JPH0191790A - 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は発酵法によるＬ−フェニルアラニンの製造法に
閃する。

〈従来の技術〉 従来、シトロバクタ−属の微生物を用いるＬ−フェニル
アラニンの製造法としては、桂皮酸とアンモニアを原料
とする酵素法（特開昭６１−２７１９９８号公報）など
が知られている。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、従来の方法は、高価な前駆体を使用する
ものであり、経済的に極めて不利な方法であった。

〈問題点を解決するための手段および作用〉そこで、本
発明者らは、前記問題点を解決すべく鋭意研究の結果、
発酵法によってＬ−フェニルアラニンが著量蓄積するこ
とを見い出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明はシトロバクタ−属に属し、かつレー
フェニルアラニン生産能を有する微生物を、液体培地中
で好気的に培養してＬ−フェニルアラニンを培養液中に
生成・蓄積せしめ、該培養液よりＬ−フェニルアラニン
を採取することを特徴とする発酵法によるし−フェニル
アラニンの製造法である。

シトロバクタ−属に属する微生物が発酵法によりＬ−フ
ェニルアラニンを著量に生成・蓄積せしめ得ることはこ
れまで全く知られていない。

次に本発明の詳細な説明する。

本発明で用いられる微生物はシトロバクタ−属に属し、
かつし−フェニルアラニン生産能を有する微生物であれ
ば特に限定されない、好ましくは、シトロバクタ−属に
属し、フェニルアラニン代謝拮抗物質に耐性を有する変
異株を用いる。フェニルアラニン代謝拮抗物質としては
、例えば、Ｏ−フルオロフェニルアラニン、β−チエニ
ルアラニンなどが挙げられる。

本発明で用いられる微生物の代表的なものとしては例え
ば以下のものがある。シトロバクタ−・フロインディー
　（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＯＦ
ＰＲ７２（微工研菌寄第９５３７号）。

この菌株はシトロバクタ−・フロインディーＩＦ０１３
５４５より誘導された変異株で０−フルオロフェニルア
ラニンに耐性な変異株である。

変異株の誘導は通常の変異株処理法によって比較的容易
に行うことができる。

すなわち、フェニルアラニン代謝拮抗物質に耐性を有す
る変異株は、親株を紫外線照射するか、あるいは変異誘
発剤（例えばＮ−メチル−Ｎ゛−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン、エチルメタンスルホン酸など）で処理した
のち、親株が生育できないような量のフェニルアラニン
代謝拮抗物質を含む培地で生育できるような菌株を採取
すればよい。ここで、フェニルアラニン代謝拮抗物質に
耐性を有する変異株とは、その親株より強い耐性を有す
る菌株のことであり、好ましくは、親株の２４時間後の
相対生育度が４０％以下になるようなフェニルアラニン
代謝拮抗物質を含む培地で培養した場合の相対生育度が
５０％以上を示すようなものをいう。

本発明におけるＬ−フェニルアラニン生産用の液体培地
は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその
他の有機微量成分を含有する通常の液体培地である。炭
素源としては、グルコース、フラクトースやでん粉およ
びセルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、フマール
酸、クエン酸、コハク酸などのごとき有機酸、グリセロ
ールのごとごとアルコール■などを２〜１５％、窒素源
として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムのごとき無機アンモニウム塩
、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを０．５〜
４．０％、これらの他にリン酸カリウム、硫酸マグネシ
ウム、硫酸第１鉄７水和物、塩化マンガン４水和物など
が少量添加される。

培養は好気的条件で行う。培養の間、液体培地のｐＨは
５から９に、温度は２４〜３７℃に調節し、４８〜１２
０時間振盪または通気培養すれば好ましい結果が得られ
る。

培養液からフェニルアラニンを採取する方法は常法に従
って行えばよく、培養液から菌体を分離除去したのち、
濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法
などにより採取される。

〈実施例〉 以下実施例により、本発明を具体的に説明する。

実験例１ （Ｏ−フルオロフェニルアラニン耐性変異株の取得） シトロバクタ−・７０インデイ−ＩＦＯ１３５４５の菌
体に通常の方法でＮ−メチル−Ｎ−一二トローＮ−二ト
ロソグアニジン処理（１５０μｇ　／　ｍｌ、３７℃、
１５分）したのち、この細胞を５−フルオロ−Ｄ、Ｌ−
フェニルアラニン０．１ｇ／ｊを添加した寒天平板培地
（グルコース０．２％、硫安０．１％、リン酸第−カリ
ウム０．２％、リン酸第二カリウム０．７％、硫酸マグ
ネシウム７水和物０．０１％、クエン酸ナトリウム０．
０５％を含む合成培地）に塗布した０次に３７℃で４〜
６日間培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離して、
Ｏ−フルオロフェニルアラニン耐性変異株シトロバクタ
−・フロインディー０ＦＰＲ７２（微工研菌寄第９５３
７号）を取得した。

実験例２ （Ｏ−フルオロフェニルアラニン耐性変異株の耐性度） 下記第１表に示す各菌株を液体り培地（トルグトン１％
、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、をｐ
８７．５）用いて３０℃で６時間振盪培養し、生育した
菌体を集菌し生理食塩水でよく洗浄した。この菌体懸濁
液を、０−フルオロフェニルアラニン０．０．５．５ｍ
Ｍの濃度でそれぞれ含む最少培地（培地組成ニゲルコー
ス０．２％、硫安０．１％、リン酸第１カリウム０．２
％、リン酸第２カリウム０．７％、硫酸マグネシウム７
水和物０．０１％、クエン酸ナトリウム０．０５％）５
ｍ目こ植菌して、３０℃で１４時間培養し、各菌株の生
育度を調べた。その結果は第１表に示すとおりである。

本発明方法で使用する５−フルオロフェニルアラニン耐
性変異株シトロバクタ−・フロインディー０ＦＰＲ７２
は、親株のシトロバクタ−・フロインディーＩＦ０１３
５４５と比較して、０−フルオロフェニルアラニンによ
って生育が阻害されず、０−フルオロフェニルアラニン
に対する耐性を獲得していることが明らがである。

第　　　１　　　表 ※）培養液の６６０ｎｍにおける濁度を測定し、各菌株
のＯ−フルオロフェニルアラニンを添加していない培養
液の濁度を１００％として表わした。

実施例１ 下記の組成の発酵用培地４０ｍ１をＩＪ！容三角フラス
コに入れ、１１５℃で１５分蒸気滅菌した。これに第２
表に示す各菌株−白金耳植菌し、３０℃で９６時間回転
振盪培養した。

発酵用培地組成 グルコース　　　　　　　　　１０％ （ＮＨ４）２３０４　　　　　２．５％ＫＨ２ＰＯ４０
，０４％ Ｍｇ５Ｏ，・７　Ｈ２００，０４％ Ｆｅ　３０４　・７Ｈ２０１ｏｐｐｌ ＭｎＣｊ　４−４Ｈ２０７１１１１１１ＣａＣＯ３４％ 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去した液中のＬ
−フェニルアラニン濃度をロイコノストック・メセンテ
ロイデスＡＴＣＣ８０４２を用いる微生物定量法で定量
したところ第２表に示すような結果を得た。

第　　　２　　　表 また、発酵終了後の液を強酸性陽イオン交換樹脂″ダ°
イヤイオン”５Ｋ−１０４（Ｈ＋型）（三菱化成社製）
におとし、Ｌ−フェニルアラニンを吸着させ、該樹脂を
水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出した溶出液を濃縮
し、活性炭処理して脱色し冷却後、培養液１１あたり０
．９３「のし−フェニルアラニンの結晶を得た。

〈発明の効果〉 本発明の方法によれば、高価な前駆体を使用することな
く、かつＬ−フェニルアラニンを著量蓄積せしめること
ができるため、工業的に極めて有利である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属に
   属し、かつＬ−フェニルアラニン生産能を有する微生物
   を、液体培地中で好気的に培養してＬ−フェニルアラニ
   ンを培養液中に生成・蓄積せしめ、該培養液よりＬ−フ
   ェニルアラニンを採取することを特徴とする発酵法によ
   るＬ−フェニルアラニンの製造法。
2. （２）微生物がフェニルアラニン代謝拮抗物質に耐性を
   有する変異株である特許請求の範囲第１項記載の発酵法
   によるＬ−フェニルアラニンの製造法。