＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡ
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ＣＴＴＴＣＧＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ ＡＡＴＴＣ
ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＧＴＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴ 第 １ 図 の ＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴ ＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＴＣＡ
ＴＧＡＣＡＴ ＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＴＣＡＡＧＡＡＴ
ＴＡ ＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡ Ｔ
ＡＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡｎＴＣＣＣ
ＧＧＡＴＴＡＣＧＧ１ｙＡｓｐＴｈｒＨｉｓＰｈｅＰｒ
ｏＡｓｐＴｙｒＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡ １ｎ１１ｅ 第 ２図 手続補正書 昭和６３年１１月３０日 一°。
り、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、５
′末端から３′末端の方向に記述している。図中符号は
、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、
Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は
、ｐＴＰ７０−ｉに２筒所存在する制限酵素ＣＩａＩ切
断認識部位のうち制限酵素ＨｉｎｄｌＩＩ切断部位に近
い方のＣ１ａｌ切断認識部位の１５’ ＡＴＣＧＡＴ
−３’ 、 の最初の” Ａ”を１番として数えた番号
を示している。 第２図は、ｐＴＰ７０−１中に存在するり、ＨＦＲを暗
号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸配
列を示す図である。図中符号は、核酸塩基およびアミノ
酸を表し、Ａはアデニンを。 Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを。 Ａｌａはアラニンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓｎは
アスパラギンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｃｙｓは
システィンを、Ｇｌｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタ
ミン酸を、 Ｇｌｙはグリシンを、Ｉ（ｉｓはヒスチ
ジンを、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを
、Ｌｙｓはリジンを。 Ｍｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、
Ｐｒｏはプロリンを、Ｓｅｒはセリンを。 Ｔｈｒはトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔ
ｙｒはチロシンを、Ｖａｌはバリンを示している。図中
番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗合化す
るＡＴＧコドンの”Ａ”を１番として数えた番号を示し
ている。 ＡＴＣＧＡＴＧＴＴＡ ＡＣＡＧＡＴＣＴＡＡ ＧＣＴ
ＴＡＡＣＴＡＡＡＣＴＴＣＣＡＴＧＡ ＴＣＡＧＴＣＴ
ＧＡＴ ＴＧＣＧＧＣＧＴＴＡｌｌｏ １
２０ １３０ＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡ
ＴＧＣＣＧＴ ＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＣＡＡＣ
ＡＣＣＴＴＡＡＡＴＡＡＡ ＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＴＣ
ＡＡＴＣＧＧＴＣＧＴＣＣＧＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＣ
ＡＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＧ ＧＡＣＧＡＴＣＧＣＧ
ＴＡＡＣＧＴＧＧＧＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧ ＴＧＧＴ
ＧＡＣＧＴＡ ＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡ
ＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＣＡＡＣＴＡ
ＡＣＴＣＣＧＧ ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＧＧＴＡＧ
ＡＴＣＧＣＧＴＴＡＴＣＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＧＣ
ＣＴＧＧＴＴＴＡＴＧＧＧＣＣＧＣＣＡ ＴＡＣＣＴＧ
ＧＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧ
ＡＡＧＴＣＧＧＴＧ ＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧ
ＡＴＴＧＧ ＣＧＧＣＧＧＴＣＧＣＡＡＡＣＴＧＴＡＴ
ＣＴＧＡＣＧＣＡＴＡＴＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＣＡＴ
ＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＧＴＣＡ ＧＣＴＣＣＴＴＣ
ＣＧＡＣＴＴＡＴＧＡＣＴ ＧＴＣＴＴＣＴＴＴＡＣＧ
ＣＴＣＴＧＧＧＴ ＣＡＴＴＴＴＣＧＧＣｌｏｌｏ
１０２０ ＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴ ＣＧＣＴＴＧＣＧＧＴＣＴＴＣ
ＧＴＣＡＣＴ ＧＧＴＣＣＣＧＣＣＡｌｌｌｏ
１１２０ ＴＣＧＣＣＧＧＣＡＴ ＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＣＧＣ
ＧＡＧＧＣＴ ＧＧＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧ
ＡＣＣＧＡＴＧＣＣＣＴＴ ＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣＧＴ
ＧＧＧＣＧＣＧＧ ＧＧＣＡＴＧＡＣＴＡ ＴＣＧＴＣ
ＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＣＡＡＣＴ ＣＧＴＡＧＧＡＣＡ
Ｇ ＧＴＧＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴ ＴＴ
ＣＧＣＴＧＧＡＧ ＣＧＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＴＣＧＧ
ＡＡＴＣＴＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＣＧＣＴＣＡＡＧＣＣ
ＣＡＡＡＣＧＴＴＴ ＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧ ＣＡＧＧ
ＣＣＡＴＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＣＴ ＡＣＧＴＣＴＴＧ
ＣＴ ＧＧＣＧＴＴＣＧＣＧＣＣＣＣＡＴＴＡＴＧ Ａ
ＴＴＣＴＴＣＴＣＧ ＣＴＴＣＣＧＧＣＧＧｌどＨＪ
ｌどどＵ ＣＡＴＣＧＧＧＡＴＧ ＣＣＣＧＣＧＴＴＧＣ。 ＡＣＣＡＴＣＡＧＧＧ ＡＣＡＧＣＴＴＣＡＡ １ＴＣ
ＧＡＴＣＡＣＴＧ ＧＡＣＣＧＣＴＧＡＴ１ＣＡＣＡＴ
ＧＧＡＡＣＧＧＧＴＴＧＧＣＡＴ １ＧＣＣＴＣＣＣＣ
ＧＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＣ１ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧ Ｇ
ＣＧＧＣＡＣＣＴＣ１ＧＣＣＡＡＴＣＡＡＴ ＴＣＴＴ
ＧＣＧＧＡＧ 。 第 ｌ Ｉとｊす ＡＧＧＣＣＡＴＧＣＴ ＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧ ＧＴＡ
ＧＡＴＧＡＣＧＧＧＡＴＣＧＣＴＣＧ ＣＧＧＣＴＣＴ
ＴＡＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＴＣＧＴＣＡＣＧＧＣＧ Ａ
ＴＴＴＡＴＧＣＣＧ ＣＣＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＡＴＴ
ＧＴＡＧＧ ＣＧＣＣＧＣＣＣＴＡ ＴＡＣＣＴＴＧＴ
ＣＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＡ ＧＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＴ
ＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＡＡＣＧＧＡＴ ＴＣＡＣＣＡ
ＣＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴ
ＧＣＧＣＡＡＡＣＣＡ ＡＣＣＣＴＴＧＧＣＡ図
の ２ ＣＧＧＧＣＡＧＣＧＴ ＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＴＧＡ
ＧＧＡＣＣＣＧＧＣＴＡＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＧＡＴ
Ａ ＣＧＣＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣ
ＡＡＣＡＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＧＴＣＡ
ＧＣＣＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧＣ
ＧＣＴＧＧＣＡ ＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＡ
ＧＴＴ ＧＴＴＴＡＣＣＣＴＣＡＴＣＡＧＴＡＡＣＣＣ
ＧＴＡＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＧＣＡＴＧＡ
ＴＣＧＴ ＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＣ
ＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴ ＡＧＣＡＧＡＡＴＧＡＣＧＴＧ
ＡＡＧＣＧＡ ＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡＡＣＧＴＣ
ＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＣＧ ＧＴＴＴＣＣＧＴＧＴ Ｔ
ＴＣＧＴＡＡＡＧＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＧ
ＴＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＡ
ＣＣＴＡＣＡＴＣＴ ＧＴＡＴＴＡＡＣＧＡＧＴＧＡＴ
ＴＴＴＴＣＴＣＴＧＧＴＣＣＣＧ ＣＣＧＣＡＴＣＣＡ
ＴＡＣＡＡＣＧＴＴＣＣＡＧＴＡＡＣＣＧＧＧ ＣＡＴ
ＧＴＴＣＡＴＣＧＣＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＧＴＴＴＣＡ
ＴＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＡＣＣＣＣＣＡＴＧＡＡ ＣＡ
ＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＣＧＣＣＣＴＴ
ＡＡＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＧ ＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＣ
ＴＧＴＧＡＡＴＣＧ ＣＴＴＣＡＣＧＡＣＣＣＧＣＧＴ
ＴＴＣＧＧ ＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＧＧＴＣＡＣＡ
Ｇ ＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡ第 １ ＣＣＣＴＴＡＣＡＣＧ ＧＡＧＧＣＡＴＣＡＡ ＧＴＧ
ＡＣＣＡＡＡＣＡＴＧＧＣＣＣＧＣＴ ＴＴＡＴＣＡＧ
ＡＡＧ ＣＣＡＧＡＣＡＴＴＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧ
ＣＧＧＡＴＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＴＡＣＧＣＴＧ
ＡＴＧＡ ＧＣＴＴＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＧ
ＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴ ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡ ＧＣＴ
ＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧ
ＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧ ＧＧ
ＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴ図 の
３ −−スＡ電− ＣＡＣＧＴＡＧＣＧＡ ＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧ“ＡＧＡ
ＴＴＧＴＡＣＴ ＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣ１ＧＴＡＡＧＧ
ＡＧＡＡ ＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴ ＋ＣＴＣＧＣＴＧＣ
ＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣ１ＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴ Ａ
ＣＧＧＴＴＡＴＣＣｒＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡ ＡＡＧＧ
ＣＣＡＧＣＡΔＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴ ＴＴＣＣＡＴＡ
ＧＧＣ’ＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧ ＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧ
１７Ｒ１ｎ ７Ｒ７ｎ 丁ＡＴＡＣＴＧＧＣＴ ＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧ Ｇ
ＣＡＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴ ＧＴＧＡＡ
ＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴ
ＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴ ＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡ：ｌ；
ＧＣＴＧＣＧＧＣＧ ＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡ ＧＣＴＣ
ＡＣＴＣＡＡへＣＡＧＡＡＴＣＡＧ ＧＧＧＡＴＡＡ
ＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣ蛎ＡＧＧＣＣＡＧＧ ＡＡ
ＣＣＧＴＡＡＡＡ ＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴ丁ＣＣＧＣＣ
ＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴ ＣＡＣＡＡＡＡＡＴ
Ｃ：ＧＡＡＡＣＣＣＧＡ ＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡ ＡＡ
ＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧ
ＣＴＣ１ＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡ ＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧ
（ＣＴＣＡＡＴＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧ“ＡＡ
ＧＣＴＧＧＧＣＴ ＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡ）ＡＴＣＣＧ
ＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧノＣＡＣＴＧＧＣＡＧ
ＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴノＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧ ＡＧ
ＴＴＣＴＴＧＡＡ （第 ｌ こＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣ
ＣＴＧＣＣ：ＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣ
ＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴｒＡＴＣＴＣＡＧＴＴ ＣＧＧＴ
ＧＴＡＧＧＴ ＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣ〜ＣＣＣＣＣＣＧ
ＴＴ ＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴ〜Ｇ
ＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴ
ＣＧＣ〜ＡＣＡＧＧＡＴＴＡ ＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧ
ＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣ３ＴＧＧＴＧＧＣＣＴ ＡＡＣＴ
ＡＣＧＧＣＴ ＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧ図 の ４ ＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧ ＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＴＴＴＴ
ＴＴＧＴＴＴ ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＣＣＴＴ
ＴＧ ＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧ Ｇ
ＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡ ＡＴＴＡ
ＡＡＡＡ丁ＧＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧ ＴＣＴＧＡＣＡＧ
ＴＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧ ＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＡ
ＧＡＴＡＡＣＴＡ ＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡ’ＩＦ、１ｎ
”（６７ｎＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡ
ＣＣＡＣＣＧＣ丁ＧＧ ＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＴ
ＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧ ＧＡＴＣＴＣＡ
ＡＧＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡ ＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧ
ＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴ ＣＡＡＡ
ＡＡＧＧＡＴ ＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡ
ＡＡ ＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡ ＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＡ
ＣＣＡＡＴＧＣＴＴ ＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧ ＧＣＡＣ
ＣＴＡＴＣＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧ ＴＴＧＣＣＴＧＡ
ＣＴ ＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡ Ｔ
ＣＴＧＧＣＣＣＣＡ ＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴ”（６’（
ｎ ”（６４（１Ｆ６５（１ＧＡＴＡＣＣ
ＧＣＧＡ ＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧ
ＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴ ＣＴＡ
ＴＴＡＡＴＴＧＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴ ＴＴＧＣＧＣＡ
ＡＣＧＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＡＧ
ＧＣＧＡＧＴＴＡ ＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣ
ＴＣＣＧ ＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡ第 １ ＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡ ＧＣＡＡ
ＴＡＡＡＣＣＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧ ＧＴＣＣＴＧＣＡ
ＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡ ＧＣ
ＴＡＧＡＧＴＡＡ ＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＧＡＡＧＴＡ
ＡＧＴＴ ＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧ ＴＴＡＴＣＡＣＴＣ
Ａ図 の ５ ＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧ ＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡ ＧＴＡ
ＣＴＣＡＡＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡ ＣＣＧＡＧＴＴ
ＧＣＴ ＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧ
ＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡ ＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＧＧＧＣ
ＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴ ＣＴＴＡＣＣＧＣ
ＴＧＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴ ＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴ Ｇ
ＡＴＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧ ＡＧＣＡＡ
ＡＡＡＣＡ ＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡ
ＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧ ＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＴＴＧ
ＡＡＧＣＡＴＴ ＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴ ＡＴＴＧＴＣ
ＴＣＡＴ７１４１（１ｌＬ４．）（１４４’ｔｎＡＡＧ
ＴＣＡＴＴＣＴ ＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＧＴＣＡＡＣＡ
ＣＧＧ ＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡ
ＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡ ＧＴＴＣ
ＧＡＴＧＴＡＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴ ＴＴＣＡＣＣＡＧ
ＣＧＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡ ＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＣＴ
ＣＴＴＣＣＴＴＴ ＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＧＡＧＣＧＧ
ＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡ
ＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡ ＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣ
ＣＡＣＣＴＧ ＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡ ＡＡＣＣＡＴＴ
ＡＴＴＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴ ＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣ
ＣＴＴＴＣＧＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ ＡＡＴＴＣ
ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＧＴＴＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴ 第 １ 図 の ＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴ ＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＴＣＡ
ＴＧＡＣＡＴ ＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＴＣＡＡＧＡＡＴ
ＴＡ ＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡ Ｔ
ＡＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡｎＴＣＣＣ
ＧＧＡＴＴＡＣＧＧ１ｙＡｓｐＴｈｒＨｉｓＰｈｅＰｒ
ｏＡｓｐＴｙｒＧＣＡＧＡＴＣＴＡＡ １ｎ１１ｅ 第 ２図 手続補正書 昭和６３年１１月３０日 一°。
Claims (1)
- １、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
ことができる組換えプラスミドｐＴＰ７０−１を利用し
、トリメトプリム耐性を与えるジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子の３’末端側に遺伝暗号の読み取り枠を合わせて異
種遺伝子を導入し、組換えプラスミドを作成し、作成し
た組換えプラスミドを大腸菌に導入し、大腸菌において
ジヒドロ葉酸還元酵素のカルボキシ末端側に異種遺伝子
産物が融合したタンパク質を作らせることを特徴とする
融合タンパク質の作成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62302153A JPH01144992A (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | 融合タンパク質の作成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62302153A JPH01144992A (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | 融合タンパク質の作成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01144992A true JPH01144992A (ja) | 1989-06-07 |
| JPH0349559B2 JPH0349559B2 (ja) | 1991-07-29 |
Family
ID=17905547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62302153A Granted JPH01144992A (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | 融合タンパク質の作成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01144992A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000071688A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 126 and 127 |
| WO2000071689A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 127 and 128 |
| WO2000071691A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 125 and 126 |
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| JPS6269990A (ja) * | 1985-09-24 | 1987-03-31 | Agency Of Ind Science & Technol | 発現ベクタ−ｐＴＰ６４−１ |
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| WO2000071689A1 (en) | 1999-05-20 | 2000-11-30 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 127 and 128 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0349559B2 (ja) | 1991-07-29 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |