JPH0739385A - Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 - Google Patents
Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法Info
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- JPH0739385A JPH0739385A JP5190583A JP19058393A JPH0739385A JP H0739385 A JPH0739385 A JP H0739385A JP 5190583 A JP5190583 A JP 5190583A JP 19058393 A JP19058393 A JP 19058393A JP H0739385 A JPH0739385 A JP H0739385A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 β−チロシナーゼ含有菌体またはその処理物
をカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオン、ま
たはカテコール及びＬ−セリンに接触反応させてＬ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを製造する方法
において、反応液中にＬ−３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニンの無水結晶を存在せしめた状態で２５℃より
低い温度にて反応を継続し、生成するＬ−３，４−ジヒ
ドロキシフェニルアラニンを無水結晶として反応液中に
析出せしめ、これを採取する。 【効果】 本発明の方法によれば、容易な手段により純
度の高いＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの
粗結晶を高い回収率で得ることができる。
をカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオン、ま
たはカテコール及びＬ−セリンに接触反応させてＬ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを製造する方法
において、反応液中にＬ−３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニンの無水結晶を存在せしめた状態で２５℃より
低い温度にて反応を継続し、生成するＬ−３，４−ジヒ
ドロキシフェニルアラニンを無水結晶として反応液中に
析出せしめ、これを採取する。 【効果】 本発明の方法によれば、容易な手段により純
度の高いＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの
粗結晶を高い回収率で得ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＬ−３，４−ジヒドロキ
シフェニルアラニン（以下Ｌ−ＤＯＰＡと略す）の製造
方法に関する。Ｌ−ＤＯＰＡはパーキンソン氏病の治療
薬として多用されている。
シフェニルアラニン（以下Ｌ−ＤＯＰＡと略す）の製造
方法に関する。Ｌ−ＤＯＰＡはパーキンソン氏病の治療
薬として多用されている。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−ＤＯＰＡの製造方法として
は、バニリンを原料とする合成法が知られている。他
方、微生物の有する酵素系を用いたＬ−ＤＯＰＡの製造
法も検討されており、例えば、β−チロシナーゼを利用
してカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンか
ら製造する方法（特公昭４８−３４２３７号公報）、同
じくβ−チロシナーゼを利用してカテコール及びＬ−セ
リンその他のアミノ酸類から製造する方法（特公昭４７
−２２２７５号公報）、アンモニアリアーゼを利用して
ジヒドロキシ桂皮酸及びアンモニウムイオンから製造す
る方法（特公昭６２−２４０７６号公報）、オキシゲナ
ーゼを利用してＬ−フェニルアラニンもしくはＬ−チロ
シンから製造する方法（特公昭４７−１９０３３号公
報、同４７−１４９１５号公報）、トランスアミナーゼ
を利用して３，４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸か
ら製造する方法（特公昭５８−１８４７５号公報）等が
知られている。
は、バニリンを原料とする合成法が知られている。他
方、微生物の有する酵素系を用いたＬ−ＤＯＰＡの製造
法も検討されており、例えば、β−チロシナーゼを利用
してカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンか
ら製造する方法（特公昭４８−３４２３７号公報）、同
じくβ−チロシナーゼを利用してカテコール及びＬ−セ
リンその他のアミノ酸類から製造する方法（特公昭４７
−２２２７５号公報）、アンモニアリアーゼを利用して
ジヒドロキシ桂皮酸及びアンモニウムイオンから製造す
る方法（特公昭６２−２４０７６号公報）、オキシゲナ
ーゼを利用してＬ−フェニルアラニンもしくはＬ−チロ
シンから製造する方法（特公昭４７−１９０３３号公
報、同４７−１４９１５号公報）、トランスアミナーゼ
を利用して３，４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸か
ら製造する方法（特公昭５８−１８４７５号公報）等が
知られている。
【０００３】一方、Ｌ−ＤＯＰＡの結晶には一水和物結
晶と無水結晶の２種類が存在することが知られている。
その結晶形状は、一水和物結晶が針状晶であるのに対し
て、無水結晶は正方晶である。Ｌ−ＤＯＰＡの精製方法
として、３０℃以下の低温において不純物を含むＬ−Ｄ
ＯＰＡ水溶液からＬ−ＤＯＰＡを針状晶として晶出さ
せ、これを３０℃以上の温度に加熱して正方晶に転移さ
せて分離する方法が知られている（特公昭４９−４１１
８８号公報）。この方法によれば、Ｌ−ＤＯＰＡを針状
晶として析出させることにより着色物質及び製造工程か
ら随伴する不純物除去が効果的に行われ、さらにこれを
分離した後、正方晶に転移させることにより純粋な形の
ものを得ることができる。
晶と無水結晶の２種類が存在することが知られている。
その結晶形状は、一水和物結晶が針状晶であるのに対し
て、無水結晶は正方晶である。Ｌ−ＤＯＰＡの精製方法
として、３０℃以下の低温において不純物を含むＬ−Ｄ
ＯＰＡ水溶液からＬ−ＤＯＰＡを針状晶として晶出さ
せ、これを３０℃以上の温度に加熱して正方晶に転移さ
せて分離する方法が知られている（特公昭４９−４１１
８８号公報）。この方法によれば、Ｌ−ＤＯＰＡを針状
晶として析出させることにより着色物質及び製造工程か
ら随伴する不純物除去が効果的に行われ、さらにこれを
分離した後、正方晶に転移させることにより純粋な形の
ものを得ることができる。
【０００４】ところで、本発明者らは、β−チロシナー
ゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法を改良しＬ−ＤＯ
ＰＡを極めて高い濃度で生成蓄積せしめることに成功し
た（特開平５−１２３１７７号公報）。この方法によれ
ば、Ｌ−ＤＯＰＡが反応液中に溶解度以上の濃度に生成
蓄積するが、低い温度で反応を行うと析出する結晶は一
水和物結晶であり結晶の分離・回収性に問題があり、ま
た高い温度で反応を行うと析出する結晶は無水結晶であ
るが、副生物の副生が著しいとの問題点があった。
ゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法を改良しＬ−ＤＯ
ＰＡを極めて高い濃度で生成蓄積せしめることに成功し
た（特開平５−１２３１７７号公報）。この方法によれ
ば、Ｌ−ＤＯＰＡが反応液中に溶解度以上の濃度に生成
蓄積するが、低い温度で反応を行うと析出する結晶は一
水和物結晶であり結晶の分離・回収性に問題があり、ま
た高い温度で反応を行うと析出する結晶は無水結晶であ
るが、副生物の副生が著しいとの問題点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物のβ−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方
法をさらに改良することにより、従来から知られている
Ｌ−ＤＯＰＡの各種製造法よりも安価かつ効率的なＬ−
ＤＯＰＡの製造方法を提供することである。
物のβ−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方
法をさらに改良することにより、従来から知られている
Ｌ−ＤＯＰＡの各種製造法よりも安価かつ効率的なＬ−
ＤＯＰＡの製造方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物の
β−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法に
ついて鋭意研究を重ねた結果、反応液中にＬ−ＤＯＰＡ
の無水結晶を存在せしめた状態で２５℃よりも低い温度
にて反応を継続することにより、生成するＬ−ＤＯＰＡ
を無水結晶として反応液中に析出させることができ、こ
の結晶は沈降性に優れ容易に分離・回収することができ
ることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成す
るに至った。
β−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法に
ついて鋭意研究を重ねた結果、反応液中にＬ−ＤＯＰＡ
の無水結晶を存在せしめた状態で２５℃よりも低い温度
にて反応を継続することにより、生成するＬ−ＤＯＰＡ
を無水結晶として反応液中に析出させることができ、こ
の結晶は沈降性に優れ容易に分離・回収することができ
ることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成す
るに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、β−チロシナーゼ含
有菌体またはその処理物をカテコール、ピルビン酸及び
アンモニウムイオン、またはカテコール及びＬ−セリン
に接触反応させてＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニンを製造する方法において、反応液中にＬ−３，４
−ジヒドロキシフェニルアラニンの無水結晶を存在せし
めた状態で２５℃よりも低い温度にて反応を継続し、生
成するＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを無
水結晶として反応液中に析出せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラ
ニンの製造方法を提供するものである。
有菌体またはその処理物をカテコール、ピルビン酸及び
アンモニウムイオン、またはカテコール及びＬ−セリン
に接触反応させてＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニンを製造する方法において、反応液中にＬ−３，４
−ジヒドロキシフェニルアラニンの無水結晶を存在せし
めた状態で２５℃よりも低い温度にて反応を継続し、生
成するＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを無
水結晶として反応液中に析出せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラ
ニンの製造方法を提供するものである。
【０００８】本発明に使用する微生物は、β−チロシナ
ーゼ（チロシンフェノールリアーゼ、ＥＣ４．１．９
９．２）活性を有する微生物であればいずれでも使用で
きるが、具体的に例示するとエルビニア属に属する以下
の菌株が高い活性を有しており好適である。 エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３ エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３４
ーゼ（チロシンフェノールリアーゼ、ＥＣ４．１．９
９．２）活性を有する微生物であればいずれでも使用で
きるが、具体的に例示するとエルビニア属に属する以下
の菌株が高い活性を有しており好適である。 エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３ エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３４
【０００９】さらにこのような微生物に変異処理を施し
たり、あるいは遺伝子組換え技術等により育種すること
によってＬ−ＤＯＰＡ生産能を向上させた微生物も使用
することができる。
たり、あるいは遺伝子組換え技術等により育種すること
によってＬ−ＤＯＰＡ生産能を向上させた微生物も使用
することができる。
【００１０】これらの微生物の菌体を調製するには、炭
素源、窒素源、無機塩類、その他の栄養物質を含有する
培地に培養すればよい。炭素源としては、グリセロー
ル、フマル酸、糖類等が用いられ、また窒素源として
は、硫酸アンモニウム、アミノ酸等が用いられる。無機
塩類としてはリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等が適宜使用される。
その他の栄養物質としては大豆蛋白加水分解物、アミノ
酸類等が挙げられる。なお、β−チロシナーゼは適応酵
素と考えられ、上記微生物を培養する際には、チロシン
又はチロシン代替物質を培地に添加することにより、β
−チロシナーゼ活性の発現が大きくなり好ましい結果が
得られる。また、β−チロシナーゼ活性を高めるために
培地中にビタミンＢ6 類を添加することが有効である。
素源、窒素源、無機塩類、その他の栄養物質を含有する
培地に培養すればよい。炭素源としては、グリセロー
ル、フマル酸、糖類等が用いられ、また窒素源として
は、硫酸アンモニウム、アミノ酸等が用いられる。無機
塩類としてはリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等が適宜使用される。
その他の栄養物質としては大豆蛋白加水分解物、アミノ
酸類等が挙げられる。なお、β−チロシナーゼは適応酵
素と考えられ、上記微生物を培養する際には、チロシン
又はチロシン代替物質を培地に添加することにより、β
−チロシナーゼ活性の発現が大きくなり好ましい結果が
得られる。また、β−チロシナーゼ活性を高めるために
培地中にビタミンＢ6 類を添加することが有効である。
【００１１】培養条件としては、培養温度は１５℃〜４
５℃が適当である。培養ｐＨ及び培養時間については、
微酸性〜微アルカリ性に保ちつつ１０ないし７２時間培
養が行えばよいが、菌の生育が定常期に達した後、ｐＨ
を７．０ないし８．３に制御しつつ６ないし２４時間培
養を続け、培養物を得ることにより、高いβ−チロシナ
ーゼ活性を有する菌体を得ることができる（特開平５−
１２３１７７号公報）。
５℃が適当である。培養ｐＨ及び培養時間については、
微酸性〜微アルカリ性に保ちつつ１０ないし７２時間培
養が行えばよいが、菌の生育が定常期に達した後、ｐＨ
を７．０ないし８．３に制御しつつ６ないし２４時間培
養を続け、培養物を得ることにより、高いβ−チロシナ
ーゼ活性を有する菌体を得ることができる（特開平５−
１２３１７７号公報）。
【００１２】β−チロシナーゼ含有菌体をカテコール、
ピルビン酸及びアンモニウムイオン、またはカテコール
及びＬ−セリンに接触反応させる反応においては、かく
して得られる培養物をそのまま反応に用いてもよく、培
養物から分離・回収した微生物菌体を使用してもよい。
また、微生物菌体の処理物として、菌体摩砕物、アセト
ン処理菌体、固定化菌体、菌体抽出物もしくはこれから
精製して得られるβ−チロシナーゼを使用することもで
きる。
ピルビン酸及びアンモニウムイオン、またはカテコール
及びＬ−セリンに接触反応させる反応においては、かく
して得られる培養物をそのまま反応に用いてもよく、培
養物から分離・回収した微生物菌体を使用してもよい。
また、微生物菌体の処理物として、菌体摩砕物、アセト
ン処理菌体、固定化菌体、菌体抽出物もしくはこれから
精製して得られるβ−チロシナーゼを使用することもで
きる。
【００１３】本発明においては、上記反応において、反
応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在せしめた状態で
２５℃よりも低い温度にて反応を継続し、生成するＬ−
ＤＯＰＡを無水結晶として反応液中に析出せしめ、これ
を採取する。
応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在せしめた状態で
２５℃よりも低い温度にて反応を継続し、生成するＬ−
ＤＯＰＡを無水結晶として反応液中に析出せしめ、これ
を採取する。
【００１４】本発明者らの知見によれば、β−チロシナ
ーゼ含有菌体またはその処理物を用いてＬ−ＤＯＰＡを
生産する際に、Ｌ−ＤＯＰＡが過飽和溶解度以上の濃度
に生成蓄積する結果析出するＬ−ＤＯＰＡの結晶は、反
応液の組成、ｐＨ等にもよるが、およそ２５℃付近を境
界として、より低い温度では一水和物結晶であり、より
高い温度では無水結晶である。Ｌ−ＤＯＰＡの一水和物
結晶は、結晶粒径が小さく、反応液中における沈降性及
び脱水性が著しく悪いため、このまま粗結晶として反応
液からろ過、振り切り等の操作によって分離・回収した
場合、回収率が低く、多くの付着母液を含んでいる。こ
れに対し、無水結晶は、結晶粒径が大きく、反応液中の
沈降性及び脱水性の良い結晶であり、このままろ過、振
り切り等の簡単な操作により高い回収率で粗結晶として
得ることができ、かつ付着母液も少ないために、イオン
交換樹脂処理、晶析等の通常の方法により更に精製する
ことができる。このため、２５℃以上の温度において反
応を行うことにより生成するＬ−ＤＯＰＡを無水結晶と
して反応液中に析出せしめ、これを分離・回収する方法
が考えられるが、２５℃以上の温度で反応を行えば副反
応が進行し、Ｌ−ＤＯＰＡの収率が低下してしまうた
め、工業生産上やはり好ましくない。
ーゼ含有菌体またはその処理物を用いてＬ−ＤＯＰＡを
生産する際に、Ｌ−ＤＯＰＡが過飽和溶解度以上の濃度
に生成蓄積する結果析出するＬ−ＤＯＰＡの結晶は、反
応液の組成、ｐＨ等にもよるが、およそ２５℃付近を境
界として、より低い温度では一水和物結晶であり、より
高い温度では無水結晶である。Ｌ−ＤＯＰＡの一水和物
結晶は、結晶粒径が小さく、反応液中における沈降性及
び脱水性が著しく悪いため、このまま粗結晶として反応
液からろ過、振り切り等の操作によって分離・回収した
場合、回収率が低く、多くの付着母液を含んでいる。こ
れに対し、無水結晶は、結晶粒径が大きく、反応液中の
沈降性及び脱水性の良い結晶であり、このままろ過、振
り切り等の簡単な操作により高い回収率で粗結晶として
得ることができ、かつ付着母液も少ないために、イオン
交換樹脂処理、晶析等の通常の方法により更に精製する
ことができる。このため、２５℃以上の温度において反
応を行うことにより生成するＬ−ＤＯＰＡを無水結晶と
して反応液中に析出せしめ、これを分離・回収する方法
が考えられるが、２５℃以上の温度で反応を行えば副反
応が進行し、Ｌ−ＤＯＰＡの収率が低下してしまうた
め、工業生産上やはり好ましくない。
【００１５】そこで、本発明の方法に従えば、反応液中
にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在せしめた状態で２５℃
よりも低い温度にて反応を継続することにより、生成す
るＬ−ＤＯＰＡが無水結晶として反応液中に析出され、
かつ高い収率でＬ−ＤＯＰＡを生産することができる。
にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在せしめた状態で２５℃
よりも低い温度にて反応を継続することにより、生成す
るＬ−ＤＯＰＡが無水結晶として反応液中に析出され、
かつ高い収率でＬ−ＤＯＰＡを生産することができる。
【００１６】反応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在
せしめた状態を形成させる一つの方法として、生成する
Ｌ−ＤＯＰＡが反応液中に一水和物結晶として析出する
温度で反応を行い、反応液にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を
添加する方法がある。
せしめた状態を形成させる一つの方法として、生成する
Ｌ−ＤＯＰＡが反応液中に一水和物結晶として析出する
温度で反応を行い、反応液にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を
添加する方法がある。
【００１７】生成するＬ−ＤＯＰＡが反応液中に一水和
物結晶として析出する温度は、反応液の組成、ｐＨ等に
より左右されるが、通常２５℃より低い温度であり、適
宜実験により容易にその上限を求めることができる。当
然ながら、このような温度において何の手だてもとらず
に反応を継続していくと、やがて反応液中にＬ−ＤＯＰ
Ａの一水和物結晶が析出する。そこで、一水和物結晶が
析出する以前にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を種晶として添
加し反応を継続することにより、以後生成するＬ−ＤＯ
ＰＡを無水結晶として反応液中に析出させることができ
る。なお、無水結晶を添加する時期は反応開始後一水和
物結晶が析出するまでの間であるのが好ましいが、一水
和物結晶が析出した後であっても多量の無水結晶が存在
すれば反応中に一水和物結晶の無水結晶への転移が起こ
るため差し支えない場合もある。添加する無水結晶の量
は添加した無水結晶が反応液中に種晶として存在する量
であればよく、適宜実験により求めることができる。具
体的に添加方法を例示すると、反応開始後Ｌ−ＤＯＰＡ
が０．３ｇ／ｄｌ蓄積した時点で０．０３ｇ／ｄｌの量
の無水結晶を添加する方法がある。
物結晶として析出する温度は、反応液の組成、ｐＨ等に
より左右されるが、通常２５℃より低い温度であり、適
宜実験により容易にその上限を求めることができる。当
然ながら、このような温度において何の手だてもとらず
に反応を継続していくと、やがて反応液中にＬ−ＤＯＰ
Ａの一水和物結晶が析出する。そこで、一水和物結晶が
析出する以前にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を種晶として添
加し反応を継続することにより、以後生成するＬ−ＤＯ
ＰＡを無水結晶として反応液中に析出させることができ
る。なお、無水結晶を添加する時期は反応開始後一水和
物結晶が析出するまでの間であるのが好ましいが、一水
和物結晶が析出した後であっても多量の無水結晶が存在
すれば反応中に一水和物結晶の無水結晶への転移が起こ
るため差し支えない場合もある。添加する無水結晶の量
は添加した無水結晶が反応液中に種晶として存在する量
であればよく、適宜実験により求めることができる。具
体的に添加方法を例示すると、反応開始後Ｌ−ＤＯＰＡ
が０．３ｇ／ｄｌ蓄積した時点で０．０３ｇ／ｄｌの量
の無水結晶を添加する方法がある。
【００１８】反応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在
せしめた状態を形成させる他の方法として、生成するＬ
−ＤＯＰＡが無水結晶として析出する温度で反応を行
い、反応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を析出せしめる
方法がある。この場合、無水結晶が析出した後に反応温
度を２５℃よりも低い温度、好ましくは２０℃以下の、
通常Ｌ−ＤＯＰＡが一水和物結晶として析出する温度に
低下させて反応を継続しても、以後生成するＬ−ＤＯＰ
Ａは無水結晶として反応液中に析出される。
せしめた状態を形成させる他の方法として、生成するＬ
−ＤＯＰＡが無水結晶として析出する温度で反応を行
い、反応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を析出せしめる
方法がある。この場合、無水結晶が析出した後に反応温
度を２５℃よりも低い温度、好ましくは２０℃以下の、
通常Ｌ−ＤＯＰＡが一水和物結晶として析出する温度に
低下させて反応を継続しても、以後生成するＬ−ＤＯＰ
Ａは無水結晶として反応液中に析出される。
【００１９】生成するＬ−ＤＯＰＡが無水結晶として析
出する温度も、反応液の組成、ｐＨ等により左右される
が、通常２５℃以上の温度であり、適宜実験により容易
にその下限を求めることができる。ここで反応温度を変
えずにそのまま反応を継続した場合、生成するＬ−ＤＯ
ＰＡは無水結晶として析出されるが、Ｌ−ＤＯＰＡ以外
の副生物の生成が顕著となりＬ−ＤＯＰＡの収率が低下
してしまう。これに対して、Ｌ−ＤＯＰＡの無水結晶を
析出させた後に、反応温度を２５℃より低い温度、好ま
しくは２０℃以下に低下させて反応を継続した場合、析
出した無水結晶が種晶となり、以後生成するＬ−ＤＯＰ
Ａは無水結晶として析出され、かつ副生物の生成も抑え
ることができ、高い収率でＬ−ＤＯＰＡを得ることがで
きる。
出する温度も、反応液の組成、ｐＨ等により左右される
が、通常２５℃以上の温度であり、適宜実験により容易
にその下限を求めることができる。ここで反応温度を変
えずにそのまま反応を継続した場合、生成するＬ−ＤＯ
ＰＡは無水結晶として析出されるが、Ｌ−ＤＯＰＡ以外
の副生物の生成が顕著となりＬ−ＤＯＰＡの収率が低下
してしまう。これに対して、Ｌ−ＤＯＰＡの無水結晶を
析出させた後に、反応温度を２５℃より低い温度、好ま
しくは２０℃以下に低下させて反応を継続した場合、析
出した無水結晶が種晶となり、以後生成するＬ−ＤＯＰ
Ａは無水結晶として析出され、かつ副生物の生成も抑え
ることができ、高い収率でＬ−ＤＯＰＡを得ることがで
きる。
【００２０】また、反応においては、高濃度の基質によ
る反応阻害を避けるためにカテコールを含む水溶液を反
応系にカテコール濃度が１．０％以下となるように連続
的もしくは断続的に添加しつつ反応させることにより、
Ｌ−ＤＯＰＡの生成速度及び蓄積量が著しく向上し、好
ましい結果が得られる（特開平５−１２３１７７号公
報）。
る反応阻害を避けるためにカテコールを含む水溶液を反
応系にカテコール濃度が１．０％以下となるように連続
的もしくは断続的に添加しつつ反応させることにより、
Ｌ−ＤＯＰＡの生成速度及び蓄積量が著しく向上し、好
ましい結果が得られる（特開平５−１２３１７７号公
報）。
【００２１】反応系には必要に応じ亜硫酸ナトリウムや
システイン等の還元剤、ＥＤＴＡやクエン酸等のキレー
ト剤を添加してもよい。反応液ｐＨは７．７ないし８．
７の範囲が適当であり、反応時間は用いるβ−チロシナ
ーゼ源の力価、濃度及び基質の濃度に応じ適宜決めれば
よい。
システイン等の還元剤、ＥＤＴＡやクエン酸等のキレー
ト剤を添加してもよい。反応液ｐＨは７．７ないし８．
７の範囲が適当であり、反応時間は用いるβ−チロシナ
ーゼ源の力価、濃度及び基質の濃度に応じ適宜決めれば
よい。
【００２２】得られたＬ−ＤＯＰＡの無水結晶は、沈降
性及び脱水性が良く、ろ過、振り切り等の操作により容
易に粗結晶として採取することができ、粗結晶はイオン
交換樹脂処理、晶析等の通常の方法により更に精製する
ことができる。
性及び脱水性が良く、ろ過、振り切り等の操作により容
易に粗結晶として採取することができ、粗結晶はイオン
交換樹脂処理、晶析等の通常の方法により更に精製する
ことができる。
【００２３】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。
する。
【００２４】実施例１ 肉汁寒天培地上で３１．５℃で２４時間培養して得たエ
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内の表１の組
成の培地（以下、シード培養培地という）５０ｍｌに接
種し、３１℃で１２時間振とう培養した。この培養液１
５０ｍｌを、５ｌ容ジャー・ファーメンター内の表２の
組成の培地（以下、メイン培養培地という）３ｌに植菌
し、アンモニアガス及びグルコースによりｐＨを７．５
に制御しつつ２８℃にて３６時間培養を行った。培養終
了後、培養液を４００ｍｌずつに分け、遠心分離機を用
いて菌体を回収した。ついで表３に示す組成のＬ−ＤＯ
ＰＡ生産用反応液（以下、単に反応液という）３００ｍ
ｌに回収した菌体を添加し１０℃、１５℃、２０℃、２
５℃、３０℃にて反応を行った。反応中、カテコールと
ピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有する水溶液
を反応系のカテコール濃度が０．５％以下となるように
連続的に添加した。反応１６時間で得られたＬ−ＤＯＰ
Ａの生成量及び析出した結晶の結晶形は表４に示す通り
であった。
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内の表１の組
成の培地（以下、シード培養培地という）５０ｍｌに接
種し、３１℃で１２時間振とう培養した。この培養液１
５０ｍｌを、５ｌ容ジャー・ファーメンター内の表２の
組成の培地（以下、メイン培養培地という）３ｌに植菌
し、アンモニアガス及びグルコースによりｐＨを７．５
に制御しつつ２８℃にて３６時間培養を行った。培養終
了後、培養液を４００ｍｌずつに分け、遠心分離機を用
いて菌体を回収した。ついで表３に示す組成のＬ−ＤＯ
ＰＡ生産用反応液（以下、単に反応液という）３００ｍ
ｌに回収した菌体を添加し１０℃、１５℃、２０℃、２
５℃、３０℃にて反応を行った。反応中、カテコールと
ピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有する水溶液
を反応系のカテコール濃度が０．５％以下となるように
連続的に添加した。反応１６時間で得られたＬ−ＤＯＰ
Ａの生成量及び析出した結晶の結晶形は表４に示す通り
であった。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【表２】
【００２７】
【表３】
【００２８】
【表４】
【００２９】実施例２ 肉汁寒天培地上で３１．５℃で２４時間培養して得たエ
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液１５０ｍｌを５ｌ容ジャー・ファーメ
ンター内のメイン培養培地３ｌに植菌し、アンモニアガ
ス及びグルコースによりｐＨを７．５に制御しつつ２８
℃にて３６時間培養を行った。培養終了後、培養液を４
００ｍｌずつに分け、遠心分離機を用いて菌体を回収し
た。ついで反応液３００ｍｌに回収した菌体を添加し、
１５℃にて反応を行い、それぞれ反応開始時、反応開始
後０．５、１、２、４、６時間後にＬ−ＤＯＰＡの無水
結晶を０．３ｇ／ｄｌになるように添加した。また、反
応中、カテコールとピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２
０％含有する水溶液を反応系のカテコール濃度が０．５
％以下となるように連続的に添加した。反応１６時間で
得られたＬ−ＤＯＰＡの生成量はいずれも１０ｇ／ｄｌ
であった。Ｌ−ＤＯＰＡの無水結晶の各添加時期におけ
るＬ−ＤＯＰＡの蓄積量及び反応終了液中の結晶形は表
５に示す通りであった。
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液１５０ｍｌを５ｌ容ジャー・ファーメ
ンター内のメイン培養培地３ｌに植菌し、アンモニアガ
ス及びグルコースによりｐＨを７．５に制御しつつ２８
℃にて３６時間培養を行った。培養終了後、培養液を４
００ｍｌずつに分け、遠心分離機を用いて菌体を回収し
た。ついで反応液３００ｍｌに回収した菌体を添加し、
１５℃にて反応を行い、それぞれ反応開始時、反応開始
後０．５、１、２、４、６時間後にＬ−ＤＯＰＡの無水
結晶を０．３ｇ／ｄｌになるように添加した。また、反
応中、カテコールとピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２
０％含有する水溶液を反応系のカテコール濃度が０．５
％以下となるように連続的に添加した。反応１６時間で
得られたＬ−ＤＯＰＡの生成量はいずれも１０ｇ／ｄｌ
であった。Ｌ−ＤＯＰＡの無水結晶の各添加時期におけ
るＬ−ＤＯＰＡの蓄積量及び反応終了液中の結晶形は表
５に示す通りであった。
【００３０】
【表５】
【００３１】実施例３ 肉汁寒天培地上で３１．５℃で２４時間培養して得たエ
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液１５０ｍｌを、５ｌ容ジャー・ファー
メンター内のメイン培養培地３ｌに植菌し、アンモニア
ガス及びグルコースによりｐＨ７．５に制御しつつ２８
℃にて３６時間培養を行った。培養終了後、培養液４０
０ｍｌずつ２つに分け、遠心分離機を用いて菌体を回収
した。ついで反応液３００ｍｌに回収した菌体を添加し
２５℃にて反応を行った。反応中、カテコールとピルビ
ン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有する水溶液を反応
系のカテコール濃度が０．５％以下となるように連続的
に添加した。反応の進行に伴い、Ｌ−ＤＯＰＡが無水結
晶の形で析出した。一方においては、無水結晶が起晶し
た後反応温度を１５℃に低下させて反応を継続した。他
方においては、無水結晶が起晶した後も２５℃に保った
まままま反応を継続した。その結果、反応１６時間で得
られたＬ−ＤＯＰＡの結晶形はいずれも無水結晶であ
り、生成量は反応温度を低下させた場合には９．５ｇ／
ｄｌ、変更しなかった場合には７．０ｇ／ｄｌであっ
た。また、対カテコールモル収率については、それぞ
れ、８０％、６０％であった。
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液１５０ｍｌを、５ｌ容ジャー・ファー
メンター内のメイン培養培地３ｌに植菌し、アンモニア
ガス及びグルコースによりｐＨ７．５に制御しつつ２８
℃にて３６時間培養を行った。培養終了後、培養液４０
０ｍｌずつ２つに分け、遠心分離機を用いて菌体を回収
した。ついで反応液３００ｍｌに回収した菌体を添加し
２５℃にて反応を行った。反応中、カテコールとピルビ
ン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有する水溶液を反応
系のカテコール濃度が０．５％以下となるように連続的
に添加した。反応の進行に伴い、Ｌ−ＤＯＰＡが無水結
晶の形で析出した。一方においては、無水結晶が起晶し
た後反応温度を１５℃に低下させて反応を継続した。他
方においては、無水結晶が起晶した後も２５℃に保った
まままま反応を継続した。その結果、反応１６時間で得
られたＬ−ＤＯＰＡの結晶形はいずれも無水結晶であ
り、生成量は反応温度を低下させた場合には９．５ｇ／
ｄｌ、変更しなかった場合には７．０ｇ／ｄｌであっ
た。また、対カテコールモル収率については、それぞ
れ、８０％、６０％であった。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＬ−３，４−ジヒドロキ
シフェニルアラニン（以下Ｌ−ＤＯＰＡと略す）の製造
方法に関する。Ｌ−ＤＯＰＡはパーキンソン氏病の治療
薬として多用されている。
シフェニルアラニン（以下Ｌ−ＤＯＰＡと略す）の製造
方法に関する。Ｌ−ＤＯＰＡはパーキンソン氏病の治療
薬として多用されている。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−ＤＯＰＡの製造方法として
は、バニリンを原料とする合成法が知られている。他
方、微生物の有する酵素系を用いたＬ−ＤＯＰＡの製造
法も検討されており、例えば、β−チロシナーゼを利用
してカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンか
ら製造する方法（特公昭４８−３４２３７号公報）、同
じくβ−チロシナーゼを利用してカテコール及びＬ−セ
リンその他のアミノ酸類から製造する方法（特公昭４７
−２２２７５号公報）、アンモニアリアーゼを利用して
ジヒドロキシ桂皮酸及びアンモニウムイオンから製造す
る方法（特公昭６２−２４０７６号公報）、オキシゲナ
ーゼを利用してＬ−フェニルアラニンもしくはＬ−チロ
シンから製造する方法（特公昭４７−１９０３３号公
報、同４７−１４９１５号公報）、トランスアミナーゼ
を利用して３，４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸か
ら製造する方法（特公昭５８−１８４７５号公報）等が
知られている。
は、バニリンを原料とする合成法が知られている。他
方、微生物の有する酵素系を用いたＬ−ＤＯＰＡの製造
法も検討されており、例えば、β−チロシナーゼを利用
してカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンか
ら製造する方法（特公昭４８−３４２３７号公報）、同
じくβ−チロシナーゼを利用してカテコール及びＬ−セ
リンその他のアミノ酸類から製造する方法（特公昭４７
−２２２７５号公報）、アンモニアリアーゼを利用して
ジヒドロキシ桂皮酸及びアンモニウムイオンから製造す
る方法（特公昭６２−２４０７６号公報）、オキシゲナ
ーゼを利用してＬ−フェニルアラニンもしくはＬ−チロ
シンから製造する方法（特公昭４７−１９０３３号公
報、同４７−１４９１５号公報）、トランスアミナーゼ
を利用して３，４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸か
ら製造する方法（特公昭５８−１８４７５号公報）等が
知られている。
【０００３】一方、Ｌ−ＤＯＰＡの結晶には一水和物結
晶と無水結晶の２種類が存在することが知られている。
その結晶形状は、一水和物結晶が針状晶であるのに対し
て、無水結晶は正方晶である。Ｌ−ＤＯＰＡの精製方法
として、３０℃以下の低温において不純物を含むＬ−Ｄ
ＯＰＡ水溶液からＬ−ＤＯＰＡを針状晶として晶出さ
せ、これを３０℃以上の温度に加熱して正方晶に転移さ
せて分離する方法が知られている（特公昭４９−４１１
８８号公報）。この方法によれば、Ｌ−ＤＯＰＡを針状
晶として析出させることにより着色物質及び製造工程か
ら随伴する不純物除去が効果的に行われ、さらにこれを
分離した後、正方晶に転移させることにより純粋な形の
ものを得ることができる。
晶と無水結晶の２種類が存在することが知られている。
その結晶形状は、一水和物結晶が針状晶であるのに対し
て、無水結晶は正方晶である。Ｌ−ＤＯＰＡの精製方法
として、３０℃以下の低温において不純物を含むＬ−Ｄ
ＯＰＡ水溶液からＬ−ＤＯＰＡを針状晶として晶出さ
せ、これを３０℃以上の温度に加熱して正方晶に転移さ
せて分離する方法が知られている（特公昭４９−４１１
８８号公報）。この方法によれば、Ｌ−ＤＯＰＡを針状
晶として析出させることにより着色物質及び製造工程か
ら随伴する不純物除去が効果的に行われ、さらにこれを
分離した後、正方晶に転移させることにより純粋な形の
ものを得ることができる。
【０００４】ところで、本発明者らは、β−チロシナー
ゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法を改良しＬ−ＤＯ
ＰＡを極めて高い濃度で生成蓄積せしめることに成功し
た（特開平５−１２３１７７号公報）。この方法によれ
ば、Ｌ−ＤＯＰＡが反応液中に溶解度以上の濃度に生成
蓄積するが、低い温度で反応を行うと析出する結晶は一
水和物結晶であり結晶の分離・回収性に問題があり、ま
た高い温度で反応を行うと析出する結晶は無水結晶であ
るが、副生物の副生が著しいとの問題点があった。
ゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法を改良しＬ−ＤＯ
ＰＡを極めて高い濃度で生成蓄積せしめることに成功し
た（特開平５−１２３１７７号公報）。この方法によれ
ば、Ｌ−ＤＯＰＡが反応液中に溶解度以上の濃度に生成
蓄積するが、低い温度で反応を行うと析出する結晶は一
水和物結晶であり結晶の分離・回収性に問題があり、ま
た高い温度で反応を行うと析出する結晶は無水結晶であ
るが、副生物の副生が著しいとの問題点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生
物のβ−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方
法をさらに改良することにより、従来から知られている
Ｌ−ＤＯＰＡの各種製造法よりも安価かつ効率的なＬ−
ＤＯＰＡの製造方法を提供することである。
物のβ−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方
法をさらに改良することにより、従来から知られている
Ｌ−ＤＯＰＡの各種製造法よりも安価かつ効率的なＬ−
ＤＯＰＡの製造方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物の
β−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法に
ついて鋭意研究を重ねた結果、反応液中にＬ−ＤＯＰＡ
の無水結晶を存在せしめた状態で２５℃よりも低い温度
にて反応を継続することにより、生成するＬ−ＤＯＰＡ
を無水結晶として反応液中に析出させることができ、こ
の結晶は沈降性に優れ容易に分離・回収することができ
ることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成す
るに至った。
β−チロシナーゼを利用したＬ−ＤＯＰＡの製造方法に
ついて鋭意研究を重ねた結果、反応液中にＬ−ＤＯＰＡ
の無水結晶を存在せしめた状態で２５℃よりも低い温度
にて反応を継続することにより、生成するＬ−ＤＯＰＡ
を無水結晶として反応液中に析出させることができ、こ
の結晶は沈降性に優れ容易に分離・回収することができ
ることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成す
るに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、β−チロシナーゼ含
有菌体またはその処理物をカテコール、ピルビン酸及び
アンモニウムイオン、またはカテコール及びＬ−セリン
に接触反応させてＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニンを製造する方法において、反応液中にＬ−３，４
−ジヒドロキシフェニルアラニンの無水結晶を存在せし
めた状態で２５℃よりも低い温度にて反応を継続し、生
成するＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを無
水結晶として反応液中に析出せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラ
ニンの製造方法を提供するものである。
有菌体またはその処理物をカテコール、ピルビン酸及び
アンモニウムイオン、またはカテコール及びＬ−セリン
に接触反応させてＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニンを製造する方法において、反応液中にＬ−３，４
−ジヒドロキシフェニルアラニンの無水結晶を存在せし
めた状態で２５℃よりも低い温度にて反応を継続し、生
成するＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを無
水結晶として反応液中に析出せしめ、これを採取するこ
とを特徴とするＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラ
ニンの製造方法を提供するものである。
【０００８】本発明に使用する微生物は、β−チロシナ
ーゼ（チロシンフェノールリアーゼ、ＥＣ４．１．９
９．２）活性を有する微生物であればいずれでも使用で
きるが、具体的に例示するとエルビニア属に属する以下
の菌株が高い活性を有しており好適である。 エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３ エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３４
ーゼ（チロシンフェノールリアーゼ、ＥＣ４．１．９
９．２）活性を有する微生物であればいずれでも使用で
きるが、具体的に例示するとエルビニア属に属する以下
の菌株が高い活性を有しており好適である。 エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３ エルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３４
【０００９】さらにこのような微生物に変異処理を施し
たり、あるいは遺伝子組換え技術等により育種すること
によってＬ−ＤＯＰＡ生産能を向上させた微生物も使用
することができる。
たり、あるいは遺伝子組換え技術等により育種すること
によってＬ−ＤＯＰＡ生産能を向上させた微生物も使用
することができる。
【００１０】これらの微生物の菌体を調製するには、炭
素源、窒素源、無機塩類、その他の栄養物質を含有する
培地に培養すればよい。炭素源としては、グリセロー
ル、フマル酸、糖類等が用いられ、また窒素源として
は、硫酸アンモニウム、アミノ酸等が用いられる。無機
塩類としてはリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等が適宜使用される。
その他の栄養物質としては大豆蛋白加水分解物、アミノ
酸類等が挙げられる。なお、β−チロシナーゼは適応酵
素と考えられ、上記微生物を培養する際には、チロシン
又はチロシン代替物質を培地に添加することにより、β
−チロシナーゼ活性の発現が大きくなり好ましい結果が
得られる。また、β−チロシナーゼ活性を高めるために
培地中にビタミンＢ6 類を添加することが有効である。
素源、窒素源、無機塩類、その他の栄養物質を含有する
培地に培養すればよい。炭素源としては、グリセロー
ル、フマル酸、糖類等が用いられ、また窒素源として
は、硫酸アンモニウム、アミノ酸等が用いられる。無機
塩類としてはリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛等が適宜使用される。
その他の栄養物質としては大豆蛋白加水分解物、アミノ
酸類等が挙げられる。なお、β−チロシナーゼは適応酵
素と考えられ、上記微生物を培養する際には、チロシン
又はチロシン代替物質を培地に添加することにより、β
−チロシナーゼ活性の発現が大きくなり好ましい結果が
得られる。また、β−チロシナーゼ活性を高めるために
培地中にビタミンＢ6 類を添加することが有効である。
【００１１】培養条件としては、培養温度は１５℃〜４
５℃が適当である。培養ｐＨ及び培養時間については、
微酸性〜微アルカリ性に保ちつつ１０ないし７２時間培
養が行えばよいが、菌の生育が定常期に達した後、ｐＨ
を７．０ないし８．３に制御しつつ６ないし２４時間培
養を続け、培養物を得ることにより、高いβ−チロシナ
ーゼ活性を有する菌体を得ることができる（特開平５−
１２３１７７号公報）。
５℃が適当である。培養ｐＨ及び培養時間については、
微酸性〜微アルカリ性に保ちつつ１０ないし７２時間培
養が行えばよいが、菌の生育が定常期に達した後、ｐＨ
を７．０ないし８．３に制御しつつ６ないし２４時間培
養を続け、培養物を得ることにより、高いβ−チロシナ
ーゼ活性を有する菌体を得ることができる（特開平５−
１２３１７７号公報）。
【００１２】β−チロシナーゼ含有菌体をカテコール、
ピルビン酸及びアンモニウムイオン、またはカテコール
及びＬ−セリンに接触反応させる反応においては、かく
して得られる培養物をそのまま反応に用いてもよく、培
養物から分離・回収した微生物菌体を使用してもよい。
また、微生物菌体の処理物として、菌体摩砕物、アセト
ン処理菌体、固定化菌体、菌体抽出物もしくはこれから
精製して得られるβ−チロシナーゼを使用することもで
きる。
ピルビン酸及びアンモニウムイオン、またはカテコール
及びＬ−セリンに接触反応させる反応においては、かく
して得られる培養物をそのまま反応に用いてもよく、培
養物から分離・回収した微生物菌体を使用してもよい。
また、微生物菌体の処理物として、菌体摩砕物、アセト
ン処理菌体、固定化菌体、菌体抽出物もしくはこれから
精製して得られるβ−チロシナーゼを使用することもで
きる。
【００１３】本発明においては、上記反応において、反
応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在せしめた状態で
２５℃よりも低い温度にて反応を継続し、生成するＬ−
ＤＯＰＡを無水結晶として反応液中に析出せしめ、これ
を採取する。
応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在せしめた状態で
２５℃よりも低い温度にて反応を継続し、生成するＬ−
ＤＯＰＡを無水結晶として反応液中に析出せしめ、これ
を採取する。
【００１４】本発明者らの知見によれば、β−チロシナ
ーゼ含有菌体またはその処理物を用いてＬ−ＤＯＰＡを
生産する際に、Ｌ−ＤＯＰＡが過飽和溶解度以上の濃度
に生成蓄積する結果析出するＬ−ＤＯＰＡの結晶は、反
応液の組成、ｐＨ等にもよるが、およそ２５℃付近を境
界として、より低い温度では一水和物結晶であり、より
高い温度では無水結晶である。Ｌ−ＤＯＰＡの一水和物
結晶は、結晶粒径が小さく、反応液中における沈降性及
び脱水性が著しく悪いため、このまま粗結晶として反応
液からろ過、振り切り等の操作によって分離・回収した
場合、回収率が低く、多くの付着母液を含んでいる。こ
れに対し、無水結晶は、結晶粒径が大きく、反応液中の
沈降性及び脱水性の良い結晶であり、このままろ過、振
り切り等の簡単な操作により高い回収率で粗結晶として
得ることができ、かつ付着母液も少ないために、イオン
交換樹脂処理、晶析等の通常の方法により更に精製する
ことができる。このため、２５℃以上の温度において反
応を行うことにより生成するＬ−ＤＯＰＡを無水結晶と
して反応液中に析出せしめ、これを分離・回収する方法
が考えられるが、２５℃以上の温度で反応を行えば副反
応が進行し、Ｌ−ＤＯＰＡの収率が低下してしまうた
め、工業生産上やはり好ましくない。
ーゼ含有菌体またはその処理物を用いてＬ−ＤＯＰＡを
生産する際に、Ｌ−ＤＯＰＡが過飽和溶解度以上の濃度
に生成蓄積する結果析出するＬ−ＤＯＰＡの結晶は、反
応液の組成、ｐＨ等にもよるが、およそ２５℃付近を境
界として、より低い温度では一水和物結晶であり、より
高い温度では無水結晶である。Ｌ−ＤＯＰＡの一水和物
結晶は、結晶粒径が小さく、反応液中における沈降性及
び脱水性が著しく悪いため、このまま粗結晶として反応
液からろ過、振り切り等の操作によって分離・回収した
場合、回収率が低く、多くの付着母液を含んでいる。こ
れに対し、無水結晶は、結晶粒径が大きく、反応液中の
沈降性及び脱水性の良い結晶であり、このままろ過、振
り切り等の簡単な操作により高い回収率で粗結晶として
得ることができ、かつ付着母液も少ないために、イオン
交換樹脂処理、晶析等の通常の方法により更に精製する
ことができる。このため、２５℃以上の温度において反
応を行うことにより生成するＬ−ＤＯＰＡを無水結晶と
して反応液中に析出せしめ、これを分離・回収する方法
が考えられるが、２５℃以上の温度で反応を行えば副反
応が進行し、Ｌ−ＤＯＰＡの収率が低下してしまうた
め、工業生産上やはり好ましくない。
【００１５】そこで、本発明の方法に従えば、反応液中
にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在せしめた状態で２５℃
よりも低い温度にて反応を継続することにより、生成す
るＬ−ＤＯＰＡが無水結晶として反応液中に析出され、
かつ高い収率でＬ−ＤＯＰＡを生産することができる。
にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在せしめた状態で２５℃
よりも低い温度にて反応を継続することにより、生成す
るＬ−ＤＯＰＡが無水結晶として反応液中に析出され、
かつ高い収率でＬ−ＤＯＰＡを生産することができる。
【００１６】反応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在
せしめた状態を形成させる一つの方法として、生成する
Ｌ−ＤＯＰＡが反応液中に一水和物結晶として析出する
温度で反応を行い、反応液にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を
添加する方法がある。
せしめた状態を形成させる一つの方法として、生成する
Ｌ−ＤＯＰＡが反応液中に一水和物結晶として析出する
温度で反応を行い、反応液にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を
添加する方法がある。
【００１７】生成するＬ−ＤＯＰＡが反応液中に一水和
物結晶として析出する温度は、反応液の組成、ｐＨ等に
より左右されるが、通常２５℃より低い温度であり、適
宜実験により容易にその上限を求めることができる。当
然ながら、このような温度において何の手だてもとらず
に反応を継続していくと、やがて反応液中にＬ−ＤＯＰ
Ａの一水和物結晶が析出する。そこで、一水和物結晶が
析出する以前にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を種晶として添
加し反応を継続することにより、以後生成するＬ−ＤＯ
ＰＡを無水結晶として反応液中に析出させることができ
る。なお、無水結晶を添加する時期は反応開始後一水和
物結晶が析出するまでの間であるのが好ましいが、一水
和物結晶が析出した後であっても多量の無水結晶が存在
すれば反応中に一水和物結晶の無水結晶への転移が起こ
るため差し支えない場合もある。添加する無水結晶の量
は添加した無水結晶が反応液中に種晶として存在する量
であればよく、適宜実験により求めることができる。具
体的に添加方法を例示すると、反応開始後Ｌ−ＤＯＰＡ
が０．３ｇ／ｄｌ蓄積した時点で０．０３ｇ／ｄｌの量
の無水結晶を添加する方法がある。
物結晶として析出する温度は、反応液の組成、ｐＨ等に
より左右されるが、通常２５℃より低い温度であり、適
宜実験により容易にその上限を求めることができる。当
然ながら、このような温度において何の手だてもとらず
に反応を継続していくと、やがて反応液中にＬ−ＤＯＰ
Ａの一水和物結晶が析出する。そこで、一水和物結晶が
析出する以前にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を種晶として添
加し反応を継続することにより、以後生成するＬ−ＤＯ
ＰＡを無水結晶として反応液中に析出させることができ
る。なお、無水結晶を添加する時期は反応開始後一水和
物結晶が析出するまでの間であるのが好ましいが、一水
和物結晶が析出した後であっても多量の無水結晶が存在
すれば反応中に一水和物結晶の無水結晶への転移が起こ
るため差し支えない場合もある。添加する無水結晶の量
は添加した無水結晶が反応液中に種晶として存在する量
であればよく、適宜実験により求めることができる。具
体的に添加方法を例示すると、反応開始後Ｌ−ＤＯＰＡ
が０．３ｇ／ｄｌ蓄積した時点で０．０３ｇ／ｄｌの量
の無水結晶を添加する方法がある。
【００１８】反応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を存在
せしめた状態を形成させる他の方法として、生成するＬ
−ＤＯＰＡが無水結晶として析出する温度で反応を行
い、反応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を析出せしめる
方法がある。この場合、無水結晶が析出した後に反応温
度を２５℃よりも低い温度、好ましくは２０℃以下の、
通常Ｌ−ＤＯＰＡが一水和物結晶として析出する温度に
低下させて反応を継続しても、以後生成するＬ−ＤＯＰ
Ａは無水結晶として反応液中に析出される。
せしめた状態を形成させる他の方法として、生成するＬ
−ＤＯＰＡが無水結晶として析出する温度で反応を行
い、反応液中にＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を析出せしめる
方法がある。この場合、無水結晶が析出した後に反応温
度を２５℃よりも低い温度、好ましくは２０℃以下の、
通常Ｌ−ＤＯＰＡが一水和物結晶として析出する温度に
低下させて反応を継続しても、以後生成するＬ−ＤＯＰ
Ａは無水結晶として反応液中に析出される。
【００１９】生成するＬ−ＤＯＰＡが無水結晶として析
出する温度も、反応液の組成、ｐＨ等により左右される
が、通常２５℃以上の温度であり、適宜実験により容易
にその下限を求めることができる。ここで反応温度を変
えずにそのまま反応を継続した場合、生成するＬ−ＤＯ
ＰＡは無水結晶として析出されるが、Ｌ−ＤＯＰＡ以外
の副生物の生成が顕著となりＬ−ＤＯＰＡの収率が低下
してしまう。これに対して、Ｌ−ＤＯＰＡの無水結晶を
析出させた後に、反応温度を２５℃より低い温度、好ま
しくは２０℃以下に低下させて反応を継続した場合、析
出した無水結晶が種晶となり、以後生成するＬ−ＤＯＰ
Ａは無水結晶として析出され、かつ副生物の生成も抑え
ることができ、高い収率でＬ−ＤＯＰＡを得ることがで
きる。
出する温度も、反応液の組成、ｐＨ等により左右される
が、通常２５℃以上の温度であり、適宜実験により容易
にその下限を求めることができる。ここで反応温度を変
えずにそのまま反応を継続した場合、生成するＬ−ＤＯ
ＰＡは無水結晶として析出されるが、Ｌ−ＤＯＰＡ以外
の副生物の生成が顕著となりＬ−ＤＯＰＡの収率が低下
してしまう。これに対して、Ｌ−ＤＯＰＡの無水結晶を
析出させた後に、反応温度を２５℃より低い温度、好ま
しくは２０℃以下に低下させて反応を継続した場合、析
出した無水結晶が種晶となり、以後生成するＬ−ＤＯＰ
Ａは無水結晶として析出され、かつ副生物の生成も抑え
ることができ、高い収率でＬ−ＤＯＰＡを得ることがで
きる。
【００２０】また、反応においては、高濃度の基質によ
る反応阻害を避けるためにカテコールを含む水溶液を反
応系にカテコール濃度が１．０％以下となるように連続
的もしくは断続的に添加しつつ反応させることにより、
Ｌ−ＤＯＰＡの生成速度及び蓄積量が著しく向上し、好
ましい結果が得られる（特開平５−１２３１７７号公
報）。
る反応阻害を避けるためにカテコールを含む水溶液を反
応系にカテコール濃度が１．０％以下となるように連続
的もしくは断続的に添加しつつ反応させることにより、
Ｌ−ＤＯＰＡの生成速度及び蓄積量が著しく向上し、好
ましい結果が得られる（特開平５−１２３１７７号公
報）。
【００２１】反応系には必要に応じ亜硫酸ナトリウムや
システイン等の還元剤、ＥＤＴＡやクエン酸等のキレー
ト剤を添加してもよい。反応液ｐＨは７．７ないし８．
７の範囲が適当であり、反応時間は用いるβ−チロシナ
ーゼ源の力価、濃度及び基質の濃度に応じ適宜決めれば
よい。
システイン等の還元剤、ＥＤＴＡやクエン酸等のキレー
ト剤を添加してもよい。反応液ｐＨは７．７ないし８．
７の範囲が適当であり、反応時間は用いるβ−チロシナ
ーゼ源の力価、濃度及び基質の濃度に応じ適宜決めれば
よい。
【００２２】得られたＬ−ＤＯＰＡの無水結晶は、沈降
性及び脱水性が良く、ろ過、振り切り等の操作により容
易に粗結晶として採取することができ、粗結晶はイオン
交換樹脂処理、晶析等の通常の方法により更に精製する
ことができる。
性及び脱水性が良く、ろ過、振り切り等の操作により容
易に粗結晶として採取することができ、粗結晶はイオン
交換樹脂処理、晶析等の通常の方法により更に精製する
ことができる。
【００２３】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。
する。
【００２４】実施例１ 肉汁寒天培地上で３１．５℃で２４時間培養して得たエ
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内の表１の組
成の培地（以下、シード培養培地という）５０ｍｌに接
種し、３１℃で１２時間振とう培養した。この培養液１
５０ｍｌを、５ｌ容ジャー・ファーメンター内の表２の
組成の培地（以下、メイン培養培地という）３ｌに植菌
し、アンモニアガス及びグルコースによりｐＨを７．５
に制御しつつ２８℃にて３６時間培養を行った。培養終
了後、培養液を４００ｍｌずつに分け、遠心分離機を用
いて菌体を回収した。ついで表３に示す組成のＬ−ＤＯ
ＰＡ生産用反応液（以下、単に反応液という）３００ｍ
ｌに回収した菌体を添加し１０℃、１５℃、２０℃、２
５℃、３０℃にて反応を行った。反応中、カテコールと
ピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有する水溶液
を反応系のカテコール濃度が０．５％以下となるように
連続的に添加した。反応１６時間で得られたＬ−ＤＯＰ
Ａの生成量及び析出した結晶の結晶形は表４に示す通り
であった。
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内の表１の組
成の培地（以下、シード培養培地という）５０ｍｌに接
種し、３１℃で１２時間振とう培養した。この培養液１
５０ｍｌを、５ｌ容ジャー・ファーメンター内の表２の
組成の培地（以下、メイン培養培地という）３ｌに植菌
し、アンモニアガス及びグルコースによりｐＨを７．５
に制御しつつ２８℃にて３６時間培養を行った。培養終
了後、培養液を４００ｍｌずつに分け、遠心分離機を用
いて菌体を回収した。ついで表３に示す組成のＬ−ＤＯ
ＰＡ生産用反応液（以下、単に反応液という）３００ｍ
ｌに回収した菌体を添加し１０℃、１５℃、２０℃、２
５℃、３０℃にて反応を行った。反応中、カテコールと
ピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有する水溶液
を反応系のカテコール濃度が０．５％以下となるように
連続的に添加した。反応１６時間で得られたＬ−ＤＯＰ
Ａの生成量及び析出した結晶の結晶形は表４に示す通り
であった。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【表２】
【００２７】
【表３】
【００２８】
【表４】
【００２９】実施例２ 肉汁寒天培地上で３１．５℃で２４時間培養して得たエ
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液１５０ｍｌを５ｌ容ジャー・ファーメ
ンター内のメイン培養培地３ｌに植菌し、アンモニアガ
ス及びグルコースによりｐＨを７．５に制御しつつ２８
℃にて３６時間培養を行った。培養終了後、培養液を４
００ｍｌずつに分け、遠心分離機を用いて菌体を回収し
た。ついで反応液３００ｍｌに回収した菌体を添加し、
１５℃にて反応を行い、それぞれ反応開始時、反応開始
後０．５、１、２、４、６時間後にＬ−ＤＯＰＡの無水
結晶を０．３ｇ／ｄｌになるように添加した。また、反
応中、カテコールとピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２
０％含有する水溶液を反応系のカテコール濃度が０．５
％以下となるように連続的に添加した。反応１６時間で
得られたＬ−ＤＯＰＡの生成量はいずれも１０ｇ／ｄｌ
であった。Ｌ−ＤＯＰＡの無水結晶の各添加時期におけ
るＬ−ＤＯＰＡの蓄積量及び反応終了液中の結晶形は表
５に示す通りであった。
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液１５０ｍｌを５ｌ容ジャー・ファーメ
ンター内のメイン培養培地３ｌに植菌し、アンモニアガ
ス及びグルコースによりｐＨを７．５に制御しつつ２８
℃にて３６時間培養を行った。培養終了後、培養液を４
００ｍｌずつに分け、遠心分離機を用いて菌体を回収し
た。ついで反応液３００ｍｌに回収した菌体を添加し、
１５℃にて反応を行い、それぞれ反応開始時、反応開始
後０．５、１、２、４、６時間後にＬ−ＤＯＰＡの無水
結晶を０．３ｇ／ｄｌになるように添加した。また、反
応中、カテコールとピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２
０％含有する水溶液を反応系のカテコール濃度が０．５
％以下となるように連続的に添加した。反応１６時間で
得られたＬ−ＤＯＰＡの生成量はいずれも１０ｇ／ｄｌ
であった。Ｌ−ＤＯＰＡの無水結晶の各添加時期におけ
るＬ−ＤＯＰＡの蓄積量及び反応終了液中の結晶形は表
５に示す通りであった。
【００３０】
【表５】
【００３１】実施例３ 肉汁寒天培地上で３１．５℃で２４時間培養して得たエ
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液１５０ｍｌを、５ｌ容ジャー・ファー
メンター内のメイン培養培地３ｌに植菌し、アンモニア
ガス及びグルコースによりｐＨ７．５に制御しつつ２８
℃にて３６時間培養を行った。培養終了後、培養液４０
０ｍｌずつ２つに分け、遠心分離機を用いて菌体を回収
した。ついで反応液３００ｍｌに回収した菌体を添加し
２５℃にて反応を行った。反応中、カテコールとピルビ
ン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有する水溶液を反応
系のカテコール濃度が０．５％以下となるように連続的
に添加した。反応の進行に伴い、Ｌ−ＤＯＰＡが無水結
晶の形で析出した。一方においては、無水結晶が起晶し
た後反応温度を１５℃に低下させて反応を継続した。他
方においては、無水結晶が起晶した後も２５℃に保った
まままま反応を継続した。その結果、反応１６時間で得
られたＬ−ＤＯＰＡの結晶形はいずれも無水結晶であ
り、生成量は反応温度を低下させた場合には９．５ｇ／
ｄｌ、変更しなかった場合には７．０ｇ／ｄｌであっ
た。また、対カテコールモル収率については、それぞ
れ、８０％、６０％であった。
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液１５０ｍｌを、５ｌ容ジャー・ファー
メンター内のメイン培養培地３ｌに植菌し、アンモニア
ガス及びグルコースによりｐＨ７．５に制御しつつ２８
℃にて３６時間培養を行った。培養終了後、培養液４０
０ｍｌずつ２つに分け、遠心分離機を用いて菌体を回収
した。ついで反応液３００ｍｌに回収した菌体を添加し
２５℃にて反応を行った。反応中、カテコールとピルビ
ン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有する水溶液を反応
系のカテコール濃度が０．５％以下となるように連続的
に添加した。反応の進行に伴い、Ｌ−ＤＯＰＡが無水結
晶の形で析出した。一方においては、無水結晶が起晶し
た後反応温度を１５℃に低下させて反応を継続した。他
方においては、無水結晶が起晶した後も２５℃に保った
まままま反応を継続した。その結果、反応１６時間で得
られたＬ−ＤＯＰＡの結晶形はいずれも無水結晶であ
り、生成量は反応温度を低下させた場合には９．５ｇ／
ｄｌ、変更しなかった場合には７．０ｇ／ｄｌであっ
た。また、対カテコールモル収率については、それぞ
れ、８０％、６０％であった。
【００３２】実施例４ 肉汁寒天培地上で３１．５℃で２４時間培養して得たエ
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液２５ｍｌを、５０ｌ容ジャー・ファー
メンター内のシード培養培地２５ｌに植菌し、３１℃で
１６時間培養後、８００ｌ容ジャー・ファーメンター内
のメイン培養培地５００ｌに植菌し、アンモニアガス及
びグルコースによりｐＨ７．５に制御しつつ２８℃にて
３６時間培養を行った。培養終了後、遠心分離機を用い
て菌体を回収し、これを２つに分けてそれぞれ反応液２
００ｌに添加し、１５℃にて反応を行った。反応中、カ
テコールとピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有
する水溶液を反応系のカテコール濃度が０．５％以下と
なるように連続的に添加した。一方の反応系において
は、反応開始後Ｌ−ＤＯＰＡの蓄積濃度が０．３ｇ／ｄ
ｌに達した時点でＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を０．５ｇ／
ｄｌとなるように添加して反応を継続し、他方の反応系
においては結晶の添加を行わずにそのまま反応を継続し
た。２０時間の反応で得られたＬ−ＤＯＰＡの生成量は
いずれも１０．０ｇ／ｄｌであった。また、反応液中に
析出したＬ−ＤＯＰＡの結晶形は、前者においては無水
結晶であり、後者においては一水和物結晶であった。次
に各反応液２００ｌより巴工業製シャープレス・スーパ
ーデカンターＰ６６０を用いて結晶の分離を行い、スラ
リー状粗結晶として回収した。Ｌ−ＤＯＰＡが無水結晶
として析出している前者の反応液からは、Ｌ−ＤＯＰＡ
の回収率は９６％であり、回収されたスラリー状粗結晶
の水分は２６％であった。一方、Ｌ−ＤＯＰＡが一水和
物結晶として析出している後者の反応液からは、Ｌ−Ｄ
ＯＰＡの回収率は２８％と低く、回収されたスラリー状
粗結晶は６３％もの水分を含んでいた。 無水結晶とし
て回収したＬ−ＤＯＰＡスラリー状粗結晶１ｋｇを常法
に従い酸に溶解させ、除菌した後、活性炭カラムに吸着
させ、０．２％亜硫酸ナトリウムを含む希アンモニア水
で溶離させた。中和、濃縮した後、更に水より再結を３
回行った結果、Ｌ−ＤＯＰＡの精製結晶３５０ｇを得
た。 ─────────────────────────────────────────────────────
ルビニア・ヘルビコーラ ＡＴＣＣ２１４３３の菌体一
白金耳量を、５００ｍｌ容振とうフラスコ内のシード培
養培地５０ｍｌに接種し、３１℃で１２時間振とう培養
した。この培養液２５ｍｌを、５０ｌ容ジャー・ファー
メンター内のシード培養培地２５ｌに植菌し、３１℃で
１６時間培養後、８００ｌ容ジャー・ファーメンター内
のメイン培養培地５００ｌに植菌し、アンモニアガス及
びグルコースによりｐＨ７．５に制御しつつ２８℃にて
３６時間培養を行った。培養終了後、遠心分離機を用い
て菌体を回収し、これを２つに分けてそれぞれ反応液２
００ｌに添加し、１５℃にて反応を行った。反応中、カ
テコールとピルビン酸ナトリウムをそれぞれ２０％含有
する水溶液を反応系のカテコール濃度が０．５％以下と
なるように連続的に添加した。一方の反応系において
は、反応開始後Ｌ−ＤＯＰＡの蓄積濃度が０．３ｇ／ｄ
ｌに達した時点でＬ−ＤＯＰＡの無水結晶を０．５ｇ／
ｄｌとなるように添加して反応を継続し、他方の反応系
においては結晶の添加を行わずにそのまま反応を継続し
た。２０時間の反応で得られたＬ−ＤＯＰＡの生成量は
いずれも１０．０ｇ／ｄｌであった。また、反応液中に
析出したＬ−ＤＯＰＡの結晶形は、前者においては無水
結晶であり、後者においては一水和物結晶であった。次
に各反応液２００ｌより巴工業製シャープレス・スーパ
ーデカンターＰ６６０を用いて結晶の分離を行い、スラ
リー状粗結晶として回収した。Ｌ−ＤＯＰＡが無水結晶
として析出している前者の反応液からは、Ｌ−ＤＯＰＡ
の回収率は９６％であり、回収されたスラリー状粗結晶
の水分は２６％であった。一方、Ｌ−ＤＯＰＡが一水和
物結晶として析出している後者の反応液からは、Ｌ−Ｄ
ＯＰＡの回収率は２８％と低く、回収されたスラリー状
粗結晶は６３％もの水分を含んでいた。 無水結晶とし
て回収したＬ−ＤＯＰＡスラリー状粗結晶１ｋｇを常法
に従い酸に溶解させ、除菌した後、活性炭カラムに吸着
させ、０．２％亜硫酸ナトリウムを含む希アンモニア水
で溶離させた。中和、濃縮した後、更に水より再結を３
回行った結果、Ｌ−ＤＯＰＡの精製結晶３５０ｇを得
た。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１０月３１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】
【表３】
Claims (3)
- 【請求項１】 β−チロシナーゼ含有菌体またはその処
理物をカテコール、ピルビン酸及びアンモニウムイオ
ン、またはカテコール及びＬ−セリンに接触反応させて
Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを製造する
方法において、反応液中にＬ−３，４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニンの無水結晶を存在せしめた状態で２５℃
より低い温度にて反応を継続し、生成するＬ−３，４−
ジヒドロキシフェニルアラニンを無水結晶として反応液
中に析出せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法。 - 【請求項２】 反応液中にＬ−３，４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニン無水結晶を存在せしめた状態が、Ｌ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンが反応液中に一
水和物結晶として析出する温度にて反応を行い、反応液
にＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの無水結
晶を添加することにより形成される請求項１記載のＬ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法。 - 【請求項３】 反応液中にＬ−３，４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニン無水結晶を存在せしめた状態が、Ｌ−
３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンが反応液中に無
水結晶として析出する温度にて反応を行い、反応液中に
Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの無水結晶
を析出せしめることにより形成される請求項１記載のＬ
−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19058393A JP3528205B2 (ja) | 1993-07-30 | 1993-07-30 | Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
| DE69418260T DE69418260T2 (de) | 1993-07-30 | 1994-07-21 | Verfahren zur Herstellung von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin |
| EP94111423A EP0636695B1 (en) | 1993-07-30 | 1994-07-21 | Method for producing L-3,4-dihydroxyphenylalanine |
| US08/281,695 US5518905A (en) | 1993-07-30 | 1994-07-28 | Method for producing L-3,4-dihydroxyphenylalanine by precipitation of anhydrous crystals |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19058393A JP3528205B2 (ja) | 1993-07-30 | 1993-07-30 | Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0739385A true JPH0739385A (ja) | 1995-02-10 |
| JP3528205B2 JP3528205B2 (ja) | 2004-05-17 |
Family
ID=16260482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19058393A Expired - Lifetime JP3528205B2 (ja) | 1993-07-30 | 1993-07-30 | Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5518905A (ja) |
| EP (1) | EP0636695B1 (ja) |
| JP (1) | JP3528205B2 (ja) |
| DE (1) | DE69418260T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006109830A1 (ja) * | 2005-04-12 | 2006-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | アミノ酸の製造法 |
| US7754466B2 (en) | 2001-07-26 | 2010-07-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing dipeptides |
| WO2023090378A1 (ja) * | 2021-11-16 | 2023-05-25 | 花王株式会社 | ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4427878B2 (ja) | 1999-08-20 | 2010-03-10 | 味の素株式会社 | 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
| JP4292724B2 (ja) | 2001-02-20 | 2009-07-08 | 味の素株式会社 | 有機態窒素含有組成物及びそれを含む肥料 |
| JP2002238592A (ja) | 2001-02-20 | 2002-08-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
| JP4599725B2 (ja) | 2001-02-20 | 2010-12-15 | 味の素株式会社 | Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
| JP4599726B2 (ja) | 2001-02-20 | 2010-12-15 | 味の素株式会社 | Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
| ES2320505B1 (es) * | 2006-03-15 | 2010-03-05 | Universidad De Murcia | Procedimiento de obtencion de l-dopa a partir de l-tirosina utilizando la enzima tirosinasa np 518458 de la bacteria ralstonia solanacearum. |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA936115A (en) * | 1968-12-02 | 1973-10-30 | Ajinomoto Co. | Fermentative method of producing l-dihydroxy phenylalanine |
| FR2091396A5 (en) * | 1970-05-14 | 1972-01-14 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Dopa optical resolution by selective crystallization from superstaura |
| GB1321201A (en) * | 1970-10-21 | 1973-06-27 | Ajinomoto Kk | Production of phenolic aminoacids |
| CA947214A (en) * | 1971-04-02 | 1974-05-14 | Canadian Patents And Development Limited | Resolution of racemates of ring-substituted phenylalanines |
| JPS5049249A (ja) * | 1973-08-31 | 1975-05-01 | ||
| JPS5049250A (ja) * | 1973-08-31 | 1975-05-01 | ||
| JPS62288A (ja) * | 1985-03-09 | 1987-01-06 | Sanraku Inc | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造方法 |
| JPH0431975A (ja) * | 1990-05-28 | 1992-02-04 | Seikosha Co Ltd | 画像監視方法 |
| US5338672A (en) * | 1991-10-30 | 1994-08-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-3, 4-dihydroxyphenyalanine by Erwinia having tyrosinase activity |
-
1993
- 1993-07-30 JP JP19058393A patent/JP3528205B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-07-21 DE DE69418260T patent/DE69418260T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-21 EP EP94111423A patent/EP0636695B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-28 US US08/281,695 patent/US5518905A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7754466B2 (en) | 2001-07-26 | 2010-07-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing dipeptides |
| WO2006109830A1 (ja) * | 2005-04-12 | 2006-10-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | アミノ酸の製造法 |
| US7888078B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-02-15 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing amino acids |
| USRE45723E1 (en) | 2005-04-12 | 2015-10-06 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing amino acids |
| WO2023090378A1 (ja) * | 2021-11-16 | 2023-05-25 | 花王株式会社 | ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
| JP2023074007A (ja) * | 2021-11-16 | 2023-05-26 | 花王株式会社 | ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 |
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