JPS6279362A - 酵素活性測定に用いる分析要素 - Google Patents

酵素活性測定に用いる分析要素

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JPS6279362A
JPS6279362A JP60219703A JP21970385A JPS6279362A JP S6279362 A JPS6279362 A JP S6279362A JP 60219703 A JP60219703 A JP 60219703A JP 21970385 A JP21970385 A JP 21970385A JP S6279362 A JPS6279362 A JP S6279362A
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JP
Japan
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reagent
reagent layer
porous
pyruvate oxidase
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JP60219703A
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Yoshikazu Amano
芳和 天野
Kazuya Kawasaki
和也 川崎
Shunkai Katsuyama
春海 勝山
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Fuji Photo Film Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生物体液、例えば血液中の特定の物質の定量に
用いる多・層化学分析要素に関する。特にピルビン酸オ
キダーゼの関与する反応を介して、トランスアミナーゼ
活性を測定するのに適した多層分析フィルムに関する。
〔従来技術〕
種々のトランスアミナーゼがアミン基転移酵素として知
られている。そのなかでも、特に、アラニンアミノトラ
ンスフェラーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミントラ
ンスフェラーゼ（ＡＳＴ）は、その血中濃度の増減が肝
疾−８の目安となるので、肝疾患の診断にあたっては、
ＡＬＴ及びＡｓＴの活性測定が重要な役割を荷っている
。
ＡＬＴとＡＳＴはそれぞれ次の反応を触媒する酵素であ
る。
ピルビン酸十し−グルタミン酸 オキザロ酢酸＋Ｌ−グルタミン酸 生体系における各種のトランスアミナーゼの活性測定法
として、特開昭ｔＪ−−／３０１．？号に示されている
如く、基質にトランスアミナーゼ全作用させてピルビン
酸全生成させ、生成したピルビン酸にピルビン酸オキシ
ダーゼと（ｋルオキシダーゼを含む）過酸化水素検出呈
色指示薬組成物を作用させて比色法によりピルビン酸の
生成針ヲ求め、トランスアミナーゼ活性を測定する方法
がある。
この方法の原理を代表的反応式をもって示せば、次のと
おりである。
＋　　　　　　　　　　セ 譬 式中の符号は下記を表わす。
ＡＳＴ　：アス／ｅラギン酸アミノトランスフェラーゼ ＡＬＴ：アラニンアミノトランスフェラーゼＰｉ　：無
機燐酸 ｐｏｐ　ｘピルビン酸オキシダーゼ ＦＡＤ：フラビンアデニンジヌクレオチドＴＰＰ　：チ
アミンピロリン酸 Ｍ２＋　：二価の金属 ＰＯＤ：ベルオキシダーゼ すなわち、式〔ｌ〕のＡＬＴ酵素反応で生成したピルビ
ン酸、又は式〔２〕のＡ　Ｓ　’ｒ酵素反応で生成した
オキザロ酢酸が、更に式〔≠〕に示すようにオキザロ酢
酸脱炭酸酵素の働きにより宝典されて生じたピルビン酸
は、それぞれに共役したＰＯＰ酵素反応〔３〕に従い、
過酸化水素に変換される。この過酸化水素を基質とする
ＰＯＤ酵素反応によシ、水素供与体とカプラーとのカプ
リング反応（ｊ）が生じ、こうして生成された染料を比
色定量するものである。
水溶液系でこの定量方法を適用しようとすると、一連の
化学反応を水溶液中で進行させるために、煩雑な操作と
長い時間全必要とする。更に、いわゆる内因性ピルビン
酸の干渉が予想される場合には、これを回避するため、
一層操作の煩雑と分析に要する時間が増大する。
水溶液系での操作の煩雑さを解消するために、いわゆる
ドライケミストリーが開発された。ドライケミストリー
が開発された。ドライケミストリーによる多層一体型分
析要素は特公昭１３−２　／６７７号、特開昭ｌｌ−１
４１Ｌｔ３１１．号等に記載されている。ピルビン酸オ
キシダーゼを用いトランスアミナーゼ活性をドライケミ
ストリーにより測定する多層分析要素は特開昭７７−／
弘≠タタを号に記載されている。今日臨床化学検査にお
ける分析法においては迅速性、簡便性とともに、種々の
干渉物質による影響の少いことが望まれる。
干渉物質の一つに内因性ピルビン酸がある。
ヒト血液（血清、血漿又は全血）中のピルビンｅ　（７
）　濃１ｆｉは、正常値でＯ，Ｊ　〜０．ｔｍ９／ｄｔ
であるが、異常高値で２■／ｄｔ以上になることが知ら
れている。血中ピルビン酸は重症肝硬変症、肝性昏睡、
尿毒症等の疾患で上昇する。管理血清中にもピルビン酸
含有量の高いもの（，２ｍ９／ｄ／。
以上）がある。
公知の、例えば前記特開昭！７−／≠≠タタ６号に記載
されたトランスアミナーゼ多層分析要素で比較的短時間
（例えばｉｏ分以下）に分析を行おうとする場合、被検
体中に存在する（内因性）ピルビン酸により誤差音生じ
る。
〔発明の目的〕
本発明の目的は、分析操作を煩雑にすることなく、また
分析に要する時間を増長させることなく内因性ピルビン
酸の干渉による誤差を少くした多層分析要素を提供する
ことにある。
〔発明の構成〕
上記目的は本発明、すなわち水平浸透性光透過性支持体
上にピルビン酸オキシダーゼ全少くとも含む試薬層及び
多孔性展開層がこの順に一体に積層されている多層分析
要素であって、多孔性展開層の空隙体積が３μＬ／ｃｒ
ｎ２から１５μｌ／ｃｍ２であることを特徴とするもの
により達成された。
ここで言う空隙体積とは、多孔性展開層の厚みに空隙率
を乗じたものであり、多孔性展開層単位面積当りの空隙
体積により表わされる。
本発明によれば、内因性ピルビン酸による発色反応全測
定初期に終了させることにより内因性ピルビン酸の干渉
による分析誤差を極めて少くすることができる。
本発明の分析要素の光透過性水平透過性支持体としては
、ポリエチレンテレフタレート、セルロースエステル（
セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、
セルロースアセテートプロピオネートなど）、ポリカル
ボネート、ポリメチルメタクリレートなどのフィルム類
やガラス板など厚さ約ｊＯμｍから約ｘｍまでの公知の
水工ｒＪ透性透明支持体を用いることができる。
上記の透明支持体にカーボ゛ンブラック、酸化チタン、
フタロシアニン銅等の顔料全分散したものや、離型紙等
の不透明支持体も使用することができる。この場合には
、分析反応終了後、支持体をはく離した後で、以後の測
定を行なう。
支持体の表面には、必要に応じて公知の下塗層または接
着層を設けて支持体の上に設けられる吸水層、試薬層等
と支持体との接着を強固にすることができる。
本発明で試薬層はビルジン酸オキシダーゼを含む試薬組
成物が通常ポリマーバインダーとしてのゼラチン中また
はゼラチンと他の親水性ポリマーとの混合物中に実質的
に一様に溶解又は分散されている吸水性で水浸透性の層
である。
試薬層に用いられるゼラチンとしては、アルカリ処理ゼ
ラチン、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチンのほかゼラ
チン誘導体も用いることができる。
試薬層のバインダーとしてはゼラチンと相溶性のある親
水性ポリマーの適宜なｉｔゼラチンに混合して用いるこ
とができる。用いうるポリマーの具体例として特開昭！
ター／７／♂６≠、特開昭２０−／／ｊＩ！り等に開示
のアガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリ
ルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン等をあげることができる。
試薬層にはさらに、前記ピルビン酸オキシダーゼによっ
て発生した過酸化水素を検出する指示薬が含有される。
過酸化水素検出指示薬としては、ペルオキシダーゼ又は
同等の作用をもつ物質および、過酸化水素とペルオキシ
ダーゼ又は同等の作用をもつ物質との存在下で検出可能
な変化を生ずる指示薬が有用である。検出可能な変化と
しては、呈色又は変色、螢光などが利用できる。
このような過酸化水素検出指示薬としては、例えば特開
昭弘ター！３♂♂ｒ号、特開昭！ｌ−μ０／り１号、特
開昭３３−１３１０１９号、’ＦＲＪ昭ｊよ一／２４Ｌ
≠タタ号に記載されたものを適用することができる。
ペルオキシダーゼ又は同等の作用をもつ物質としては、
％開昭ｊＯ−／３７／り２に開示されている諸種の生物
から抽出されたペルオキシダーゼ、合成ペルオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ様作用を示す生物から抽出された
他の化学物質をあげることができる。これらのうちでは
ペルオキシダーゼが好ましく、ペルオキシダーゼはＰＯ
Ｐの／Ｕに対して０．３ＴＪからｔＵ、好ましくはｏ、
ｔＵから２Ｕの範囲の割合で用いることができる。
呈色指示薬として、特公昭６１−２１２７７号（第２欄
）に引用されているようなトラインダー試薬、特開昭ｊ
ター！；４１９４２号に記載されているトラインダー試
薬を改良した指示薬組成物あるいは特開昭３３−２４／
♂♂号、特開昭よター／り３３！コ号に記載されたロイ
コ色素は有用である。
試薬層の乾燥時の厚さは約３μｍから約！θμｍ、好ま
しくは約！μｍから約３０μｍの範囲、被覆量では約３
ｆ／ｍ２から約！０９／ｍ２、好ましくは約！ｔ／ｍ２
から約３０９７ｍ２の範囲である。試薬層には分類のｐ
Ｈ緩衝剤、有機カルボン酸、酸性ポリマー、塩基性ポリ
マー等全含有させて分析操作時のｐＨ′ｔ−調節するこ
とができる。
さらに試薬層には分類の媒染剤、ポリマー媒染剤等を含
有させることができる。試薬層は実質的に透明であるこ
とが好ましいが、必要に応じて試薬層中に二酸化チタン
微粒子、硫酸バリウム微粒子、カーボンブラック等を少
量分散含有させて光学的性能を調節することができる。
本発明に用いられるピルビン酸オキシダーゼ（以下ＰＯ
Ｐという。）はピルビン酸、無機燐酸および酸素からア
セチル燐酸、二酸化炭素および過酸化水素を生じる反応
を触媒する酵素であればいずれでも用いることができ、
好ましくはベデイオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ
）属に属する閑、ストレプトコック／＜　（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌、アエｏコックス（Ａ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓｌ属に属する菌を培養して得られる
ＰＯＰである。
ＰＯＰ’に採取する方法については例えば前述の特開昭
６！−／３０ｔｌ明細舊に開示されており、またＰＯＰ
は市販されていて、市販品として入手もできる。また特
開昭ｊター／６２ｇ７７号に記載されたピルビン酸オキ
シダーゼも有用である。
燐酸源化合物としては燐酸イオンＰＯ４３ｅ、酸性ｔｖ
水素ｗ含ｂｔｔ酸イオ：／１ｎｐｏ４ｚｅ、Ｈ２ＰＯ４
ｅｌ、それらの酸、またはそれらの塩を用いることがで
きる。加水分解して燐酸イオンまたは酸性の水素を含む
燐酸イオンを生成しうる燐酸エステルまたは錯体をも用
いることができる。燐酸源化合物の具体例としては燐酸
（Ｈ３ＰＯ４）、燐酸三ナトリウム、燐酸水素二ナトリ
ウム、燐酸二水素ナトリウム、燐酸三カリウム、燐酸水
素二カリウム、燐酸二水素カリウム、燐酸水素アルミニ
ウム、燐酸水素カルシウム、燐酸マガジン、燐酸水素マ
ンガン、燐酸水素マグネシウム、燐酸水素鉄、燐酸水素
コバルトがあげられる。燐酸源化合物は燐酸塩緩衝液と
して用いることもできる。これら燐酸源化合物は試薬層
に限らず、展開層、あるいは展開層と試薬層の中間に設
けられる他の層（たとえば接着層、光通へい層）に含有
させてもよい。燐酸源化合物はＰＯＰの／ＴＪ（３７°
Ｃで７分間に／μｍｏｌｅの過酸化水素を生成する活性
を／単位（Ｕ）とする。）に対して燐酸イオンに換算し
て０−１１１ｍ０１ｅから’　０　μｍｏｌｅ　、好ま
しくはＯ１３μｍｏｌｅから！μｍｏｌｅの範囲の割合
で用いることができる。
本発明において、試薬層にはピルビン酸オキシダーゼ（
ＰＯＰと略記する）（＋−必須に含むほか、補酵素を含
有することが好ましい。例えばチアミン−ビロリン酸（
ＴＰＰと略記する）あるいはフラビンアデニンジヌクレ
オチド（ＦＡＤと略記する）を含有することができる。
フラビンアデニンジヌクレオチド（以下、ＦＡＤと略記
する。）はＰＯＰの／Ｕに対してｏ、ｉｎｍｏｌｅから
ｊ　Ｏｎ　ｍｏｌｅ　、好ましくは０．３層ｍｏｌｅか
らＪＯｎｍｏｌｅの範囲の割合で用いることができる。
チアミンピロホスフェ−ｈ（ＴＰＰ）としてはチアミン
二燐酸（ＴＤＰ）またはチアミン三燐酸（ＴＴＰ）を用
いることができるが、好ましくはチアミン三燐酸である
。チアミンピロホスフェートはＰＯＰの／’［Ｊに対し
てｊｎｍｏｌｅから２００ｎ　ｍｏｌｅ　、好ましくは
１０ｎｍｏｌｅから３００ｎｍｏｌｅの範囲の割合で用
いることができる。
これらの補酵素は試薬層に限らず、展開層や展開層と試
薬Ｊ−の中間に設けられる他の層（たとえば接着Ｊ−１
光遮へい層）に含有させてもよい。
さらにコ価または３価の金属イオン−１ＰＯＰとともに
存在させることによりＰＯＰの活性全活性化することが
できる。その具体例としてはＣａ２■、Ｃｏ２■、Ｍｇ
２■、Ｍｎ２ｅ％Ａ６３のがある。これらの金属イオン
は、これらの金属イオンを含みこれらの金属イオンを放
出することができる塩または錯体として用いることがで
きる。−価または３価の金属イオンを含む塩として燐酸
塩または燐酸水素塩を用いる場合には燐酸源化合物とコ
価または３価の金属イオンとを共通の一化合物でまかな
うことができる。２価゛または３価の金属イオン金倉む
塩の例として塩化物、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、硫酸水
素塩、燐酸水素塩、炭酸塩、炭酸水素塩、酢酸塩をあげ
ることができる。好ましい金属塩の具体例として塩化マ
ンガン（■）、燐酸マンガン（■）、燐酸水素マンガン
（■）、塩化マグネシウム（■）、燐酸水素マグネシウ
ム（Ｉ［）があげられる。コ価または３価の金属イオン
はＰＯＰの／Ｕに対してＪ′ｎｍ０１ｅから／　Ｏｎｍ
ｏｌｅ　、好ましくは１０ｎｍｏｌｅからｊｎｍｏｌｅ
の範囲の割合で用いることができる。
展開層としては特開昭１３−／Ａ≠３５６、特開昭Ｊ−
７−Ａｔ３！り等に記載の織物展開層（例、ブロード、
ボブリン等の平織等）、特願昭ｒ！Ｐ−７り／ｊ１等に
記載の編物展開層（例、トリコット編、ダブルトリコッ
ト編、ミラニーズ編等）、特開詔ｊ７−／弘ｒλｊＯに
記載の有機ポリマー狽維パルプ含有抄造紙からなる展開
１ｉ、特公昭ｊ３−２１乙７７、米国特許３．り？λ、
ｉｒｒ等に記載のメンブランフィルタ（ブラツンユポリ
マ一層）、ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ
、珪藻土が親水性ポリマーバインダーに保持されてなる
連続微空隙含有多孔性層等の非繊維等方的多孔性展開層
、特開昭ｊ！−タＯ♂！りに記載のポリマーミクロビー
ズが水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着さ
れてなる連続微空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構
造物層）からなる非ｇ１．維寺方的多孔性展開ｌ−等金
用いることができる。トリコット編物又は織物全カレン
ダー処理したものを用いることもできる。
これらの多孔性展開層のうちで酵素金倉む試薬組成物を
展開層中に含有させる場合には、試薬組成物を展開層中
に保持させやすい点で織物展開ノー、編物展開層に代表
される繊維質展開１層が好ましい。
多孔性展開層に用いられる織物生地または編物生地は特
開昭５７−１．Ａ３！りに記載のグロー放電処理または
コロナ放電処理に代表される物理的活性化処理を布生地
の少なくとも片面に施すか、または特開昭３１−／Ａ≠
３！６、特開昭１７−６６３！り等に記載の水洗脱脂処
理、親水性ポリマー含浸等親水化処理、またはこれらの
処理工程全適宜に組み合せて逐次実施することによシ布
生地を親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接着
力を増大させることができる。
試薬層と展開層との間に色遮蔽層または光反射Ｉ合金膜
けることができる。色遮蔽層または光反射層は光遮蔽性
または光遮蔽性と光反射性を兼ね備えた二酸化チタン微
粒子または硫酸バリウム微粒子等の白色微粒子をゼラチ
ン等の親木性ポリマーバインダーに分散含有してなる乾
燥時の厚さ約２μｍから約２Ｏμｍの範囲の層である。
さらに試薬層、色遮蔽層まだは光反射層の上には展開層
を強固に接着一体化する目的でゼラチンなどの親水性ポ
リマーからなる接着層を設けることができる。接着層の
転層時の厚さは通常約Ｏ３ｊμｍから約ｊμｍの範囲で
ある。
多孔性展開層には、分析の目的に応じて種々の基質を含
むことができる。例えばアラニントランスフェラーゼ（
ＡＬＴと略記する）活性測定を目的とする場合にはＬ−
アラニン及びα−ケトゲルタール酸を、適当な緩衝剤と
ともに含有させる。
同様にアスビラギン酸アミントランスフェラーゼ（ＡＳ
Ｔ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＩ］）、グリ
セロホスホキナーゼ（ＧＫ　）　、クレアチニンホスホ
キナーゼ（ＣＫ）、ミオキナーゼ等の活性測定が目的の
場合にも、それぞれの酵素に対する基質全それぞれの共
役酵素とともに展開層に含有させることができる。、こ
れらの基質とｔ孝素については特開昭よよ−／３０ｔ１
号に記載されている。これらの基質や共役酵素、緩衝剤
は展開層に限らず試薬、４−に含有させてもよいし、展
開層と試薬層の間に設けられた他の層にぎませることも
できる。
展開１−にはこのほか、親水性ポリマー、界面活性剤、
光通へい組成物（たとえば酸化チタン分散物）、ＰＯＰ
活性活性色剤て働く２価又は３価の金属の１″９′！！
−含むことができる。
ピルビン酸オキシダーゼの活性に適するｐ　Ｈは約Ａ、
ｔ〜？、０と言われている。
本発明の試薬層及び／またはそれ以外の層（たとえば展
開ノー、展開１−と試薬層の間にある層、たとえば接着
層、光通へいｆｆＩ）には、ピルビン酸オキシダーゼの
活性全維持するｐＨを実現する緩衝剤を含むことができ
る。緩衝剤としては例えばリン酸緩衝液、トリス−塩酸
緩衝液、Ｇｏｏｄの緩衝液等に相当する組成物を用いる
ことができる。
本発明の試薬層は単一の１蛤から成り立ってもよいが、
また２以上の層を有してもよい。２以上の層を有する場
合、そのうちの１層にピルビン酸オキシダーゼ及び必要
に応じてその補酵素、賦活剤あるいは燐酸源を含み、池
の／、＋−に過酸化水素検出試薬層（通常ペルオキシダ
ーゼ金倉む）を含んでもよい。
試薬層、色遮幣層または光反射層、接着層、展開層等に
は界面活性剤、例えばノニオン性界面活性剤全含有させ
ることができる。ノニオン性界面活性剤の具体例として
、ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ｐ
−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキ
シエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート、ｐ−ノニルフェノキシポリグリ
シドール、オクチルグルコシド等がある。ノニオン性界
面活性剤を展開層に含有させることにより水性液体試料
の展開作用（メータリング作用）がより良好になる。ノ
ニオン性界面活性剤を試薬層に含有させることにより分
析操作時に水性液体試料中の水が試薬層に実質的に一様
に吸収されやすくなり、また展開層との液体接触が迅速
にかつ実質的に一様になる。
本発明によると、内因性ピルビン酸濃度の比較的高い生
物体液、特に血ｉｋ検体として、一体型多層分析要素を
用いて各種のトランスアミナーゼ活性を反応速度法によ
り測定する際に、反応時間全殊更に長くしなくとも、内
因性ピルビン酸に基づく測定誤差を伴うことなく、酵素
活性測定を行うことができる。
〔実施例／〕
ゼラチン下塗ヲ施されている厚さｉｒｏμｍの無色透明
のポリエチレンテレフタレー）（ＰＥＴ）平滑フィルム
の上に、下記組成のアラニンアミントランスフェラーゼ
（以下ＡＬＴと略記）活性測定用試薬層を乾燥層厚が約
／ｊμｍになるように、水溶液の塗布（／　！　ＯＣｃ
ｉｍ２　）、乾燥により設けた。
ｍ２当り含１に ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　２０７サーフ
アクタントＩＯＧ　　　　　　　Ｏ，１？（オーリン社
製） はルオキシダーゼ　　　　　　　　／　！０ＯＴＪＦＡ
Ｄ　　　　　　　　　　　　　　　　２弘ηＴＰＰ　　
　　　　　　　　　　　　　ｉｏｏ〜ピルビン酸オキシ
ダーゼ　　　　／ｊ０００Ｕロイコ色素（下記構造）　
　　　　　　３ｏｏｙｎ９上記試薬層の上に下記組成の
接着層を、乾燥層厚的３μｍになるように、水溶液の塗
布（４０工／ｍ２）、乾燥によシ設けた。
ゼラチン　　　　　　　　　　　弘？／ｍ２サーファク
タントＩＯＧ　　Ｏ，１６２７１２次に接着層に約３０
９７ｍ２の割合で水を全面に供給して湿潤させたのち、
ポリエステル製のブロード織物（空げき体積り、ざμｔ
／ｍ２）を、軽く圧力をかけてラミネートし、乾燥させ
た。
こうして作成した展開層に、下記の組成になるように試
薬を水溶液としてほぼ均一に浸透させ（／　００ｃｊ：
／ｍ２）、乾燥して、ＡＬＴ活性活性測定用−１析要素
を製作した。
トリスヒドロキシメチル　　　ｏ、２２？／ｍ２アミノ
エタン リン酸／カリウム　　　　　　０．Ｉｉｊ？／ｍ２α−
ケトゲルタール酸　　　　　０．≠７／ｍ２メトローズ
ＹＯ８Ｈ１０００，１７１７ｍ２（信越化学■製） 酸化チタン（ルチル型）　　　　　　　　７９／ｍ２Ｌ
−アラニン　　　　　　　　　　　３７／ｍ２塩化マグ
ネシウム　　　　　　０．２≠７７ｍ２アスコルビン酸
オキシダーゼ　／ｒ０００ＴＪ／ｍ２〔比較例／〕 多孔性展開層として、ポリエステル製トリコット布（空
げき体積２０μｌ　／　ｃｍ２　）を用いたほかは実施
例／と同様にして、比較用ＡＬＴ活性測定要素を製作し
た。
〔到定例１〕 前記実施例／及び比較例／のＡＬＴ活性測定用多層分析
要素の展開層の上に、第１表に示すような僅のピルビン
酸を含有する７４Ｈ８ｋ　（ヒト血清アルブミン）１０
μｍ１点着し、密閉容器中で３７°Ｃに保ち、ピルビン
酸による試薬層の呈色が飽和に達する時間を測定した。
第１表 実施例／　　　　　’Ｉ−０秒　１００秒　１分　　１
分比較例１　　　　１分　　２分　２分　１０分、　第
１表から明らかなように、本発明の多層分析要素は検体
中のピルビン酸の消費が非常に速いことがわかる。すな
わち内因性ピルビン酸の影響を避けるのに適しているこ
とがわかる。
〔測定例コ〕
実施例／及び比較例１のＡＬＴ活性測定用分析要素の各
々の展開層の上に、第２表に示すようにピルビン酸含有
量のみ異なる弘様の管理血清（全てＡＬＴ活性ｊコＵ／
Ｌ）を７０ノｔ、ｌ一点着し、密閉容器中で３７°Ｃに
保ちなから２０秒おきに試薬層の発色を反射測光した。
２分後から３分後までの測定値と検量線（予め求めであ
る）からＡ　ＬＴ活性金求めた結果を第２表に示す。表
中の数値はＡＬＴ活性測定値（Ｕ／ｌ　）である。
第２表 実施例／　　　　　　　！２　　ｊコ　　ｊ／　　　ｒ
／比紋例／　　　　　　　　！Ｏｊ、２　　　！Ｉ　　
　ｔり第第λ表に見られるように、比較例の分析要素で
は内因性ピルビン酸によるＡＬＴ活性値の正の誤差全学
するのに灯し、本発明の実施例／の分析要素では、ｒｏ
ｏμＭという高ａ度の内因性ピルビン酸の存在下でも、
ノ＼ＬＴ活性測定の誤差音生じない。
〔実施例２〕 実施例／のＬ−アラニンの代りにアスパラギン酸？用い
、オキザロ酢酸デカルボ′キ７ラーゼを／ｊ　０００　
ＴＪ　／ｌｎ２になるよう多孔性展開層に浸透させた以
外実施例／と同様にして、アスパラギン酸アミントラン
スフェラーゼ（ＡＳＴ）活性測定用多心分析要素を製作
した。
比較のために、多孔性展開層としてポリエステル繊維製
トリコット布（空げき体積２０μｌ　７ｃｍ２　）金柑
いたほかは、本実施例の分析要素と同様にして比較用の
ＡＳＴ活性活性測定用−分析要素を製作した（比較例λ
とする）。
このようにして得られた本発明実施例３及び比較用の分
析要素のそれぞれ展開層に、第３表の如くピルビン酸含
量のみ異なる≠種の管理血清（ＡＳＴ活性７２Ｕ／Ｌ）
ｉｏムを全点着し、密閉容器中で約３７°Ｃに保ち、１
０秒おきに試薬層の発色を反射測光した。２分後から３
分後の間の測定値と検量線から、検体のＡＳＴ活性金求
めた結果を第３表に示す。
第３表よシ明らかなように、比較例λの多層分析要素で
は明らかに内因性ピルビン酸による正の誤差を生じるが
、本発明実施例コは夕ＯθμＭの如き高ａ度の内因性ピ
ルビン酸の存在下でもＡＳＴ活性測定の誤差を生じない
。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）水平浸透性光透過性支持体上に試薬層および多孔
    性展開層をこの順に少なくとも有し、試薬層には過酸化
    水素の作用を受けて検知可能な物質を生成する試薬組成
    物を含み、試薬層または試薬層と多孔性展開層の間に任
    意に設けられる他の層にピルビン酸オキシダーゼを含み
    、液体中の酵素活性測定に適する多層分析要素であつて
    、多孔性展開層の空隙体積が３μｌ／ｃｍ＾２から１５
    μｌ／ｃｍ＾２までであることを特徴とする多層分析要
    素。
  2. （２）水平浸透性光透過性支持体上に試薬層および多孔
    性展開層をこの順に少なくとも有し、試薬層には過酸化
    水素の作用を受けて検知可能な物質を生成する試薬組成
    物およびピルビン酸オキシダーゼを含み、液体中の酵素
    活性測定に適する多層分析要素であつて、多孔性展開層
    の空隙体積が３μｌ／ｃｍ＾２から１５μｌ／ｃｍ＾２
    までであることを特徴とする特許請求の範囲（１）の多
    層分析要素。
  3. （３）前記試薬組成物がペルオキシダーゼ又は同等の作
    用をもつ物質、及びペルオキシダーゼ又は同等の作用を
    もつ物質と過酸化水素との存在下で検出可能な変化を生
    ずる試薬である特許請求の範囲（１）の多層分析要素。
  4. （４）前記試薬層又は試薬層より支持体から遠い層にさ
    らにトランスアミナーゼ基質が含まれている特許請求の
    範囲（１）の多層分析要素。
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