JPS6274294A - Ｌ−スレオニンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、発酵液からＬ−スレオニンを取得する際に、
そこに含まれる夾雑不純物を除去して精製をよシ簡略な
工程で且つ効果的に行うために、Ｌ−スレオニン発酵液
を簡略な直晶法によって処理するＬ−スレオニンのｆｉ
ｆｆｍ方法に関するものである。

Ｌ−スレオニンは人体又は家畜の栄養源として有用であ
る。これらに用いるＬ−スレオニンは、品質が良くしか
も安価なものが要望されている。

（従来の技術） Ｌ−スレオニンの製造法としては化学合成法、発酵法等
が行われている。化学合成法とはアロ体の分離除去、ラ
セミ体の光学分割が必要である。

発酵法は発溝液中に多量の夾雑物を含んでいるために陽
イオン交換樹脂を用いてＬ−スレオニンを分離精製する
など煩雑な工程が必要である。

従来は、Ｌ−スレオニン発酵液中に含まれる夾雑物とし
て、Ｌ−スレオニンに対する他のアミノ酸の比率（以下
０−ＡＡ／Ｌ−Ｔｈ　ｒと記す。）が２Ｃ１以上の組成
のものが多く通常は３０〜１００％であシ、且つアミノ
酸以外の低分子化合物、例えば塩類、糖類、有機酸、色
素等が多く、これらによって晶析阻害、結晶分離性低下
、品質低下等をきたしていた。従って、高純度のＬ−ス
レオニン結晶を得るためには陽イオン交換樹脂処理を行
ない、これらの物質を除去する必要があった。この陽イ
オン交換樹脂処理によシ夾雑物を除去する工程は、煩雑
且つ大量のエネルギー消費を生じ、更に廃液量も増大す
るという欠点を有していた。

（本発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は陽イオン交換樹脂処
理工程を除いた直晶法によシ高純度のＬ−スレオニン結
晶を得ることにある。

（問題点を解決するだめの手段） 本発明者らは上述の問題点を解決するために徨々研究を
行りた結果、３　ｆ／ｄ１以上のＬ−スレオニンを含有
し、かつ該発酵液中に含まれている夾雑物が少ない発酵
液を用いることによシ陽イオン交換樹脂処理工程を除い
た直晶法によシ高純度のＬ−スレオニン結晶を得ること
ができることを見い出した。本発明はこの知見に基づい
てなされたものである。

即ち、本発明は、３　ｆ／ｄｔ以上のＬ−スレオニン生
産能を有し、０−ＡＡ／　Ｌ−Ｔｈｒが２０％以下であ
る微生物をＬ−スレオニ／生産培地に接種、培養し、こ
の培地中にＬ−スレオニ／を生成、蓄積せしめたのちに
、この培地中に存在する菌体及び蛋白を除去し、この菌
体及び蛋白が除去された液を濃縮及び／又は冷却し、Ｌ
−スレオニン結晶を得ることを特徴とするＬ−スレオニ
ンの精製方法である。

本発明を更に詳しく説明すると以下の通りである。

本発明において使用されるＬ−スレオニン生産能を有す
る微生物としてはエシェリヒア属のα−アミノ−β−ヒ
ドロキシ吉草酸（以下、ｒＡＨＶＪ、！：記す）耐性、
ＡＨＶ耐性及びインロイシン要求性変異株（特公昭４５
−２６７０９）から改良されたエシェリヒア属のＬ−ス
レオニン生合成に関与する遺伝子が組み込まれているグ
ラスミドｐＢＲ３２２を含有するＬ−スレオニン生産菌
（特開昭５５−１３１３９７）がある。

これらの本発明で使用する微生物は培養液中にＬ−スレ
オニンを３　ｙ／ｄｉ以上生成する能力を有する。Ｌ−
スレオニン発酵液中の０−ＡＡ／　Ｌ−Ｔｈｒが比率で
２０チ以下のＬ−スレオニン発酵液をいう。

又、Ｌ−スレオニ／生産菌を培養する培地は特に従来の
方法と変らない。すなわち、炭素源として各種の糖、有
機酸等、窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水
、アンモニウム塩、その他が使用できる。炭素源、窒素
源は、一度に添加するか、或いは培養中に数回に亘シ、
経時的に添加するかいずれでもよい。

この他にリン酸イオン、鉄イオン、マグネシウムイオン
、カリイオン等の無機イオンが適宜培地に添加される。

更にビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素が必要であ
れば使用される。

培養の酸素供給条件は溶存酸素分圧で０．０１ａｔｍ以
上０．１７　ａｔｍ以下の範囲で行われ、培養の間、培
地−を５ないし８の範囲に、温度を２７ないし３７℃の
範囲に調節すれば最も望ましい結果が得られる。

かくして１ないし５日間も培養を続ければ、Ｌ−スレオ
ニンが高い収率で生産される。培地中に生成、蓄積され
たＬ−スレオニンを採取する方法は通常の方法でよい。

菌体の除去方法としては、遠心分離、加圧濾過、減圧−
過、膜による濾過例えば精密濾過、限外濾過等その他公
知の方法でよい。除菌する液の−は特に規定しないが、
好ましくは３〜７がよい。

蛋白の除去方法としては、膜による濾過例えば精密濾過
、限外濾過、逆浸透濾過等、或いは予め加熱及び／又は
凝集剤（界面活性剤等）を用いて蛋白を凝集させたのち
前述の菌体の除去方法を用いてもよい。

またこれらの公知方法を組み合せて菌体と蛋白を同時に
除去してもよい。この菌体及び蛋白が除去された液は、
従来の発酵液を同様に処理した液に比べて０−ＡＡ　／
　Ｌ−Ｔｈｒ及び塩類、糖類、有機酸、色素等の夾雑物
の含量が極めて少ない。

濃縮方法については特に問わない。例えば、加熱による
減圧濃縮、冷凍濃縮、逆浸透膜濃縮、或いはこれら単独
又は組み合せで濃縮と晶析を回分又は連続で行りてもよ
い。

冷却方法は特に問わないができるだけ固液分離性の良い
結晶を得ること及び晶析率を上げることなどの点に留意
して、濃縮度と冷却温度、冷却速度等を決めればよい。

また、濃縮と冷却を組み合せて結晶を分離した母液を循
環してもよい。

（発明の効果） このように本発明の方法に従って得られたＬ−スレオニ
ンは高純度のＬ−スレオニンである。又本発明の方法に
従えば極めて収率よくＬ−スレオニンを取得できる。

即ち、従来の発酵液を本発明の方法で行なうと、Ｌ−ス
レオニン含ｆｋｇ０％以上の純度を得るためには収率は
５０〜７０３であった。

しかるに、本発明で使用する発酵液の場合には、収率８
０％以上、通常８０〜９０％でＬ−スレオニン含量９０
％以上のＬ−スレオニンを取得することができる。

以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ 第１表に示した種培養培地１．２１を３１容ミニジヤー
に入れて１１５℃にて１５分間加圧殺菌した。これにエ
シェリヒアコリＡＪ　１１３３４　（ＦＥＲＭ　Ｐ−４
９００”；　（特開昭５５−１３１３９７　）よシ得た
Ｌ−スレオニン生合成に関与する遺伝子が組み込まれて
いるグラスミドｐＢＲ３２２を含有するＬ−スレオニン
生産菌を接種して３１．５℃で２４時間通気１／３Ｎ”
ｉ’ｍ　％撹拌数１００　Ｏｒｐｍ、ｐＪ（７，０で培
養して種培養液を得た。

次に２０１容ジヤー７アーメンターに種培養液を接種し
た後の最終濃度が第１表に示した培地組成になるように
調製した生産培地４．８１を入れて１１５℃にて１５分
間殺菌して培地を得た。これに種培養液１．２１を接種
して３１．５℃にて通気量１／３　ＶＶｍ　、撹拌数３
５　Ｏｒｐｍ　、　ｐＨ６，０で７２時間培葉上行った
。

なお、培養途中にグルコース３００　ｆ／ｌ　、硫安１
００　ｆ／ｌの培地を予め１１５℃にて１５分間加圧殺
菌して調製した培地を培養液中のグルコース濃度が３　
ｆ／ｄ７！を超えないように添加した。

析計にて測定しだ所Ｏ−λ〜’Ｌ−ＴｈｒＴチであった
。

第　　１　　表 培地成分　　　　　　　種培養培地　　　　生産培地グ
ルコース　　　　３０　　　ｆ／ｌ　　３０　　　φ流
　　　　安　　　　　　１０　　　　　ＩＩ　　　　１
０　　　　　〃リン酸−力す　　　　　　　１　　　　
〃　　　　１　　　　〃１酸マグネシウム　　　　　１
　　　　〃　　　　１　　　　〃酵母エキス　　　　　
２．５１ リボ核酸　　　　２　　〃　　２　　〃Ｌ−プロリン　
　　　　　　　０．４５　　　ｔｔ　　　　　Ｏ，９０
ｐＬ−インロイシン　　　　　０．１０　　　〃０．２
０　　　／ＦＬ、　＋メチオニン　　　　　　０．１０
　　１　　　　０．２０　　　＃Ｌ−アスパラギン酸　
　　　０．１０　　　／／　　　　０．２０　　　〃チ
アミン塩酸塩　　　　　　１　　　■／１１　　　１　
　　　ｒｎＶｌ硫酸第一鉄　　　　１０　　　　／／　
　　１０　　　　／／硫酸マンがン　　　　　　１０　
　　　　ＩＩ　　　　１０　　　　　＃この発酵液５１
を遠心分離して上澄液を採取し丸。この上澄液に１０チ
塩化ベンザルコニウムを５ｄ加え８０℃、３０分加熱し
たのち、室温まで冷却してから活性炭２０Ｆを加えて３
０分撹拌を行いこれを濾過した。この濾過液を減圧下で
濃縮し、全重量が５５０Ｆになるまで濃縮晶析を行った
。この濃縮晶泥を６０℃から５℃まで１夜かけて冷却晶
析したのち遠心−逸機で分離し少量の水で洗浄した。こ
の結晶を８０℃、３時間減圧乾燥してＬ−スレオニン結
晶２１３ｆを得た。このＬ−スレオニン結晶はＬ−スレ
オニン含ｆ１９９．７％であシ、収率は８８．５チであ
った。

実施例２ 一 またｅＡＡを日立製８３５型アミノ酸自動分析計にて測
定した所０−ＡＡ／Ｌ　−Ｔｈｒ　１８　％であった。

この発酵液５１を遠心分離して得た上澄液を以下実権利
１と同様に処理した。但しａ縮晶泥の全重量は３９０ノ
、冷却温度は１０℃までとした。

得られたＬ−スレオニン結晶は１２７２であった。この
Ｌ−スＶオニン含ｉ９９．２％であり、収率は８１．３
俤であった。

比較例１ 第２表に示しだ種培養培地１．２１を３１容ミニツヤ−
に入れて１１５℃にて１５分間加圧殺劇しブこ。これに
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメン、タムＬ−スレ
オニン生産菌ＡＪ１１１７８　（ＦＥ替−４１８０）を
接種して３１．５℃で２４時間通気１／２ｗｍ、撹拌数
１１００Ｏｒｐ　、　ｐＪ（７，０で培養して種培養液
を得た。

次に２０１容ジヤー７アーメンターに種培養液を接押し
た後の最終濃度が第１表に示した培地組成になるように
調製した培地４，８１を入れて１１５℃にて１５分間殺
菌して培地を得た。これに種培養液１．２１を接種して
３１．５℃にて通気量１／２’／Ｖｍ　、撹拌数３５　
Ｏｒｐｍ　、　ｐＨ７，０で培養を開始した。培養は７
２時間おこなった。

培養終了後に培養液中に生成しＬ−スレオニン析計にて
測定した所０−ＡＡ／Ｌ−Ｔｈｒ　９３％であった。

第　　２　　表 主培種 成　分　　　　　種培地　　ｉモ千貯９ＫＨ２ＰＯ４（
ｆ／１ｉｔｅｒ）　　　１．５　　　　　１．５Ｍｇ５
ｏ４・７ｕ２ｏ　　（Ｐ／１１ｔｅｒ）　　　０．４　
　　　　０．４Ｆ＠５ｏ４４Ｈ２０（ｆ／１ｉｔｅｒ）
　　　ｏ、ｏ　１　　　　　０．０　ｌＭｎＳＯ４４Ｈ
２０（ｆ／１ｉｔｅｒ）　　　０．０１　　　　　０．
０１（ＮＨ４）２Ｓｏ４（ｆ／１ｉｔｅｒ）　　　　　
　　　　３０尿　　素　　　　　　　　　　　　　　　
３Ｌ−インロイシン（ｆ／１１ｔｓｒ）　　　　　　　
　　　　　　０．３ビオチン　　（＃／ｌｉｔ＠ｒ）　
２００　　　　　１００サイアミン塩酸塩（ｌｉｔ／ｌ
　１ｔｅｒ）　　３００　　　　　　１０００ａ窒素含
量　６４ｔ／１ この発酵液５１を遠心分離して得た上澄液を以下実施例
１と同様に処理した。但し濃縮晶泥の全重量は５８０り
、冷却温度は２０℃までとした。

得られたＬ−スレオニン結晶は８４ｆでちった。

このＬ−スレオニン結晶１ｄ　Ｌ−スレオニン含量９５
．３％であシ、収率は５３．４チでありた。

比較例２ 比較例１と同様に調整した種培地に、Ｂｒ＋ｅｖｉ−ｂ
ｓｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｔａｖｕｍ　＆　２２４７　（Ａ
ＴＣＣ１４０６７）から訪導して得たＴｈｒ生産菌ＡＪ
　１１１７３　（ＦＥＲＭＰ　４１６５　）会接種して
種培養液を得た。

次に２０１容ジャーファーメンタ−に種培養液を接種し
た後の最終濃度が第３表に示した培地組成になるように
調整した培地４．８１を入れて１１５℃にて１５分間殺
菌して培地を得た。これに種培養液１．２１を接種して
３１．５℃にて通気量１／２ＶＶｅｘ　、撹拌数３５０
　ｒｐｍ　、　ｐＨ７，７で培養を開始した。

なお培巷途中に酢酸濃度７００　ｔ／ｌの培地を予め１
１５℃にて１５分加熱殺菌して調整した培地を、基質が
不足した時点で０．３ｇ／ｄｌ〜０．８ｆ／ｄｌ　に保
つように随時添加して７２時間培量した・培養終了後の
Ｌ　−Ｔｈｒの生成量は４．２ｆ／ｄｌでありた。

副生アミノ酸を日立製８３５型アミノ酸自動分析計にて
測定した所０−ＡＡ／　Ｌ−Ｔｈｒ　３３チであったり
第　　３　　表 成　　分　　　　　　　　　　　　　　濃　　度ＫＨ２
ＰＯ４３（ｒ／ｌｉｔｅｒ） ＭｇＳＯ４４Ｈ２００，４（Ｐ／１ｉｔａｒ）Ｆ＠５Ｏ
４４Ｈ２００，０１（Ｐ／ｌｉｔｅｒ）ＭｎＳＯ４４Ｈ
２００，０１（Ｐ／１ｉｔｅｒ）七、１粟−ｒ７　　　
　　　　　　　　　５　　　　Ｃ９／目ｔａｒ）ＣＩ（
ｓｃＯＯＮｍ　　　　４．１　（ｆ／１１ｔｅｒ）ＣＨ
５ＣＯＯＮＨ４４（ｒ／１ｉｔｅｒ）（ＮＨ４）２ＳＯ
４１０（ｔ／／１ｉｔｅｒ）Ｌ−インロイシン　　　　
　　０．５　　　（ｆ／１ｉｔｅｒ）ビオチン　　　　
　　　　５０　　（μｆ／Ｘｉｔｅｒ）サイアミン塩酸
塩　　　　５ＧＯＯ（）ｙ／１１　ｔｏ　ｒ）この発酵
液５１を遠心分離して得た上澄液を以下実施例１と同様
に処理した。但し濃縮晶泥の全重量は６５０？、冷却已
度は１０℃までとした。

得られたＬ−スレオニン結晶は１５０？であった。この
Ｌ−スレオニンｊ吉晶はＬ−スレオニン含量９８．７チ
であり、収率は７０．５チであった。

出　願　人　味の素株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ３ｇ／ｄｌ以上のＬ−スレオニン生産能を有し、Ｌ−ス
   レオニンに対するＬ−スレオニン以外のＬ−アミノ酸の
   比率が２０％以下である微生物をＬ−スレオニン生産培
   地に接種、培養し、この培地中にＬ−スレオニンを生成
   、蓄積せしめたのちに、この培地中に存在する菌体及び
   蛋白を除去し、この菌体及び蛋白が除去された液を濃縮
   及び／又は冷却し、Ｌ−スレオニン結晶を得ることを特
   徴とするＬ−スレオニンの精製方法。