JPS63105695A - インシュリン前駆体のインシュリンへの変換法 - Google Patents
インシュリン前駆体のインシュリンへの変換法Info
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- JPS63105695A JPS63105695A JP62258166A JP25816687A JPS63105695A JP S63105695 A JPS63105695 A JP S63105695A JP 62258166 A JP62258166 A JP 62258166A JP 25816687 A JP25816687 A JP 25816687A JP S63105695 A JPS63105695 A JP S63105695A
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- Japan
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- human insulin
- metal ion
- insulin precursor
- amino acid
- nickel
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はインシュリン前駆体のインシュリンへの変換方
法、更に詳しくはヒトインシュリン前駆体のヒトインシ
ュリンへの変換方法ならびに該方法により製造されたヒ
トインシュリンに関する。
法、更に詳しくはヒトインシュリン前駆体のヒトインシ
ュリンへの変換方法ならびに該方法により製造されたヒ
トインシュリンに関する。
従来技術と解決すべき問題点
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いてプ
ロインシュリンをインシュリンに変換できることは、こ
こ数年間認められていることである〔たとえばケムラー
（Ｋｅｍｍｌｅｒ 、 Ｗ、 ）、クラーク（Ｃ１ａｒ
ｋ 、 ＪＪ、、） 、ボルダＣＢｏｒｇ、Ｊ−）およ
びスティ＋ −（５ｔｅｉｎｅｒ 、 Ｄ、Ｆ、 ）
著、７１７’Ｌｚイシ”＋７−ブロシーデインダス（Ｆ
ｅｄ、 Ｐｒｏｃ、）第３０巻（１９７１年）１２１０
頁；ケムラー（Ｋｅｍｍｌｅｒ、 Ｗ。
ロインシュリンをインシュリンに変換できることは、こ
こ数年間認められていることである〔たとえばケムラー
（Ｋｅｍｍｌｅｒ 、 Ｗ、 ）、クラーク（Ｃ１ａｒ
ｋ 、 ＪＪ、、） 、ボルダＣＢｏｒｇ、Ｊ−）およ
びスティ＋ −（５ｔｅｉｎｅｒ 、 Ｄ、Ｆ、 ）
著、７１７’Ｌｚイシ”＋７−ブロシーデインダス（Ｆ
ｅｄ、 Ｐｒｏｃ、）第３０巻（１９７１年）１２１０
頁；ケムラー（Ｋｅｍｍｌｅｒ、 Ｗ。
）、ペターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、 Ｊ、 Ｄ、 ）
およびステイナー（５ｔｅｉｎｅｒ、 Ｄ、Ｆ、 ）著
、ジャーナル・オン・バイオロジカ／ｌ／ ・ケミスト
リー（，１，Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）第２４６巻（
１９７１年）６７８６〜６７９１頁参照〕。この変換の
方法論に伴う持続的困ガ１は、この反応混合物中の実質
的に多用の分離困難な副生物が存在したこ吉であり、か
つ存在が継続していることである。特にヒトプロインシ
ュリンのヒトインシュリンへの変換において、多１什の
（約４〜６％、ｌのＤｅｓ−Ｔｈｒ（Ｂ ３０ ）ヒト
インシュリン〔Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−ｈ
ｌ：］が生成する。この副生物は、１個の末端アミノ酸
を欠く点でヒトインシュリンと異なり、もし生成物の混
合物から強いて分離しようとするなら、分離されるが、
ただ方法論的に困難かつ煩雑である。
およびステイナー（５ｔｅｉｎｅｒ、 Ｄ、Ｆ、 ）著
、ジャーナル・オン・バイオロジカ／ｌ／ ・ケミスト
リー（，１，Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）第２４６巻（
１９７１年）６７８６〜６７９１頁参照〕。この変換の
方法論に伴う持続的困ガ１は、この反応混合物中の実質
的に多用の分離困難な副生物が存在したこ吉であり、か
つ存在が継続していることである。特にヒトプロインシ
ュリンのヒトインシュリンへの変換において、多１什の
（約４〜６％、ｌのＤｅｓ−Ｔｈｒ（Ｂ ３０ ）ヒト
インシュリン〔Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−ｈ
ｌ：］が生成する。この副生物は、１個の末端アミノ酸
を欠く点でヒトインシュリンと異なり、もし生成物の混
合物から強いて分離しようとするなら、分離されるが、
ただ方法論的に困難かつ煩雑である。
組換えＤＮＡ技術の出現に伴い、最初、多量のヒトプロ
インシュリンが現実となった。インシュリン生産におけ
る中間体としてヒトプロインシュリンを用いる場合に、
Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ） −ｈｌ不純物の問
題の解決が必須事項となった。不純なりｅｓ−Ｔｈｒ
（Ｂ ３０ ）−旧からヒトインシュリンの精製を達
成する方法を探求するか、または変換方法とその不純物
の生成を最少限にする条件を探求することが望ましい。
インシュリンが現実となった。インシュリン生産におけ
る中間体としてヒトプロインシュリンを用いる場合に、
Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ） −ｈｌ不純物の問
題の解決が必須事項となった。不純なりｅｓ−Ｔｈｒ
（Ｂ ３０ ）−旧からヒトインシュリンの精製を達
成する方法を探求するか、または変換方法とその不純物
の生成を最少限にする条件を探求することが望ましい。
本発明の新規方法は、上記問題点を解決するものであっ
て、Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ２Ｏ）−ｈｌの生成を最少限
に保持してヒトインシュリン前駆体をヒトインシュリン
に変換することに指向される方法である。
て、Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ２Ｏ）−ｈｌの生成を最少限
に保持してヒトインシュリン前駆体をヒトインシュリン
に変換することに指向される方法である。
発明の構成と効果
本発明は式：
〔式中、Ｒは水素、化学的もしくは酵素的に開裂しうる
アミノ酸残基または少なくとも２個のアミノ酸残基を有
し化学的もしくは酵素的に開裂しうるペプチド部分； Ｒ１はＯＨ，Ａｒｇ−ＹまたはＬｙｓ−Ｙ （基中のＹ
はＯＨ、アミノ酸残基または少なくとも２個のアミノ酸
残基を有するペプチド部分う； （Ａ−１）〜（Ａ−２１，Ｊ部分はヒトインシュリンＡ
−鎖； ＣＢ−１）〜（Ｂ−３０）部分はヒトインシュリンＢ−
鎖； Ｘは該インシュリンへ−鎖にＡ−１のアミノ基で結合し
、かつ該インシュリンロー鎖（こＢ−３０のカルボキシ
ル基で結合した部分であって、Ａ−鎖およびＢ−鎖の双
方を崩壊することなくその双方から酵素的に開裂させる
ことができる部分を表わす〕 で示されるヒトインシュリンｎり躯体を、このヒトイン
シュリン前駆体当り、原子番号２１〜３４．３９〜５２
．５７〜８４および８９〜９２の金属のうちの１種ない
しそれ以−ヒの金属イオン約０．１〜１０モル含有の水
性溶媒中、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ
で処理することがら成るヒトインシュリン前駆体をヒト
インシュリンに変換する方法に指向されるものである。
アミノ酸残基または少なくとも２個のアミノ酸残基を有
し化学的もしくは酵素的に開裂しうるペプチド部分； Ｒ１はＯＨ，Ａｒｇ−ＹまたはＬｙｓ−Ｙ （基中のＹ
はＯＨ、アミノ酸残基または少なくとも２個のアミノ酸
残基を有するペプチド部分う； （Ａ−１）〜（Ａ−２１，Ｊ部分はヒトインシュリンＡ
−鎖； ＣＢ−１）〜（Ｂ−３０）部分はヒトインシュリンＢ−
鎖； Ｘは該インシュリンへ−鎖にＡ−１のアミノ基で結合し
、かつ該インシュリンロー鎖（こＢ−３０のカルボキシ
ル基で結合した部分であって、Ａ−鎖およびＢ−鎖の双
方を崩壊することなくその双方から酵素的に開裂させる
ことができる部分を表わす〕 で示されるヒトインシュリンｎり躯体を、このヒトイン
シュリン前駆体当り、原子番号２１〜３４．３９〜５２
．５７〜８４および８９〜９２の金属のうちの１種ない
しそれ以−ヒの金属イオン約０．１〜１０モル含有の水
性溶媒中、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ
で処理することがら成るヒトインシュリン前駆体をヒト
インシュリンに変換する方法に指向されるものである。
前記のように本発明の方法は、トリプシンおよびカルボ
キシペプチダーゼＢを用いてプロインシュリンをインシ
ュリンに変換する公認方法の効果を増強する方法を開示
するものである。この方法は、前記式で示されるヒトイ
ンシュリン前駆体、最も好ましくはヒトプロインシュリ
ン自体に適用される。
キシペプチダーゼＢを用いてプロインシュリンをインシ
ュリンに変換する公認方法の効果を増強する方法を開示
するものである。この方法は、前記式で示されるヒトイ
ンシュリン前駆体、最も好ましくはヒトプロインシュリ
ン自体に適用される。
本明細書で使用するヒトインシュリン前駆体という語句
は、（１）ヒトインシュリンへ−鎖とヒトインシュリン
Ｂ−鎖を含み、（２）Ａ−鎖とＢ−鎖中のそれぞれ（ａ
）Ａ−６とＡ−１１、（ｂｌＡ−７とＢ−７および（ｃ
）Ａ −２０とＢ−１９に位置した各Ｃｙｓ部分の硫黄
結合により表わされる少なくとも３個のジスルフィド結
合を有し、（３）インシュリンへ−鎖のＡ−１のアミノ
基、およびインシュリンロー鎖のＢ−３０のカルボキシ
ル基暑こ結合した脱離させうる結合部分を有する分子を
呼称する。
は、（１）ヒトインシュリンへ−鎖とヒトインシュリン
Ｂ−鎖を含み、（２）Ａ−鎖とＢ−鎖中のそれぞれ（ａ
）Ａ−６とＡ−１１、（ｂｌＡ−７とＢ−７および（ｃ
）Ａ −２０とＢ−１９に位置した各Ｃｙｓ部分の硫黄
結合により表わされる少なくとも３個のジスルフィド結
合を有し、（３）インシュリンへ−鎖のＡ−１のアミノ
基、およびインシュリンロー鎖のＢ−３０のカルボキシ
ル基暑こ結合した脱離させうる結合部分を有する分子を
呼称する。
Ｒ基は、水素、アミノ酸残基、少なくとも２個のアミノ
酸残基を有するペプチド部分である。この定義のうち上
記の例におけるＲは、アミノ酸残基またはペプチド部分
であってこのＲは残余インシュリン構造の完全性を喪失
することなくインシュリン前駆体生成物から開裂しうる
基である。広範囲に渡るいずれのアミノ酸残基またはペ
プチド部分も、Ｒの定義の範囲に入るものと認められる
。開裂しうるアミノ酸残基の例は、アルギニン（Ａｒｇ
）またはりシン（Ｌｙｓ ）のような塩基性アミ／酸
ならびにこのようなアミノ酸残基であってその末端にカ
ルボキシル基を有するペプチド部分である。これらは、
蛋白質分解酵素トリプシンで処理後、開裂に感受性であ
ると認められるものである。開裂しうるアミノ酸残基の
他の例は、メチオニン（Ｍｅｔ）ならびに前□配回様末
端にＭｅｔのカルボキシ基を有するペプチド部分である
。これらは臭化シアンで処理するこ（！：により脱離す
ることができる。更に開裂しうるアミノ酸残基の例とし
て、トリプトファン（Ｔｒｐ ）または末端にＴｒｐの
カルボキシ基を含むペプチド部分があげられる。これは
Ｎ−ブロモスクシンイミドで処理後、脱離される。
酸残基を有するペプチド部分である。この定義のうち上
記の例におけるＲは、アミノ酸残基またはペプチド部分
であってこのＲは残余インシュリン構造の完全性を喪失
することなくインシュリン前駆体生成物から開裂しうる
基である。広範囲に渡るいずれのアミノ酸残基またはペ
プチド部分も、Ｒの定義の範囲に入るものと認められる
。開裂しうるアミノ酸残基の例は、アルギニン（Ａｒｇ
）またはりシン（Ｌｙｓ ）のような塩基性アミ／酸
ならびにこのようなアミノ酸残基であってその末端にカ
ルボキシル基を有するペプチド部分である。これらは、
蛋白質分解酵素トリプシンで処理後、開裂に感受性であ
ると認められるものである。開裂しうるアミノ酸残基の
他の例は、メチオニン（Ｍｅｔ）ならびに前□配回様末
端にＭｅｔのカルボキシ基を有するペプチド部分である
。これらは臭化シアンで処理するこ（！：により脱離す
ることができる。更に開裂しうるアミノ酸残基の例とし
て、トリプトファン（Ｔｒｐ ）または末端にＴｒｐの
カルボキシ基を含むペプチド部分があげられる。これは
Ｎ−ブロモスクシンイミドで処理後、脱離される。
Ｒ１基ハ、ヒドロキシル、アルギニン、リシン、マタハ
アルギニンもしくはりシンのアミノ末端基を有するペプ
チドである。Ｒ１がアルギニン、リシンまたはこれらの
酸残基のいずれかのアミ／末端基を有するペプチドであ
るとき、これらのアミノ酸またはペプチドは、Ｒ工がヒ
ドロキシルである生成物を形成させる本発明方法の条件
下に開裂させることができる。
アルギニンもしくはりシンのアミノ末端基を有するペプ
チドである。Ｒ１がアルギニン、リシンまたはこれらの
酸残基のいずれかのアミ／末端基を有するペプチドであ
るとき、これらのアミノ酸またはペプチドは、Ｒ工がヒ
ドロキシルである生成物を形成させる本発明方法の条件
下に開裂させることができる。
インシュリン前駆体の結合部分Ｘは、広範囲に渡るいず
れの構造であってもよい。部分Ｘは、好ましくはポリペ
プチドである。このポリペプチドは一般に、少なくとも
２個、好ましくは約２〜３５個、最も好ましくは約６〜
３５個のアミノ酸残基を有する。部分Ｘは、Ａ−鎖のＡ
−１アミ／基、およびＢ−鎖のＢ−３０カルボキシル基
に結合する。結合部分Ｘがペプチドであるとき、最も好
ましくはこれは、ヒトプロインシュリンの自然結合ペプ
チド、たとえば次式を有する結合部分であるニ ーＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＶａＩ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−。
れの構造であってもよい。部分Ｘは、好ましくはポリペ
プチドである。このポリペプチドは一般に、少なくとも
２個、好ましくは約２〜３５個、最も好ましくは約６〜
３５個のアミノ酸残基を有する。部分Ｘは、Ａ−鎖のＡ
−１アミ／基、およびＢ−鎖のＢ−３０カルボキシル基
に結合する。結合部分Ｘがペプチドであるとき、最も好
ましくはこれは、ヒトプロインシュリンの自然結合ペプ
チド、たとえば次式を有する結合部分であるニ ーＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−ＶａＩ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−。
上記のような自然的結合鎖状物を処理するのが好ましい
が、結合ペプチドとして、非常に短かいペプチドを結合
ペプチドとして処理することができる。特定の要件は、
Ｘが（１）八−鎖およびＢ−鎖の間の本来のジスルフィ
ド結合を許容するのに充分な長さであること、および（
２）インシュリン前駆体からインシュリンを形成させる
のに伴い、該前駆体から脱離させることができることで
ある。処理することができる典型的ジペプチドは、−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−である。加うるに式： −Ａｒｇ−Ｘ’
−Ａｒｇ−（Ｘ’は少なくとも１個のアミノ酸残基を表
わすうを有する上記ジペプチドの改良型も処理すること
ができる。特に好ましい結合ペプチドは、−Δｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇおよび−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ２−
Ｌｙｓ−Ａｒｇの構造（Ｘ２は少なくとも１個のアミノ
酸残基、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸残基であ
る〕を有するより長い鎖状のペプチドである。後者は、
もちろん自然的結合ペプチドを包含する。
が、結合ペプチドとして、非常に短かいペプチドを結合
ペプチドとして処理することができる。特定の要件は、
Ｘが（１）八−鎖およびＢ−鎖の間の本来のジスルフィ
ド結合を許容するのに充分な長さであること、および（
２）インシュリン前駆体からインシュリンを形成させる
のに伴い、該前駆体から脱離させることができることで
ある。処理することができる典型的ジペプチドは、−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−である。加うるに式： −Ａｒｇ−Ｘ’
−Ａｒｇ−（Ｘ’は少なくとも１個のアミノ酸残基を表
わすうを有する上記ジペプチドの改良型も処理すること
ができる。特に好ましい結合ペプチドは、−Δｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇおよび−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘ２−
Ｌｙｓ−Ａｒｇの構造（Ｘ２は少なくとも１個のアミノ
酸残基、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸残基であ
る〕を有するより長い鎖状のペプチドである。後者は、
もちろん自然的結合ペプチドを包含する。
本発明の方法は、水性媒体中で行なわれる。水性媒体と
いう語句は、水の存在が必要であるが、メタノール、エ
タ／−ル、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドそ
の他のような水に混和しうる有機溶媒の存在は排除され
ない。ヒトインシュリン前駆体は媒体中に約２０ｍＭを
越えない濃度で存在する。ヒトインシュリン前駆体の濃
度は、好ましくは一般に約０．１〜１０ｍＭ、より好ま
しくは約０．５〜５ ｍ Ｍ 、最も好ましくは約１〜
３ｍＭの範囲で実質的に低い。
いう語句は、水の存在が必要であるが、メタノール、エ
タ／−ル、アセトン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドそ
の他のような水に混和しうる有機溶媒の存在は排除され
ない。ヒトインシュリン前駆体は媒体中に約２０ｍＭを
越えない濃度で存在する。ヒトインシュリン前駆体の濃
度は、好ましくは一般に約０．１〜１０ｍＭ、より好ま
しくは約０．５〜５ ｍ Ｍ 、最も好ましくは約１〜
３ｍＭの範囲で実質的に低い。
変換反応は、一般に約０〜４０℃の広範囲の温度で行な
うことができる。この反応は、好ましくは約４〜２５℃
、最も好ましくは約１０〜１５℃の温度で行なわれる。
うことができる。この反応は、好ましくは約４〜２５℃
、最も好ましくは約１０〜１５℃の温度で行なわれる。
反応混合物のｐＨは、約４〜１２の範囲内のいずれかで
あることができる。しかし反応が、ｐＨ約６〜９、好ま
しくは約７〜８、正確に調節するときｐＨ約７．２〜７
．６の範囲で進行するように注意してｐＨを調節するこ
とにより、最良の結果が得られる。
あることができる。しかし反応が、ｐＨ約６〜９、好ま
しくは約７〜８、正確に調節するときｐＨ約７．２〜７
．６の範囲で進行するように注意してｐＨを調節するこ
とにより、最良の結果が得られる。
一般に緩衝剤を使用すること（こより、ｐＨの調節が助
けられる。広範囲に渡るいずれかの典型的緩衝剤を使用
するこ吉ができる。適切な緩衝剤の例は、トリス（ＴＲ
ＩＳ）〔トリス（ヒドロキシメチルンアミ／メタン〕、
エチレンジアミン、トリエタ／−ルアミン、グリシン、
Ｉ−Ｉ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ ［Ｎ −２−ヒドロキシエチ
ルピペラジンーＮ−２−エタンスルホン酸〕その他であ
る。
けられる。広範囲に渡るいずれかの典型的緩衝剤を使用
するこ吉ができる。適切な緩衝剤の例は、トリス（ＴＲ
ＩＳ）〔トリス（ヒドロキシメチルンアミ／メタン〕、
エチレンジアミン、トリエタ／−ルアミン、グリシン、
Ｉ−Ｉ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ ［Ｎ −２−ヒドロキシエチ
ルピペラジンーＮ−２−エタンスルホン酸〕その他であ
る。
トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢの使用量は一般
に、この２種の酵素の間の関係およびヒトインシュリン
前駆体のけに関連する。これらの酵素を、反応混合物中
に溶液とするかまたは適当な支持体上に固定して反応媒
体中で作用させることができる公知技術を応用するかい
ずれか番こより反応混合物に配合するこ吉ができる。
に、この２種の酵素の間の関係およびヒトインシュリン
前駆体のけに関連する。これらの酵素を、反応混合物中
に溶液とするかまたは適当な支持体上に固定して反応媒
体中で作用させることができる公知技術を応用するかい
ずれか番こより反応混合物に配合するこ吉ができる。
重量二重量比に基づき、カルボキシペプチダーゼＢを、
一般にヒトインシュリン前駆体（こ対する比的（１：１
０）〜（］：５，０ＯＯ）、好ましくは約（１：５００
）〜（１，：３，５００）、最も好ましくは約（１：Ｉ
、０ＯＯＪ〜（１：３，０００）の量で存在させる。
一般にヒトインシュリン前駆体（こ対する比的（１：１
０）〜（］：５，０ＯＯ）、好ましくは約（１：５００
）〜（１，：３，５００）、最も好ましくは約（１：Ｉ
、０ＯＯＪ〜（１：３，０００）の量で存在させる。
重量二重量比に基づき、トリプシンを、一般（こヒトイ
ンシュリン前駆体に対する比的（１：２０）〜（１：２
５０，０ＯＯ）、好ましくは約（１：３００）〜（１：
２０，０００）、最も好ましくは約（１：５，０００）
〜（１：１５，０００）の量で存在させる。
ンシュリン前駆体に対する比的（１：２０）〜（１：２
５０，０ＯＯ）、好ましくは約（１：３００）〜（１：
２０，０００）、最も好ましくは約（１：５，０００）
〜（１：１５，０００）の量で存在させる。
また反応混合物中のカルボキシペプチダーゼＢのトリプ
シンに対する比は、重要なパラメーターである。カルボ
キシペプチダーゼＢのトリプシンに対する重量比は、一
般に約（１：１）〜（１０：１）、好ましくは約（２＋
１）〜（５：１）である。
シンに対する比は、重要なパラメーターである。カルボ
キシペプチダーゼＢのトリプシンに対する重量比は、一
般に約（１：１）〜（１０：１）、好ましくは約（２＋
１）〜（５：１）である。
本発明の基本を構成する要点となる発見は、１種ないし
それ以上広範囲に渡る金属イオンの特定量を存在させる
ことにより、反応中に生成するＤｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ
３０ ）−ｈＩの量を実質的に減少させることを見い
だしたことにある。
それ以上広範囲に渡る金属イオンの特定量を存在させる
ことにより、反応中に生成するＤｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ
３０ ）−ｈＩの量を実質的に減少させることを見い
だしたことにある。
ある種の金属イオンが非常に好ましいが、広範囲の金属
イオンが有用であることを見いだした。
イオンが有用であることを見いだした。
使用することができる金属イオンは、次のような金属の
イオンである：スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔ１）
、バナジウム（Ｖ）、クロム（ＣｒＪ、マンガン（Ｍｎ
）、鉄（Ｆｅ）、コバ／ｌ／１−（Ｃｏ）、ニッケル（
Ｎｉ八へ（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、
ゲルマニウム（Ｇｅ）、ヒ素（Ａｓ）、セレン（Ｓｅ）
、イツトリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ
（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）
、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）１パラジウム
（Ｐｄ ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ〕、インジ
ウム（Ｉｎ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、テ
ルル（Ｔｅ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、
プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウ
ム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ
）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジス
プロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム
（ＥｒＪ、ツリウム（、Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ
）、ルテチウム（Ｔ、ｕ）、ハフニウムＣＨｆ）、タン
タル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）
、オスミウム（Ｏ８）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐ
ｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（ＴＩ ）
、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂ１）、ポロニウム（Ｐｏ）
、アクチニウム（ＡＣ）、トリウム（Ｔｈ）、プロトア
クチニウム（Ｐａ）およびウランＣＵ）。
イオンである：スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔ１）
、バナジウム（Ｖ）、クロム（ＣｒＪ、マンガン（Ｍｎ
）、鉄（Ｆｅ）、コバ／ｌ／１−（Ｃｏ）、ニッケル（
Ｎｉ八へ（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、
ゲルマニウム（Ｇｅ）、ヒ素（Ａｓ）、セレン（Ｓｅ）
、イツトリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ
（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）
、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）１パラジウム
（Ｐｄ ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ〕、インジ
ウム（Ｉｎ）、スズ（Ｓｎ）、アンチモン（Ｓｂ）、テ
ルル（Ｔｅ）、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、
プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウ
ム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ
）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジス
プロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム
（ＥｒＪ、ツリウム（、Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ
）、ルテチウム（Ｔ、ｕ）、ハフニウムＣＨｆ）、タン
タル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）
、オスミウム（Ｏ８）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐ
ｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（ＴＩ ）
、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂ１）、ポロニウム（Ｐｏ）
、アクチニウム（ＡＣ）、トリウム（Ｔｈ）、プロトア
クチニウム（Ｐａ）およびウランＣＵ）。
上記金属のいずれかのイオンを本発明方法で使用するこ
とができるが、下位種類に属するより狭い範囲の非常に
好ましく、それ故優先性の高い金属イオンは、次に示す
金属のイオンである：（１）クロム、モリブデン、タン
グステン、水銀、アンチモン、ビスマス、ニッケル、鉄
、コバルト、亜鉛、カドミウム、銅、スズ、鉛、ユーロ
ピウム、ウラン、白金およびマンガン、 （２）ニッケル、鉄、コバルト、亜鉛、カドミウム、ス
ズ、鉛、ユーロピウム、ウラン、白金およびマンガン、 （３）ニッケル、亜鉛、コバルトおよびカドミウム、（
４）ニッケルおよび亜鉛、 （５）ニッケル。
とができるが、下位種類に属するより狭い範囲の非常に
好ましく、それ故優先性の高い金属イオンは、次に示す
金属のイオンである：（１）クロム、モリブデン、タン
グステン、水銀、アンチモン、ビスマス、ニッケル、鉄
、コバルト、亜鉛、カドミウム、銅、スズ、鉛、ユーロ
ピウム、ウラン、白金およびマンガン、 （２）ニッケル、鉄、コバルト、亜鉛、カドミウム、ス
ズ、鉛、ユーロピウム、ウラン、白金およびマンガン、 （３）ニッケル、亜鉛、コバルトおよびカドミウム、（
４）ニッケルおよび亜鉛、 （５）ニッケル。
本発明方法に従って上記金属１種ないしそれ以上のイオ
ンを、ヒトインシュリン前駆体反応混合物に加える。反
応混合物中に存在させる前記金属のイオン総量は、ヒト
インシュリン前駆体モル当り約０．１〜１０モルの範囲
に渡る。実際の使用量は、好ましくはこの範囲内の低い
１廿、一般的にはヒトインシュリン前駆体モル当り約０
．１〜２モルである。最も好ましくはこの計は、ヒトイ
ンシュリン前駆体モル当り約０．３〜１モル、理想的に
ヒトインシュリン前駆体モル当り約０．３３〜０６モル
である。
ンを、ヒトインシュリン前駆体反応混合物に加える。反
応混合物中に存在させる前記金属のイオン総量は、ヒト
インシュリン前駆体モル当り約０．１〜１０モルの範囲
に渡る。実際の使用量は、好ましくはこの範囲内の低い
１廿、一般的にはヒトインシュリン前駆体モル当り約０
．１〜２モルである。最も好ましくはこの計は、ヒトイ
ンシュリン前駆体モル当り約０．３〜１モル、理想的に
ヒトインシュリン前駆体モル当り約０．３３〜０６モル
である。
変換反応は、標準的【こ約２〜４８時間、通常約８〜１
６時間行なわれる。高性能液体クロマトグラフィーで反
応を監視し、ヒトインシュリンの生成に伴って反応時間
を注意して調節することができる。
６時間行なわれる。高性能液体クロマトグラフィーで反
応を監視し、ヒトインシュリンの生成に伴って反応時間
を注意して調節することができる。
本発明のもう一つの側面は、反応混合物に型番こ別の種
類の金属イオン１種ないしそれ以上を配合することによ
り、Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （８３０ノーｈｒの生成量を更
各こ減少させ得ることを見いだしたことにあり、これは
全く予期していなかった効果である。このような更に改
良された方法は、第１の金属イオンの量が、ヒトインシ
ュリン前駆体モル当り約０．１−０．６モルであるとき
特に明らかである。
類の金属イオン１種ないしそれ以上を配合することによ
り、Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （８３０ノーｈｒの生成量を更
各こ減少させ得ることを見いだしたことにあり、これは
全く予期していなかった効果である。このような更に改
良された方法は、第１の金属イオンの量が、ヒトインシ
ュリン前駆体モル当り約０．１−０．６モルであるとき
特に明らかである。
ヘリリウム（Ｂｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウ
ム（Ｃａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、バリウム（Ｂａ
）およびラジウム（Ｒａ）から成る群から選ばれる金属
のイオン量を加えるのが非常に有利である。好ましいイ
オンは、カルシウム、バリウム、ストロンチウムまたは
マグネシウムのイオン、最も好ましくはカルシウムイオ
ンである。
ム（Ｃａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）、バリウム（Ｂａ
）およびラジウム（Ｒａ）から成る群から選ばれる金属
のイオン量を加えるのが非常に有利である。好ましいイ
オンは、カルシウム、バリウム、ストロンチウムまたは
マグネシウムのイオン、最も好ましくはカルシウムイオ
ンである。
第２種の金属のイオン量は、ヒトインシュリン前駆体モ
ル当り約０．５〜５モル、好ましくはヒトインシュリン
前駆体モル当り約１〜３モルである。
ル当り約０．５〜５モル、好ましくはヒトインシュリン
前駆体モル当り約１〜３モルである。
上記のように第２の金属イオンの使用について最も驚く
べきことは、第２種の金属イオン特にカルシウムイオン
がトリプシンを安定にすることがわかったこと、および
第１の金属イオンを存在させることなく第２の金属イオ
ンを使用したとき、Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−
ｈＩの生成が実際的に増大することがＪ忍められたとと
である。
べきことは、第２種の金属イオン特にカルシウムイオン
がトリプシンを安定にすることがわかったこと、および
第１の金属イオンを存在させることなく第２の金属イオ
ンを使用したとき、Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−
ｈＩの生成が実際的に増大することがＪ忍められたとと
である。
標準的に本発明方法は、ヒトインシュリン前駆体を水性
媒体に溶解するこ（！：ｌこより行なわれる。
媒体に溶解するこ（！：ｌこより行なわれる。
最終的混合物は一般に約１〜３ｍＭの濃度、ｐＨ約８と
なる。次いで第２種の金属イオン（使用する場合ンを加
える。標準的に前記濃度のヒトインシュリン前駆体を使
用したとき、塩化カルシウムを約５ｍＭの濃度になるよ
うに加える。次いで第１種の金属イオス典型的にはニッ
ケル（］［）イオンを、ヒトインシュリン前駆体モル当
り約０．５モルの濃度になるように加える。混合物のｐ
ｒ−ｒを７．３〜７．５に調節し、カルボキシペプチ
ドＢ（約１：２゜５００ｗ／ｗヒトインシュリン前駆体
）、次いで′トリプシン（約１ ：１．２，５００ｗ／
ｗヒトインシュリン前駆体）を加える。混合物を約１２
℃に保持して反応を進行させる。高性能液体クロマトグ
ラフィーＧこより反応の進行を注意して監視する。
なる。次いで第２種の金属イオン（使用する場合ンを加
える。標準的に前記濃度のヒトインシュリン前駆体を使
用したとき、塩化カルシウムを約５ｍＭの濃度になるよ
うに加える。次いで第１種の金属イオス典型的にはニッ
ケル（］［）イオンを、ヒトインシュリン前駆体モル当
り約０．５モルの濃度になるように加える。混合物のｐ
ｒ−ｒを７．３〜７．５に調節し、カルボキシペプチ
ドＢ（約１：２゜５００ｗ／ｗヒトインシュリン前駆体
）、次いで′トリプシン（約１ ：１．２，５００ｗ／
ｗヒトインシュリン前駆体）を加える。混合物を約１２
℃に保持して反応を進行させる。高性能液体クロマトグ
ラフィーＧこより反応の進行を注意して監視する。
以下に記載の実施例は本発明方法の有効性を証明するも
のである。実施例は本発明の広い範囲に制限を加えるこ
とを意図するものではない。
のである。実施例は本発明の広い範囲に制限を加えるこ
とを意図するものではない。
実施例１−トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢの濃
度を変える効果 ヒトプロインシュリン（ｈＰＩ）を、２０ｍＭエチレン
ジアミン（ＥＤＡ）緩衝液（ｐＨ７，０）に、１０．８
５．Ｖ／／Ｊの濃度で溶解する。この混合物を２部分に
分ける。第１部分ζこ、豚膵臓のカルボキシペプチダー
ゼＢ （ＣｐＢ）を、最終濃度３，７４■／召の濃度に
なるように加える。この溶液を６個の分画（１分画は１
ｍＱ容ンに分け、あらかじめトシルフェニルアラニルク
ロロメチルケトンで処理シた牛膵臓のトリプシン（トリ
プシン−ＴＰＣＫ）を、それぞれ１．０．１．４．１．
８．２．８．３．６および５．４１１１／ｉの濃度で添
加する。各試料を２３℃で８時間熟成する。高圧液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でＤｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ
３０ ） −ｈＩ濃度を測定し、結果を表１に示す。
度を変える効果 ヒトプロインシュリン（ｈＰＩ）を、２０ｍＭエチレン
ジアミン（ＥＤＡ）緩衝液（ｐＨ７，０）に、１０．８
５．Ｖ／／Ｊの濃度で溶解する。この混合物を２部分に
分ける。第１部分ζこ、豚膵臓のカルボキシペプチダー
ゼＢ （ＣｐＢ）を、最終濃度３，７４■／召の濃度に
なるように加える。この溶液を６個の分画（１分画は１
ｍＱ容ンに分け、あらかじめトシルフェニルアラニルク
ロロメチルケトンで処理シた牛膵臓のトリプシン（トリ
プシン−ＴＰＣＫ）を、それぞれ１．０．１．４．１．
８．２．８．３．６および５．４１１１／ｉの濃度で添
加する。各試料を２３℃で８時間熟成する。高圧液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でＤｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ
３０ ） −ｈＩ濃度を測定し、結果を表１に示す。
第２部分のｈＰＩＩ液を５１ａｌの分画（１分画は１ｍ
Ｑ容）に分ける。ＣｐＢを、それぞれ１，１．１．５．
２．２．３．７ オヨヒ５．４ｍ４／Ａノ濃度ニナルよ
うに加える。次いで各分画にトリプシン−ＴＰＣＫを２
゜７１Ｍ９／ｌの濃度になるように添加する。各試料を
２３℃で８時間熟成する。結果を表２に示す。
Ｑ容）に分ける。ＣｐＢを、それぞれ１，１．１．５．
２．２．３．７ オヨヒ５．４ｍ４／Ａノ濃度ニナルよ
うに加える。次いで各分画にトリプシン−ＴＰＣＫを２
゜７１Ｍ９／ｌの濃度になるように添加する。各試料を
２３℃で８時間熟成する。結果を表２に示す。
表１および２の双方において、Ｄｅｓ−Ｔｈｒ（Ｂ２Ｏ
）−ｈｌを、ＨＰＬＣにより測定したｈＩの％として表
わす。データにより証明されるようにＣｐＢの一定濃度
において、トリプシン濃度の減少によりＤｅｓ−Ｔｈｒ
（Ｂ ３０ ）−ｈｌが減少する。これとは逆にトリ
プシンの一定濃度においてＣｐＢ濃度の増加によりＤｅ
ｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−Ｈの濃度は減少する。
）−ｈｌを、ＨＰＬＣにより測定したｈＩの％として表
わす。データにより証明されるようにＣｐＢの一定濃度
において、トリプシン濃度の減少によりＤｅｓ−Ｔｈｒ
（Ｂ ３０ ）−ｈｌが減少する。これとは逆にトリ
プシンの一定濃度においてＣｐＢ濃度の増加によりＤｅ
ｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−Ｈの濃度は減少する。
表１
ｈＰＩ変換に及ぼすトリプシン濃度の増大効果ＣｐＢ
）リプシン ％ Ｄｅｓ−Ｔｈｒ（Ｂ２Ｏ）−ｈＩ３
．７ １．０ ２．４３．７
１．４ ２．６３．７ １．８
２．７３．７ ２．８ ３．
３３．７ ３．６ ３．９３．７
５．４ ５．１表２ ｈＰＩ変換に及はすＣｐＢ濃度の増大効果ＣｐＢ Ｉ
−リプシン ％ Ｄｅｓ−Ｔｈｒ（Ｂ２Ｏ） −ｈ １
１．１ ２．７１ ４．８１
．５ ２．７１ ４．０２．
２ ２．７１ ４．１３．７
２．７１ ３．４５．４
２．７１ ２．６実施例２−
Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ） −ｈＩ生成に及
ぼす温度の効果 ｈＰＩ ６０１ｆｆ＆を２０ｍＭエチレンジアミン６、
０ ｍＱ（ｐＨ７，５〜８．０月こ溶解する。基質（ｈ
ＰＩ ）と酵素の比、即ちｈＰＩ ： ＣｐＢ ： ト
リプシン−ＴＰＣＫの比が５０００ ： １ ： １
（ｗ／ｗ）となるように豚カルボキシペプチダーゼＢと
牛トリプシン−ＴＰＣＫを順次添加する。この混合物の
２ｍＱ部分を、ＨＰＬＣで測定して最高ｈＩ収量を得る
のに必要な時間即ち１４．６および４時間、それぞれ１
２．２４および３７℃で熟成する。表３の結果で示され
るように温度が低いことは、Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ
３０ ） −ｈｌの生成を低くするのに好都合である。
）リプシン ％ Ｄｅｓ−Ｔｈｒ（Ｂ２Ｏ）−ｈＩ３
．７ １．０ ２．４３．７
１．４ ２．６３．７ １．８
２．７３．７ ２．８ ３．
３３．７ ３．６ ３．９３．７
５．４ ５．１表２ ｈＰＩ変換に及はすＣｐＢ濃度の増大効果ＣｐＢ Ｉ
−リプシン ％ Ｄｅｓ−Ｔｈｒ（Ｂ２Ｏ） −ｈ １
１．１ ２．７１ ４．８１
．５ ２．７１ ４．０２．
２ ２．７１ ４．１３．７
２．７１ ３．４５．４
２．７１ ２．６実施例２−
Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ） −ｈＩ生成に及
ぼす温度の効果 ｈＰＩ ６０１ｆｆ＆を２０ｍＭエチレンジアミン６、
０ ｍＱ（ｐＨ７，５〜８．０月こ溶解する。基質（ｈ
ＰＩ ）と酵素の比、即ちｈＰＩ ： ＣｐＢ ： ト
リプシン−ＴＰＣＫの比が５０００ ： １ ： １
（ｗ／ｗ）となるように豚カルボキシペプチダーゼＢと
牛トリプシン−ＴＰＣＫを順次添加する。この混合物の
２ｍＱ部分を、ＨＰＬＣで測定して最高ｈＩ収量を得る
のに必要な時間即ち１４．６および４時間、それぞれ１
２．２４および３７℃で熟成する。表３の結果で示され
るように温度が低いことは、Ｄｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ
３０ ） −ｈｌの生成を低くするのに好都合である。
表３・温度効果
１２ ４．４
２４ 〉７
３７ 〉９
実施例３−派生物生成に及ぼす金属の効果ｈＰＩ３６０
■を２０ｍＭグリシン２０ｍ（！ｌこ溶解する（ｐＨ７
，６５）。溶液を２個の部分（各部分１０、０ ｍＱ
）に分け、１部分にカルシウムイオン（５ｍＭ）を加え
る。各部分を更に３分画に分ける。
■を２０ｍＭグリシン２０ｍ（！ｌこ溶解する（ｐＨ７
，６５）。溶液を２個の部分（各部分１０、０ ｍＱ
）に分け、１部分にカルシウムイオン（５ｍＭ）を加え
る。各部分を更に３分画に分ける。
カルシウムイオンを含む部分とカルシウムイオンを含ま
ない部分を次のように処理する：１セットに亜鉛イオン
を、ｈＰｌに対するモル比０．３３となるように加え、
他の１セツトにニッケルイオンを、ｈＰＩに対するモル
比０．３６となるように加える。すべての混合物に酵素
を、ｈＰＩ ： ＣｐＢ ： ） ’）プシン−ＴＰＣ
Ｋの重量比が１３，５００：５：１となるように加える
。各混合物のｐＨを７．６５〜７．７に調節し、１２℃
で１６時間熟成する。表４に示す結果は、ニッケルおよ
び亜鉛がＤｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０）−ｈＩの生成
濃度を減少させる効果を説明する。更に表４の結果は、
この効果はカルシウム番こより増強されることを説明す
るものである。
ない部分を次のように処理する：１セットに亜鉛イオン
を、ｈＰｌに対するモル比０．３３となるように加え、
他の１セツトにニッケルイオンを、ｈＰＩに対するモル
比０．３６となるように加える。すべての混合物に酵素
を、ｈＰＩ ： ＣｐＢ ： ） ’）プシン−ＴＰＣ
Ｋの重量比が１３，５００：５：１となるように加える
。各混合物のｐＨを７．６５〜７．７に調節し、１２℃
で１６時間熟成する。表４に示す結果は、ニッケルおよ
び亜鉛がＤｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０）−ｈＩの生成
濃度を減少させる効果を説明する。更に表４の結果は、
この効果はカルシウム番こより増強されることを説明す
るものである。
表４・ｈＰＩ変換に及ぼす金属の効果
なし ４．０
Ｃａ ７．６
Ｚｎ １．６
Ｎ ｉ １．７
Ｚｎ＋Ｃａ Ｏ，７
Ｎｉ＋Ｃａ ’ ＜０．２’注）１−分析
結果は検出限界ｈＩの０．２０％以下であった。
結果は検出限界ｈＩの０．２０％以下であった。
実施例４− ｈＰＩ変換反応における派生物生成に及ぼ
すＮ１（ＩＩ）濃度変化の効果 ｈＰＩ２４５＃を５０ｍＭグリシン１２．０ｍｌ！に加
える（ｐＨ７，４）。これにＩＭ塩化カルシウム貯蔵溶
液からのカルシウムイオンを、最終的（こカルシウム（
ｎＪ濃度が５ｍＭ（！：なるように加える。０゜１１
Ｍ二塩化ニッケルの貯蔵溶液からのニッケル（■）を２
ｍＱ、分画の各１試料に、１１ＰＩに対するモル比がそ
れぞれ０．０．２４、ｏ、３７、ｏ、４４．０゜５１お
よび０．５８となるよう（こ加える。各試験管にＣｐＢ
を、７．４ ｔｔ！／ｍＱ、 （４，８７Ｍ９ ／ ｍ
Ｑ貯蔵溶液ンになるように加え、次いでトリプシン−Ｔ
ＰＣＫを、最終濃度が２．９６ ｔＪ／ｍＱ （１，Ｏ
ｒ’ｇ／ ｍＱ貯蔵溶液）となるように添加する。すべ
ての試料のｐＴ−Ｔを７゜４０＋ご調節し、それぞれを
１２℃で熟成する。１２時間後反応を停止させ、Ｄｅｓ
−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−ｈＩおよびｈＩの濃度を分
析する。表５の結果は、ニッケル濃度が増大すればＤｅ
ｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−ｈｌの生成が減少するこ
とを示している。
すＮ１（ＩＩ）濃度変化の効果 ｈＰＩ２４５＃を５０ｍＭグリシン１２．０ｍｌ！に加
える（ｐＨ７，４）。これにＩＭ塩化カルシウム貯蔵溶
液からのカルシウムイオンを、最終的（こカルシウム（
ｎＪ濃度が５ｍＭ（！：なるように加える。０゜１１
Ｍ二塩化ニッケルの貯蔵溶液からのニッケル（■）を２
ｍＱ、分画の各１試料に、１１ＰＩに対するモル比がそ
れぞれ０．０．２４、ｏ、３７、ｏ、４４．０゜５１お
よび０．５８となるよう（こ加える。各試験管にＣｐＢ
を、７．４ ｔｔ！／ｍＱ、 （４，８７Ｍ９ ／ ｍ
Ｑ貯蔵溶液ンになるように加え、次いでトリプシン−Ｔ
ＰＣＫを、最終濃度が２．９６ ｔＪ／ｍＱ （１，Ｏ
ｒ’ｇ／ ｍＱ貯蔵溶液）となるように添加する。すべ
ての試料のｐＴ−Ｔを７゜４０＋ご調節し、それぞれを
１２℃で熟成する。１２時間後反応を停止させ、Ｄｅｓ
−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−ｈＩおよびｈＩの濃度を分
析する。表５の結果は、ニッケル濃度が増大すればＤｅ
ｓ−Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−ｈｌの生成が減少するこ
とを示している。
表５・Ｎｉ （■）濃度変化の効果
Ｎ１（ＴＩ）／ｈＰＩ ％Ｄｅｓ −Ｔｈｒ（Ｂ２Ｏ
）−ｈＩ０７．６ ０．２４ １．９０．３７
０．６１０．４４．
０．７２ ０．５１ ０．３３０．５８
０．２８ 実施例５− ｈＰＩ変換反応における派生物生成に及ぼ
す種々の金属カチオンの効果 ｈＰｌ（９３１ｆｆ！？）を５ｍＭグリシン３６ｍｆｆ
１に溶解し、ｐＨを７．８〜８．０に調節する。塩化カ
ルシウム（１Ｍ貯蔵溶液）としてカルシウムイオンを、
５ｍＭとなるように加える。各３ｍＱの分画を取り、そ
れぞれに表６に示す濃度で種々の金属イオンを加える。
）−ｈＩ０７．６ ０．２４ １．９０．３７
０．６１０．４４．
０．７２ ０．５１ ０．３３０．５８
０．２８ 実施例５− ｈＰＩ変換反応における派生物生成に及ぼ
す種々の金属カチオンの効果 ｈＰｌ（９３１ｆｆ！？）を５ｍＭグリシン３６ｍｆｆ
１に溶解し、ｐＨを７．８〜８．０に調節する。塩化カ
ルシウム（１Ｍ貯蔵溶液）としてカルシウムイオンを、
５ｍＭとなるように加える。各３ｍＱの分画を取り、そ
れぞれに表６に示す濃度で種々の金属イオンを加える。
１２℃で平衝処理後、ｈＰＴ ： ＣｐＢ ： ｌ−リ
プシン−ＴＰＣＫの重量比が１３，５００：５：１とな
るように酵素を加える。
プシン−ＴＰＣＫの重量比が１３，５００：５：１とな
るように酵素を加える。
各試料を１２℃で１３時間熟成し、ｈＩおよびＤｅｓ−
Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−ｈｌを測定する。表６の結
果は、広範囲の金属イオンがＤｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ
３０） −ｈＩの生成を減少させるのに有効であること
を示す。
Ｔｈｒ （Ｂ ３０ ）−ｈｌを測定する。表６の結
果は、広範囲の金属イオンがＤｅｓ−Ｔｈｒ （Ｂ
３０） −ｈＩの生成を減少させるのに有効であること
を示す。
表６・種々の二価カチオンの効果
二価 Ｍ（ＩＩ）／ｈＰＩ ％Ｄｅｓ−Ｔｈｒ（Ｂ
２Ｏ）−ｈＩＺｎ Ｏ，３１，０２ Ｚｎ Ｏ，５０，７８ Ｎｉ Ｏ，２２２，２９ Ｎｉ Ｏ，３７０，７２ Ｃｏ Ｏ，２６２，３５ Ｃｏ Ｏ，４３０，８９ Ｃｄ Ｏ，１９１，６３ Ｃｄ Ｏ，３１０，８８ Ｃｕ Ｏｌｌ ４ ３．２３Ｃｕ
Ｏ，２３１，３４ 実施例６−Ｎｉ（ＩＩ）とＣａ （ＴＩ ）を用いるｈ
ＰＩの大規模変換 ｈＰＩ（４４８，５，９’、ｌを１５ｍＭグリシン緩衝
液（ｐＨ７，４，３３，Ｏｎ月こ溶解し、溶液を冷やし
て１２℃に保持する。１．０Ｍ塩化カルシウム貯蔵溶液
０．１６５７Ｊを加えてカルシウム（Ｋ）６度を５ｍＭ
にする。１０分間撹拌後、Ｎｉ（■）：ｈＰＩのモル比
が０．４４：１となるようにニッケル（■〕を固体二塩
化ニッケル・大水化物５．０．＠、：して添加する。こ
の溶液を更（こ１０分間おだやかに撹拌し、ＣｐＢ ４
．８７ ■／ ｍＱ、貯蔵溶液からＣｐＢ （３６，８
ｍＱ、１７９．４■、ｌを加える。次いで１． Ｏを／
ｍＱ貯蔵溶液からトリプシン−ＴＰＣＫ （３５，９
ｍＱ、 ３５゜９■）を加える。ｈＩの分析に従うｈＩ
の最高生成量番こより、１０時間で反応は完結に達する
。生成時点で得られた混合物は約０．２９ ％ Ｄｅｓ
−Ｔｈｒ （Ｂ３０ ）−ｈＩを含み、これはこの化
合物の検出方法における検出限界に近接する値である。
２Ｏ）−ｈＩＺｎ Ｏ，３１，０２ Ｚｎ Ｏ，５０，７８ Ｎｉ Ｏ，２２２，２９ Ｎｉ Ｏ，３７０，７２ Ｃｏ Ｏ，２６２，３５ Ｃｏ Ｏ，４３０，８９ Ｃｄ Ｏ，１９１，６３ Ｃｄ Ｏ，３１０，８８ Ｃｕ Ｏｌｌ ４ ３．２３Ｃｕ
Ｏ，２３１，３４ 実施例６−Ｎｉ（ＩＩ）とＣａ （ＴＩ ）を用いるｈ
ＰＩの大規模変換 ｈＰＩ（４４８，５，９’、ｌを１５ｍＭグリシン緩衝
液（ｐＨ７，４，３３，Ｏｎ月こ溶解し、溶液を冷やし
て１２℃に保持する。１．０Ｍ塩化カルシウム貯蔵溶液
０．１６５７Ｊを加えてカルシウム（Ｋ）６度を５ｍＭ
にする。１０分間撹拌後、Ｎｉ（■）：ｈＰＩのモル比
が０．４４：１となるようにニッケル（■〕を固体二塩
化ニッケル・大水化物５．０．＠、：して添加する。こ
の溶液を更（こ１０分間おだやかに撹拌し、ＣｐＢ ４
．８７ ■／ ｍＱ、貯蔵溶液からＣｐＢ （３６，８
ｍＱ、１７９．４■、ｌを加える。次いで１． Ｏを／
ｍＱ貯蔵溶液からトリプシン−ＴＰＣＫ （３５，９
ｍＱ、 ３５゜９■）を加える。ｈＩの分析に従うｈＩ
の最高生成量番こより、１０時間で反応は完結に達する
。生成時点で得られた混合物は約０．２９ ％ Ｄｅｓ
−Ｔｈｒ （Ｂ３０ ）−ｈＩを含み、これはこの化
合物の検出方法における検出限界に近接する値である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、式： 【アミノ酸配列があります】 〔式中、Ｒは水素、化学的もしくは酵素的に開裂しうる
アミノ酸残基、または少なくとも２個のアミノ酸残基を
有し化学的もしくは酵素的に開裂しうるペプチド部分を
表わし； Ｒ＿１はＯＨ、Ａｒｇ−ＹまたはＬｙｓ−Ｙであり、こ
こにＹはＯＨ、アミノ酸残基または少なくとも２個のア
ミノ酸残基を有するペプチド部分を表わし；（Ａ−１）
〜（Ａ−２１）部分はヒトインシュリンＡ−鎖であり； （Ｂ−１）〜（Ｂ−３０）部分はヒトインシュリンＢ−
鎖であり； Ｘは該インシュリンＡ−鎖に、Ａ−１のアミノ基で結合
し、かつ、該インシュリンＢ−鎖に、Ｂ−３０のカルボ
キシル基で結合している部分であつて、Ａ−鎖およびＢ
−鎖の双方を崩壊することなくその双方から酵素的に開
裂しうる部分を表わす〕 で示されるヒトインシュリン前駆体を、原子番号２１〜
３４、３９〜５２、５７〜８４および８９〜９２の金属
のうちの１種ないしそれ以上の金属イオンをヒトインシ
ュリン前駆体１モル当り約０． １〜１０モル含有する水性溶媒中、トリプシンおよびカ
ルボキシペプチダーゼＢで処理することから成る、ヒト
インシュリン前駆体のヒトインシュリンへの変換方法。 ２、金属イオンがクロム、モリブデン、タングステン、
水銀、アンチモン、ビスマス、ニッケル、鉄、コバルト
、亜鉛、カドミウム、銅、スズ、鉛、ユーロピウム、ウ
ラン、白金およびマンガンから成る群から選ばれる金属
イオンである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、金属イオンがニッケル、鉄、コバルト、亜鉛、カド
ミウム、銅、スズ、鉛、ユーロピウム、ウラン、白金お
よびマンガンから成る群から選ばれる金属イオンである
特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、金属イオンがニッケル、亜鉛、コバルトおよびカド
ミウムから成る群から選ばれる金属イオンである特許請
求の範囲第３項記載の方法。 ５、ヒトインシュリン前駆体を、水性溶媒中、約２０ｍ
Ｍを越えない濃度で存在せしめる特許請求の範囲第１〜
４項のいずれかに記載の方法。 ６、ヒトインシュリン前駆体を、水性溶媒中、約１〜３
ｍＭの濃度で存在せしめる特許請求の範囲第５項記載の
方法。 ７、金属イオンを、ヒトインシュリン前駆体モル当り約
０．１〜２モルの量で存在せしめる特許請求の範囲第１
〜６項のいずれかに記載の方法。 ８、金属イオンを、ヒトインシュリン前駆体モル当り約
０．３３〜０．６モルの量で存在せしめる特許請求の範
囲第７項記載の方法。 ９、カルボキシペプチダーゼＢを、ヒトインシュリン前
駆体に対する重量比約（１：１０）〜（１：５，０００
）で存在せしめる特許請求の範囲第１〜８項のいずれか
に記載の方法。 １０、トリプシンを、ヒトインシュリン前駆体に対する
重量比約（１：２０）〜（１：２５０，０００）で存在
せしめる特許請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の
方法。 １１、カルボキシペプチダーゼＢのトリプシンに対する
重量比が約（１：１）〜（１０：１）である特許請求の
範囲第１〜１０項のいずれかに記載の方法。 １２、金属イオンがニッケルおよび亜鉛から成る群から
選ばれる金属イオンである特許請求の範囲第１−１１項
のいずれかに記載の方法。 １３、金属イオンがニッケルイオンである特許請求の範
囲第１２項記載の方法。 １４、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロ
ンチウム、バリウムおよびラジウムから成る群から選ば
れる第２の金属の金属イオンを、混合物に添加する特許
請求の範囲第１〜１３項のいずれかに記載の方法。 １５、第２の金属イオンがカルシウム、バリウム、スト
ロンチウムおよびマグネシウムから成る群から選ばれる
金属イオンである特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、第２の金属イオンがカルシウムイオンである特許
請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、第２の金属イオンを、ヒトインシュリン前駆体モ
ル当り約０．５〜５モルの階で存在せしめる特許請求の
範囲第１４〜１６項のいずれかに記載の方法。 １８、第２の金属イオンを、ヒトインシュリン前駆体１
モル当り約１〜３モルの量で存在せしめる特許請求の範
囲第１７項記載の方法。 １９、ヒトインシュリン前駆体がヒトプロインシュリン
である特許請求の範囲第１〜１８項のいずれかに記載の
方法。 ２０、第１〜１９項のいずれかに記載の方法により製せ
られたヒトインシュリン。
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