JPS614960A - 分析試薬および多層化学分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な過酸化水素分析用の試薬、これを用いる
過酸化水素の分析方法、これを用いるペルオキシダーゼ
の分析方法、およびこれを含む多層化学分析要素に関す
るものである。さらに詳しくは、過酸化水素の存在下、
ペルオキシダーゼなど酸化作用を有する物質が触媒とし
て働き、呈色する新規な発色体、これを用いる過酸化水
素の比色定量方法、およびこれを含む過酸化水素または
過酸化水素を生成しうるアナライト（被検体）の定量分
析またはペルオキシダーゼ活性の定量分析に適した多層
化学分析要素に関するものである。

（従来の技術） 近年、臨床検査における酵素学的分析方法は、その特異
性が高く評価され、急速に普及しつつある。それらのう
ち、尿および体液中のグルコース、尿酸、コレステロー
ル、トリグリセリド、乳酸、クレアチニン、遊離脂肪酸
、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、グルタ
ミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、コリンエステ
ラーゼ、タレアチンホスホキナーゼ、乳酸脱水素酵素な
どを測定する方法としてそれぞれの系における最終的に
定量すべき物質の酸化酵素を作用させて生成した過酸化
水素を定量することにょシ、目的物を定量する方法がし
ばしば用いられている。

過酸化水素の定量方法としては、例えば特開昭５０−１
１５８−９２、特開昭５３−１１０８９７、特開昭５４
−２５８９２、特開昭５５−２０４７１、特開昭５５−
９２ｆｉ９６、特開昭５５−１２１１４９、特開１’１
８５’５．−１３１４００、特開昭５６−３７５５７、
特開昭５６−３９０７２、特開昭５６−４２５９９、特
開昭５７−１４２５６２、特開昭５７−１５０３９９等
の各明細書に開示の方法が知られている。これらの方法
はペルオキシダーゼの存在下に、ｏ　−トリ’）＝ｙ、
２＋７−ジアミノフルオレン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ−
フェニレンジアミン、０−ジアニシジン、０−アミンフ
ェノール、等の色原体を酸化型の発色体に変化させて比
色定１１する方法、４−アミノアンチピリンとフェノー
ル又はＮ、Ｎ−ジアルキルアニリンあるいはＮ、Ｎ−ジ
アルキルトルイジンとの組合せ、３−メチル−２−ベン
ゾチアゾリノンヒドラゾンとｏ−トリジン又はＮ、Ｎ−
ジメチルアニリンあるいはＮ、Ｎ−ジエチルアニリンと
の組合せ、あるいは二量体を形成する４−メトキシ−１
−ナフ）　−ル及びその誘導体等の色原体を酸化縮合さ
せて発色体として比色定量する方法等である。

これらの化合物では、１モルの発色体（色素）を形成す
るために２モルの過酸化水素を必要とするが、本発明者
らは１−Ｔニルの過酸化水素で１モルの色素を形成しう
る過酸化水素定量用試薬、その試薬を用いた過酸化水素
又はにルオキシダーゼの分析方法、及びその試薬を含む
試薬層を有する多層化学分析要素を発明し、その内容を
特許出願した（特願昭５８−６８００９号）。

（発明が解決しようとする間頭点〕 前述の各化合物の場合には１モルの発色体を形成するた
めに２モルの過酸化水素を必要とするため、微量成分の
定量にとって、不利な方法である。

それ故１モルの色素を形成するために、１モルだけの過
酸化水素で十分な過酸化水素定量用試薬が望まれていた
。

本発明の目的は、前記先願の試薬に加え、ペルオキシダ
ーゼの触媒作用または関与の下に１モルの過酸化水素で
１モルの色素を形成しうる、新たな高感度の過酸化水素
定量用試薬、その試薬を用いる過酸化水素の定量方法、
およびその試薬を含む試薬層を有する過酸化水素定量用
多層化学分析゛要素を提供することである。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、下記一般式〔１，ｌで表わされる化合物を
用いることにより前記の目的が達成されることを見出し
た。

Ｊ 一般式〔１〕において、 Ｒ１およびＲ２はアリール基または置換アリール基を表
わし、両者は同じでも異なってもよい。

Ｒ３は２−−１．たは３−ピロリル基、置換２−’！：
たは３−ピロリル基、２−または３−インドリル基また
は置換２−または３−インドリル基を表わす。

一般式〔１〕において、Ｒ，Ｒで表わされる置換アリー
ル基の置換基としてはハロゲン原子（塩素原子、臭素原
子など）、シアノ基、アルコキシ基、モノアルキルアミ
ノ基、ジアルキルアミノ基などの置換基を１個、又は同
種又は異種のこれらの置換基を２個以上有してもよい。

Ｒ，Ｒで表わされる置換基の好ましい具体例は、フェニ
ル基、４−メトキシフェニル基、４−エトキシフェニル
基、４−（ジメチルアミノ）フェニル基、４−（ジエチ
ルアミノ）フェニル基等である。Ｒで表わされる置換−
２−または３〜ピロリル基、置換−２〜または３−イン
ドリル基の置換基としては、ハロダン（塩素原子、臭素
原子等）、シアノ基、アルキル基、置換アルキル基、ア
リール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基
、スルホンアミド基、アルコキシ基、アルコキシカルボ
ニル基、アリールオキシ基、モノアルキルアミノ基、ジ
アルキルアミノ基、カルバモイル基、Ｎ−アルキルカル
バモイル基、アルキルスルホニル基、スルファモイル基
等の置換基よシ選ばれ、１個又は同種または異種のこれ
らの置換基を２個以上有することができる。これらの置
換基の中では合成のし易さ、特性面よジアリール基、ハ
ロゲン、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基が好ましい
。了り−ル基トシてはフェニル基、ヒドロキシフェニル
基、アルキル基としてはメチル基、エチル基、アルコキ
シ基としてはメトキシ、エトキシが好ましい。

Ｒ３で表わされる置換基の好ましい具体例は、２−ビロ
リル基、３−インドリル基、２−りＩ２１：１−３−イ
ンドリル基、５−クロロ−３−インドリル基、５−シフ
／−３−インドリル基、５−二）ｏ−３−インドリル基
、２−フェニル−３−インドリル基、２−メトキシカル
ボニル−３−インドリル基、２−エトキシカルボニル−
３−インドリル基、５−メドキシカルボニル−３−イン
ドリル基、５−エトキシカルボニル−３−インドリル基
等である。

次に、一般式（１）で表わされる化合物の好ましい具体
例を示すが、本発明に用いられる化合物はこれらの化合
物のみに限定されるものではない。

なお、以下の式でＭｅけメチル基を。Ｅｔはエチル基を
、Ｐｈはフェニル基を表わす。

一般式〔１〕で表わされる新規化合物は米国特許第２９
７７１０号に記載されている方法に従って一成すること
ができる。次に一般式〔１〕で表わされ化合物の合成例
を示すが具体的に示されていな化合物も以下の合成例に
準じて容易に合成するとかできる。

成例、１ 化合物（４）２−（２−フェニル−３−インド、リル）
　−４，５−ジ〔４−（ジメチルアミノ）フェニルコイ
ミダゾールの合成 ビス（ｐ−（ジメチルアミノ）フェニル〕エタジオン２
．２Ｉ！、２−フェニル−３−ホルミルイトール２．８
．？、酢酸アンモニウム５１Ｉを氷酢酸１７ｍｔ中で２
時間加熱還流して反応させた。冷却後、水１５０ｄｓア
ンモニア水２０−の混合液に滴下したところ、黄緑色の
結晶が析出した。析出した結晶を戸取し、水洗、乾燥後
、ベンゼン−酢酸エチルエステル（１：１）で再結晶し
て化合物（４）が３．９ｇ得た。融点２２８〜２３］１
合成例２ 化合物（７）２−（５−クロロ−３−インドリル）−４
，５−ジ〔４−〔ジメチルアミノ）フェニルクイミダゾ
ールの合成 ビスＣｐ−（ジメチルアミノ）フェニル〕エクンジオン
２．２ｇ、５−クロロ−３−ホルミルインドール２．５
１１．酢酸アンモニウム５ＩＩを氷酢酸１７ｄ中で２時
間加熱還流して反応させた。冷却後、水１５０−とアン
モニア水２０−の混合液に滴下したところ、黄緑色の結
晶が析出した。析出した結晶を戸数し、水洗、乾燥後、
ベンゼン−酢酸エチルエステル（１：ｌ）で再結晶して
化合物（７）を得た。融点１７９〜１８２℃ 本発明の過酸化水素分析用試薬と過酸化水素との反応（
呈色反応）は例えば〔２〕式によシ表わされる。

４ルオキシダーゼには特公昭５６−４ｓｓｆｆｉｃ＋号
、特公昭５７−５５２０等に開示の植物起源および動物
起源のペルオキシダーゼ（Ｅ　Ｃ１，１１，７）、およ
び特開昭５７−９９１９２等に開示の微生物起源のペル
オキシダーゼ（ＥＣ１，１１，７）のうちから適宜に１
種または２種以上を組合せて用いることができる。

植物起源のペルオキシダーゼの例として、西洋わさび、
じゃがいも、いちじく樹液、かぶ、゛だいこんから抽出
されたペルオキシダーゼを、動物起源のペルオキシダー
ゼの例として、牛乳から抽出されたラクトペルオキシダ
ーゼ、白血球から抽出されたベルトペルオキシダーゼを
、微生物起源のペルオキシダーゼとしてＡｌｔａｒｒｉ
ａｒｉａ属、Ｃｏｃｈ１ｉｏｂｏ１ｕｇ属−１Ｃｕｒｖ
ｕｌａｒｉａ属）Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ属に属し非
特異的ペルオキシダーゼ生産能を有する微生物起源のペ
ルオキシダーゼを、それぞれあげることができる。

これらのうちで植物起源または微生物起源の非特異的ペ
ルオキシダーゼが好ましい。

なお、ペルオキシダーゼ活性を有する無機化合物、例え
ば、特公昭５６−４５５９９、特公昭５７−５５２０等
に開示のチオシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フェロシアン
化鉄（いずれも鉄（＋２）化合物）、クロム硫酸カリウ
ム、沃化ナトリウム、沃化カリウム、モリブデン酸アン
モニウム、モリブデン酸カリウム等をペルオキシダーゼ
のかわシに用いることもできる。

本発明において、定量試薬として一般式ωで示されるイ
ミダゾール誘導体およびペルオキシダーゼのほかに、さ
らに酸化酵素を組合わせることによって、よシ広い範囲
への応用が可能となる０すなわち、最終的に定量すべき
物質が酸化酵素の作用により過酸化水素を生成する場合
に、酸化酵素を本発明の試薬系に組み合わせることによ
って、生成する過酸化水素を定量して目的とする種々の
物質を定量することが可能になる。具体的には、尿およ
び体液（例、血液）の中のグルコース、尿酸、コレステ
ロール、トリグリセリド、乳酸、クレアチニン、遊離脂
肪酸、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、グ
ルタミン酸オキザロ−酢酸トランスアミナーゼ、コリン
エステラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、乳酸脱水素
酵素などを測定することができる。これらの測定に用い
る酸化酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ウリカ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ、Ｌ−α−グリセロ
燐酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシμゼなどが挙げら
れる。これらの酸化酵素はいかなる起源のものでもよい
〇 本発明の過酸化水素分析用試薬は、各成分をそれぞれ別
個の固体（粉末または顆粒など）として、あるいは水溶
液、水懸濁液または緩衝水溶液として調製し、使用時、
すなわち被検試料を定量分析する操作の際にこれらの形
の成分を組みあわせ混合して使用することができ、また
各成分の固体（粉末または顆粒など）の混合物、あるい
は全成分を含む水または緩衝水溶液（または懸濁液）と
してあらかじめ調製しておいて使用することもできる。

全成分を含む溶液または懸濁液として用いる場合には各
成分を同時にあるいは適宜な順序で溶解して全成分を含
む水または緩衝水溶液（または懸濁液）を調製すること
ができる。

本発明の過酸化水素分析用試薬を水溶液またけ水ｉ’ａ
ｍ液として用いる場合には、一般式（１）で表わされる
イミダゾール誘導体の溶媒（例、アセトン、ジメチルホ
ルムアミド、メタノール、エタノール等）、界面活性剤
（好ましくはノニオン性界面活性剤、例、ポリオキシェ
チレンアルキルフェニルエーテタ等）を用いることが好
ましい。

本発明の過酸化水素分析用試薬の好ましい用途態様例と
して、特開昭４９−５３８８８、特開昭５０−１３７１
９２、特開昭５１−４０１９］、。

特開昭５５−９０８５９、特開昭５５−１６４３５６、
特開昭５７−６６３５９、実開昭５７−４２９５１等の
各明細書に開示されているような水不透過性光透過性支
持体の上に試薬層および多孔性展開層（または定面積多
孔性層）がこの順に設けられてなる一体型多層化学分析
要素（フィルムまたはシート）の試薬層の中に（ｔたは
必要にょシ設けられる他の層の中と試薬層の中に）本発
明の試薬の各成分を配合して含有させる態様がある。支
持体にはポリエステルＣ例、ポリエチレンテレフタレー
ト、ビスフェノールのポリカーボネート）、セルロース
エステル（例、セルロースジアセテート、セルロースト
リアセテート、セルロースアセテートグロピオ坏−ト、
セルロースアセテートグチレート、セルロースニトレー
ト）、ポリスチレン、光学ガラス等の近紫外部、可視元
部、近赤外部にかけて透明性のよい材料でできた厚さ約
ｌＯμｍから約Ｑ、５ｍｍ、好ましくは約２０μｍから
約０．３關までの板状物又はその積層物を用いることが
できる。

また、支持体としてシリコーン樹脂等の離型剤をごくう
すく塗布した前述の支持体又は他の支持体（紙、プラス
チック、金属箔等の半透明又は不透明な支持体をも用い
ることができる。）を用いると、保護の役目をし、測定
の際にはこれを剥がして除去してから測定することがで
きる。

試薬層としては特開昭４９−５３８８８、特開昭５３−
２ｆｉ１８８、特開昭５５−１６４３５６等に開示のゼ
ラチン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド等
の親水性バインダーの中に〔１〕で表わされるイミダゾ
ール誘導体および必要によシ組みあわされる酵素等が実
質的に均一に分散されてなる層、特開昭５６−８５４９
に開示の親水性バインダーの中に試薬を含有する疎水性
微小粒子が分散してなる層等があげられる。

多孔性展開層としては特開昭４９−５３８８８等に開示
のメンブランフィルタ（ブラッシーポリマ−Ｒ）；ポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水
性ポリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有
多孔性層、特開昭５ｓ−９ｏｓｓｂに開示のポリマーミ
クロビーズ、ガラスミクロビーズ等が水で膨潤しないポ
リマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微空隙含
有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）等の非繊維質
等方的多孔性展開層、特開昭５５−１６４３５６、特開
昭５７−６ｆｉ３５９等に開示の織物展開層、特願昭５
９−７９１５８に開示の編物展開層、特開昭５７−１４
８２５０に開示の有機ポリマー繊維パルプを含む抄造紙
からなる展開層等の繊維質多孔性展開層等があげられる
。

本発明の一体型多層分析要素には前述の諸特許明細書に
開示の検出層、光遮蔽層、光反射層、沖退治、半透膜層
、バリヤ層、拡散防止層（マイグレーション防止層）、
吸水層等やこれら単独の層を有する機能を二つ以上併せ
もつ層を組みこむことができる。一体型多層分析要素は
前述の諸特許明細書に開示の方法に従って製造すること
ができる。

本発明の一体型多層分析要素は特開昭５４−１５６０７
９、実開昭５６−１４２４５４、特開昭５７−６３４５
２、特表昭５８−５０Ｊ１４４等に開示のスライド枠に
収めて使用することが好ましい。この他の使用形態とし
て長いテープ状で、または透明収容部分またははさみこ
み部分を・ぐンチカードに収めて使用することもできる
。

本発明の分析方法は、例えば次のように実施することが
できる。被検試料に一般式〔０で表わされるイミダゾー
ル誘導体、および反応触媒としてのペルオキシダーゼを
前記の形で同時に、または適宜の順序で添加し、混合物
を５０から４０Ｃ１好ましくは２０℃から４０’Ｃの範
囲の温度および−３，０から９．０、好ましくはｐＨ４
，５から８．０の範囲において１分から６０分の時間範
囲において反応を進行させ、生成した色素を含有する反
応混合物の吸光度を測定する。あるいは前記の諸特許明
細書に記載された多層化学分析要素（フィルムまたはシ
ート）中に一般式〔０で表わされるイミダゾール誘導体
およびペルオキシダーゼを含有させ、その多孔性展開層
に約６μｌから約１５μｌの被検試料液、またはその定
面積多孔性層に約ｌＯμｌから約３０μｌの範囲内の一
定量の被検試料液を滴状に付着供給（以下、点着という
。）し、２０℃から４０℃、好ましくは２５℃から４０
℃の範囲の湿度で１分から２０分、好ましくは２分から
１０分の時間範囲でインクペーションし多層化学分析要
素の光学濃度を反射分光測光する。吸光度または反射光
学濃度の測定方法はｅｎｄ　ｐｏｉｎｔ法およびｒｅａ
ｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ法を適宜に選択して実施すること
ができる。

酸化酵素を併用する場合には、酸化酵素の作、用によシ
、Ｈ２Ｏ２をあらかじめ生成させてもよいが、Ｈ２Ｏ２
生成反応と発色反応を同時に進行させることが好ましい
。酸化酵素の使用量はその種類、目的とする基質、また
は混在物などに応じて適宜定められる。

本発明の分析方法は前述の式（２）の例にみられるよう
に、ペルオキシダーゼの触媒作用のもとて一般式〔１〕
で表わされるイミダゾール化合物と過酸化水素とが化学
量論に従って反応して色素を生成するので、試薬として
一般式〔１〕で表わされるイミダゾール化合物とＨ２Ｏ
２を組みあわせた試薬または両者を含む多層化学分析要
素に活性値が未知のペルオキシダーゼを含む試料を添加
または点着し生成する色素を測定することによ多試料中
のペルオキシダーゼ活性を分析または定量することがで
きる。

この方法はペルオキシダーゼを標識物質として用いた酵
素免疫測定法に利用できる。

本発明は人はかシでなく種々の動物、例えば家蓄、愛玩
動物、実験動物などの尿、体液（例、血液）などの過酸
化水素または過酸化水素を生成しうるアナライトの分析
にももちろん利用できる。

（作用及び発明の効果） 本発明の過酸化水素分析用試薬は１モルの過酸化水素か
ら１モルの色素が生成するので、被検試料から過酸化水
素を高感度で定量することができる。従って、本発明の
分析試薬、分析方法および多層化学分析要素はアナライ
トとして微量の過酸化水素（＝またけ過酸化水素を生成
しう不アナライト）を含む試料の過酸化水素の定量に特
に有利である。本発明の分析試薬は反応性が良好であシ
、この試薬を用いた分析方法は操作が極めて簡単である
。本発明の分析方法によれば大量の試料を短時間に処理
することができ、従って例えば臨床分析などに好適であ
る。

（実施例） 実施例１ （１）発色液の調製：化合物（４）１５ｍｇをアセトン
に溶解しベルオキシダーゼ５０００単位を−７，５の硼
酸塩緩衝水溶液に溶解し全容を２５−になるようにして
発色液を調製した。

（２）過酸化水素の定量：発色液３ｉを試料セルにとり
、濃度既知の過酸化水素２０μｌを加えて、ブランク（
過酸化水素水溶液のかわりに蒸留水を加えたもの）を対
照として３７ＣでｌＯ秒後６４０波長ｎｍで吸光度を測
定し次の結果を得た。

実施例２ ゼラチン下塗９層を有する厚さ１８５μｍの無色７　明
ｆ　’）エチレンテレフタレー）　（ＰＥＴ　）　フィ
ルムの上に次の成分からなる試薬層塗布液を塗布し乾燥
させた。

試薬層塗布液の成分（溶媒二適宜量の水〕ウリカーゼ　
　　　　　　　　　　　ｌ　５０　Ｕ／ｍ２化合物（４
）　　　　　　　　　　　　　　０．２Ｊ９／ｍ２ペル
オキシダーゼ　　　　　　　　２５００Ｕ／ｍ２ゼラチ
ン　　　　　　　　　　　　　１０．！ｉ’／ｍ２ｐＨ
８，５硼酸塩緩衝剤 孔性展開層としてセルロースアセテートメンブランフィ
ルタ−（最大孔径３．０μｍ１厚さ１８０８ｍ１富士写
真フィルム社製ミクロフィルターＦＭ−３００”）をラ
ミネートして一体化させて尿酸定量用多層化学分析要素
を調製した。

見られた多層化学分析要素を評価するために尿酸水溶液
（濃度６　；　１０　；　１２　ｆｎ９／ｄｌおよび尿
酸不含のブランク溶液）の各ｉｏμｌを多孔性展開層に
点着し、３７℃で２分インクペーションした後直ちにシ
アンフィルターを備えたマクベス反射分光光度計を用い
てＰＥＴフィルム側から発色光学濃度を測定波長６３０
　ｎｍ近傍で反射測光し、次の値をえた。

尿　酸　溶　液　　　　反射光学濃度 （濃度〃夕／１ｔｅ） ０（ブランク）　　　　　　　０・４工６　　　　　　
　　　　　　　１．０５１．０　　　　　　　　　　　
　　１．３３１２　　　　　　　　　　　　　１．４２
この結果から、この多層化学分析要素を用い、反射測光
によυ比色法によって尿酸濃度の定量を実施できること
が明らかＫなりた。

実施例３ ゼラチン下塗層を有する厚さ１８５μｍの無色透明ＰＥ
Ｔフィルムの上に次の成分からなる試薬層量化合物（７
）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０２５　、
！ｉ’／ｍ　２ゼラチｙ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１０＃／ｍ２４ルオキシダーゼ　　　　　　
　　　　　　　３０００　Ｕ／ｍ　２ｐＨＢ、　５硼酸
塩緩衝剤 試薬層の上に次の成分からなる光反射層塗布分散液を塗
布し乾燥させた。

二酸化チタン微粉末　　　　　　　　　　　　　　３ｇ
／ｒｎ２ゼラチｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１ｇ／ｍ”光反射層の上にさらに次の成分からなる妨
害物質排除層塗布液を塗布乾燥させた。

妨害物排除層塗布液の成分（溶媒：適宜量の水）アスコ
ルビン酸オキシダーゼ　　　　　　　　４０００　Ｕ／
’＋ｎ　２ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４１／ｍ２ｐｌ（８，５硼酸塩緩衝剤 このようにできあがった妨害物排除層を水で湿潤させて
おき、１００番手の綿糸から織られたブロード布（水洗
し脱脂された後乾燥された布）をラミネートし一体化さ
せて尿酸定量用多層化学分析要素を調製した。

ついで実施例２と同様にして既知の尿酸濃度に対する多
層化学分析要素の発色反射光学濃度値をえた。

尿　酸　溶　液　　　反射光学濃度 （濃度■／ｄｉ　） ０（ブランク）　　　　　　０２６ ６　　　　　　　　　　　　　０．６９１０　　　　　
　　　　　　　　０．９０１２　　　　　　　　　　　
　　０．９９実施例４ ゼラチン下塗９層を有する厚さ１８５μｍの無色透明Ｐ
ＥＴフィルムの上に次の成分からなる試薬層塗布液を塗
布し乾燥させて第二試薬層を形成した。

第二試薬層塗布液の成分（溶媒：適宜量の水）ペルオキ
シダーゼ　　　　　　　　　　　　　５０００Ｕ／ｒｎ
　２化合物（７）１ｇ／ｒｒ１２ ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　、
！ｉ’／ｒｎ　２オクチルフエノキシポリ　　　　　　
　　　　　０．１５１／ｍ　２エトキシエタノール （トリトンＸ−１００＠） ｐＨ６，５燐酸塩緩衝剤 この層の上に次の成分からなる光反射層塗布分散液を塗
布し乾燥させて光反射層を形成した。

光反射層塗布分散液の成分（分散媒：適宜量の水）二ば
′化チタン微粉末　　　　　　　　　　　　　　３ｇ／
ｒ１１２ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ｌ　ｇ／ｒｎ　２さらにこの層の上に次の成分からな
る試薬層塗布液を塗布し乾燥させて第一試薬層を形成し
た。

第一試薬層塗布液の成分（溶媒二適宜量の水）コレステ
ロールオキシダーゼ　　　　　　　　２０００Ｕ／ｎ１
２ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
ｇ７ｍ２オクチルフエノキシぼり　　　　　　　　　　
　　０．１９／ｍエトキシエタノール ｐＨ６，５燐酸塩緩衝剤 ついで第一試薬層を水で湿潤し、その上にセルロースア
セテートメンブランフィルタ−（最大孔径３．０μｍ１
厚さ１８０μｍ１富士写真フィルム社製ミクロフィルタ
ーＦＭ−３００■〕を軽く圧着ラミネートし一体化させ
て多孔性展開層を設け、コレステロール定量用多層化学
分析要素を調製した。

見られたコレステロール定量用多層化学分析要素を評価
するためにコレステロール含有コントロール血？ｌｆ（
コレステロール含有量５０　；　１００　；２００　；
　３００　；　５００■４１およびコレステロール不含
のブランク）の各１０μｌを展開層に点着し、３７℃で
１０分インクペーションし、直ちにシアンフィルターを
備えたマクベス反射分光光度計を用いてＰＥＴフィルム
側から発色光学濃度を測定波長６００　ｎｍで反射測光
し、次の値をえた。

０（ブランク）　　　　　　　　　　０・２６５０　　
　　　　　　　　　　　　　　０．４９１００　　　　
　　　　　　　　　　　　’０．６８２００　　　　　
　　　　　　　　　　０．９８３００　　　　　　　　
　　　　　　　　１．１８５００　　　　　　　　　　
　　　　　　１．４８この結果からこのコレステロール
定量用多層化学分析要素を用い、反射測光によυ比色法
によってコレステロール含有量の定量を実施できること
が明らかになった。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式〔１〕で表わされるイミダゾール誘導体か
   らなることを特徴とする過酸化水素分析試薬 ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕 一般式〔１〕において、 Ｒ＾１およびＲ＾２はアリール基または置換アリール基
   を表わし、両者は同じでも異なってもよい。 Ｒ＾３は２−または３−ピロリル基、置換２−または３
   −ピロリル基、２−または３−インドリル基または置換
   ２−または３−インドリル基を表わす。
2. （２）さらにペルオキシダーゼが組合せられてなる特許
   請求の範囲１に記載の試薬
3. （３）過酸化水素と一般式〔１〕で表わされるイミダゾ
   ール誘導体とを反応させて生成する色素を検出すること
   を特徴とする過酸化水素の分析方法 ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕 一般式〔１〕において、 Ｒ＾１およびＲ＾２はアリール基または置換アリール基
   を表わし、両者は同じでも異なってもよい。 Ｒ＾３は２−または３−ピロリル基、置換２−または３
   −ピロリル基、２−または３−インドリル基または置換
   ２−または３−インドリル基を表わす。
4. （４）前記反応をペルオキシダーゼの存在下で行わせる
   特許請求の範囲３に記載の方法
5. （５）前記色素の検出を比色により実施し、分析方法が
   定量分析法である特許請求の範囲３または４に記載の方
   法
6. （６）一般式〔１〕で表わされるイミダゾール誘導体と
   過酸化水素の反応をペルオキシダーゼを存在させて行わ
   せることを特徴とするペルオキシダーゼの分析方法 ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕 一般式〔１〕において、 Ｒ＾１およびＲ＾２はアリール基または置換アリール基
   を表わし、両者は同じでも異なってもよい。 Ｒ＾３は２−または３−ピロリル基、置換２−または３
   −ピロリル基、２−または３−インドリル基または置換
   ２−または３−インドリル基を表わす。
7. （７）水不透過性光透過性支持体、試薬層および多孔性
   展開層をこの順に設けられてなる多層化学分析要素にお
   いて、前記試薬層に一般式〔１〕で表わされるイミダゾ
   ール誘導体が含まれることを特徴とする多層化学分析要
   素 ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕 一般式〔１〕において、 Ｒ＾１およびＲ＾２はアリール基または置換アリール基
   を表わし、両者は同じでも異なってもよい。 Ｒ＾３は２−または３−ピロリル基、置換２−または３
   −ピロリル基、２−または３−インドリル基または置換
   ２−または３−インドリル基を表わす。
8. （８）前記要素の中にさらにペルオキシダーゼが含まれ
   る特許請求の範囲７に記載の要素
9. （９）前記多孔性層が多孔性展開層である特許請求の範
   囲７または８に記載の要素
10. （１０）前記多孔性層が定面積多孔性層である特許請求
    の範囲７または８に記載の要素