JPS63123396A - Ｉｆｎ―オメガのための新しいイースト発現ベクター、その製造方法及びその使用 - Google Patents
Ｉｆｎ―オメガのための新しいイースト発現ベクター、その製造方法及びその使用Info
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- JPS63123396A JPS63123396A JP62266137A JP26613787A JPS63123396A JP S63123396 A JPS63123396 A JP S63123396A JP 62266137 A JP62266137 A JP 62266137A JP 26613787 A JP26613787 A JP 26613787A JP S63123396 A JPS63123396 A JP S63123396A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、） １３巻、４７３９〜４７４９
頁（１９８５年）及びＥＰ−Ａ−０，１７０，２０４号
に、オメガインターフェロンと命名された新しいクラス
のクイズＩのインターフェロン、それらを２コードする
ＤＮＡ配列、それらＤＮＡ配列を含むプラスミド及びそ
の新しいインターフェロンを生産する生物が述べられて
いる。
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、） １３巻、４７３９〜４７４９
頁（１９８５年）及びＥＰ−Ａ−０，１７０，２０４号
に、オメガインターフェロンと命名された新しいクラス
のクイズＩのインターフェロン、それらを２コードする
ＤＮＡ配列、それらＤＮＡ配列を含むプラスミド及びそ
の新しいインターフェロンを生産する生物が述べられて
いる。
一方、先にふれた報告中に明白に述べられている発現プ
ラスミド、例えば、大腸菌ＨＢＩＯＩに各々トランスフ
オームしたｐＲＨｌｌｌｌｌ又はｐＲ）Ｉｔツ１２等を
用いた、新しいオメガ・インターフェロン、特にＩＦＮ
−オメガルの大量のテストサンプルの調製において、望
ましいことにその新しいオメガ・インターフェロン、特
にＩＦＮ−オメガルの発現に増加が見い出された。
ラスミド、例えば、大腸菌ＨＢＩＯＩに各々トランスフ
オームしたｐＲＨｌｌｌｌｌ又はｐＲ）Ｉｔツ１２等を
用いた、新しいオメガ・インターフェロン、特にＩＦＮ
−オメガルの大量のテストサンプルの調製において、望
ましいことにその新しいオメガ・インターフェロン、特
にＩＦＮ−オメガルの発現に増加が見い出された。
また、通常、タイプエのインターフェロンの発現は、原
核生物においても、真核生物においても有意の差はなく
、即ち、おおよそ、同程度であることが知られている（
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２９３巻、７１７〜７２
２頁（１９８１年）、及びＥＭＢＯジャーナル、１巻、
６０３〜６０８頁（１９８２年）参照）。
核生物においても、真核生物においても有意の差はなく
、即ち、おおよそ、同程度であることが知られている（
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ２９３巻、７１７〜７２
２頁（１９８１年）、及びＥＭＢＯジャーナル、１巻、
６０３〜６０８頁（１９８２年）参照）。
驚くべきことに、ＩＦＮ−オメガ、好ましくは、ＩＦＮ
−オメガルの発現は、大腸菌のような細菌における発現
と比較して、イースト中において少なくとも１０００倍
の増加が見られた。
−オメガルの発現は、大腸菌のような細菌における発現
と比較して、イースト中において少なくとも１０００倍
の増加が見られた。
このように、本発明は、イーストのプロモーターの支配
下、ＩＦＮ−オメガ、好ましくはＩＦＮ−オメガルに対
する構造遺伝子を含むイーストベクターでトランスフオ
ームしたイーストを培養し、そして、さらにその発現し
たＩＦＮ−オメガを従来法に従がい単離することを特徴
とする、ＩＦＮ−オメガの調製のための改良法に関する
ものである。
下、ＩＦＮ−オメガ、好ましくはＩＦＮ−オメガルに対
する構造遺伝子を含むイーストベクターでトランスフオ
ームしたイーストを培養し、そして、さらにその発現し
たＩＦＮ−オメガを従来法に従がい単離することを特徴
とする、ＩＦＮ−オメガの調製のための改良法に関する
ものである。
さらに本発明は、本目的のために、相当する新しいイー
スト発現ベクターでトランスフオームした新しいイース
ト、その新しいイースト発現ベクターそのもの及びそれ
らの調製法に関するものである。さらに、本発明のこれ
らの目的物は、次に示す発明に従がい得ることができた
。
スト発現ベクターでトランスフオームした新しいイース
ト、その新しいイースト発現ベクターそのもの及びそれ
らの調製法に関するものである。さらに、本発明のこれ
らの目的物は、次に示す発明に従がい得ることができた
。
ａ）相当するイースト・ベクターの制限酵素消化による
適当なプロモーター断片の単離。
適当なプロモーター断片の単離。
ｂ）相当するプロモーター断片及びＩＦＮ−オメガ遺伝
子から作られた挿入物を受は入れるのに適するイースト
ベクターの線状化。
子から作られた挿入物を受は入れるのに適するイースト
ベクターの線状化。
Ｃ）相当するプラスミドの制限酵素消化による、ＩＦＮ
−オメガに対応する構造遺伝子の単離及び、引きつづく
、生成した構造遺伝子と、ａ）で生成したプロモーター
断片との連結。
−オメガに対応する構造遺伝子の単離及び、引きつづく
、生成した構造遺伝子と、ａ）で生成したプロモーター
断片との連結。
ｄ）ｃ）で調製した断片と、ｂ）に従って線状化したイ
ーストベクターとの連結。
ーストベクターとの連結。
ｅ）ｄ）で調製したイースト・ベクターのトランスフォ
ーメーション及び、それに引き続く、望ましいクローン
の選択。
ーメーション及び、それに引き続く、望ましいクローン
の選択。
ｆ）ｅ）で得られたプラスミド−ＤＮＡのイーストへの
トランスフォーメーション及びそのプラスミド・ＤＮＡ
を含むクローンの複製。
トランスフォーメーション及びそのプラスミド・ＤＮＡ
を含むクローンの複製。
本発明に従えば、イーストと同等なプロモーター、転写
ターミネータ−及びイーストの複製オリジンを含むいか
なるプラスミドも使用することができる。たとえば、１
つの適当なプラスミドは、プラスミドＹＲｐ７（スチン
チコーム（Ｓｔ ｉｎｃｈｃｏｍｂ）等、ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）、２８２巻、３９頁（１９７９年）、キ
ングｘ ？ ：／ （Ｋｉｎｇｓｍａｎ）等、ジーン（
Ｇｅｎｅ）、７巻、１４１頁（１９７９年）、チャンバ
ー（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ）等、ジー７ （Ｇｅｎｅ）、
１０巻、１５７頁、（１９８０年）参照）又は、ＬＥＵ
２−マイナス変異体を相補するのに用いることができる
、イーストの遺伝子ＬＥＵ ２を含む、プラスミドＹＥ
ｐ１３ （ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）等、ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、８巻、１２１−１３３頁（１９７９年））で
ある。
ターミネータ−及びイーストの複製オリジンを含むいか
なるプラスミドも使用することができる。たとえば、１
つの適当なプラスミドは、プラスミドＹＲｐ７（スチン
チコーム（Ｓｔ ｉｎｃｈｃｏｍｂ）等、ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）、２８２巻、３９頁（１９７９年）、キ
ングｘ ？ ：／ （Ｋｉｎｇｓｍａｎ）等、ジーン（
Ｇｅｎｅ）、７巻、１４１頁（１９７９年）、チャンバ
ー（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ）等、ジー７ （Ｇｅｎｅ）、
１０巻、１５７頁、（１９８０年）参照）又は、ＬＥＵ
２−マイナス変異体を相補するのに用いることができる
、イーストの遺伝子ＬＥＵ ２を含む、プラスミドＹＥ
ｐ１３ （ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）等、ジーン（Ｇ
ｅｎｅ）、８巻、１２１−１３３頁（１９７９年））で
ある。
さらに、適当なプロモーター配列は、３−ホスホグリセ
レート・キナーゼ（ヒッツェマン（Ｉ（ｉｔｚｅ＋ｎａ
ｎ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５５巻、２０７
３頁（１９８０年）参照）、又はエノラーゼ、グリセリ
ン、アルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ
、トリオセホスフェート・イソメラーゼ（ＴＰＩ）（ア
ルバー（Ａｌｂｅｒ）等、ジャーナル・オブ・モレキユ
ラー・アンド・アプライド・ジェネテイクス（Ｊ、 ！
、Ｉｏｌｅｃ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、） 、１巻
、４１９〜４３４頁（１９８２年））、ホスホグリセレ
ート・ミューターゼ、アルドラーゼ、ヘキソキナーゼ−
１、ヘキソキナーゼ−２、ピルベート・イソメラーゼ、
ホスホグルコース、イソメラーゼ及びグルコキナーゼの
ような、その他の解糖酵素に対する遺伝子の５′側隣接
領域、アルコール・デヒドロゲナーゼ−２（ウィリアム
ソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）等、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、２８３巻、２１４〜２１６頁（１９８０年）
）、イソチトクロムＣ１アシッド・ホスファターゼ、窒
素代謝と共役する分解酵素及びマルトース及びガラクト
ースのプロセシングに関与する酵素に対する遺伝子のプ
ロモーター領域を含んでいる。また、例えば、温度依存
ＳｉＲ突然変異を用いることによる、温度制御システム
中の遺伝子ＢＡＲＩ、ＭＦα■、５ＴＥ２．５ＴＥ３．
５ＴＥ５のプロモーター等、イーストの接合型部位によ
り制御されるプロモーターを用いることもできる（ライ
ン（Ｒｈｉｎｅ） Ｐ）Ｉ。
レート・キナーゼ（ヒッツェマン（Ｉ（ｉｔｚｅ＋ｎａ
ｎ）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５５巻、２０７
３頁（１９８０年）参照）、又はエノラーゼ、グリセリ
ン、アルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ
、トリオセホスフェート・イソメラーゼ（ＴＰＩ）（ア
ルバー（Ａｌｂｅｒ）等、ジャーナル・オブ・モレキユ
ラー・アンド・アプライド・ジェネテイクス（Ｊ、 ！
、Ｉｏｌｅｃ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、） 、１巻
、４１９〜４３４頁（１９８２年））、ホスホグリセレ
ート・ミューターゼ、アルドラーゼ、ヘキソキナーゼ−
１、ヘキソキナーゼ−２、ピルベート・イソメラーゼ、
ホスホグルコース、イソメラーゼ及びグルコキナーゼの
ような、その他の解糖酵素に対する遺伝子の５′側隣接
領域、アルコール・デヒドロゲナーゼ−２（ウィリアム
ソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）等、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、２８３巻、２１４〜２１６頁（１９８０年）
）、イソチトクロムＣ１アシッド・ホスファターゼ、窒
素代謝と共役する分解酵素及びマルトース及びガラクト
ースのプロセシングに関与する酵素に対する遺伝子のプ
ロモーター領域を含んでいる。また、例えば、温度依存
ＳｉＲ突然変異を用いることによる、温度制御システム
中の遺伝子ＢＡＲＩ、ＭＦα■、５ＴＥ２．５ＴＥ３．
５ＴＥ５のプロモーター等、イーストの接合型部位によ
り制御されるプロモーターを用いることもできる（ライ
ン（Ｒｈｉｎｅ） Ｐ）Ｉ。
Ｄ、セシス（Ｔｈｅｓｉｓ） 、オレゴン大学、ユーゲ
ン（巳ｕｇｅｎｅ）、オレコ゛ン（１９７９年）、ハー
スコウィッッ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）及びオーシマ（
Ｏｓｈｉｍａ） 、イースト、サツカロミセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ） の分子生物学、パート■、
１８１〜２０９頁（１９８１年）、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
）Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
ン（巳ｕｇｅｎｅ）、オレコ゛ン（１９７９年）、ハー
スコウィッッ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）及びオーシマ（
Ｏｓｈｉｍａ） 、イースト、サツカロミセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ） の分子生物学、パート■、
１８１〜２０９頁（１９８１年）、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
）Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。
さらに、どの一般的イーストの培養も考えることができ
るが、特に適していることが分っているものは、サツカ
ロミセス・セレビシアエの０Ｍ３６２株（α、１ｅｕ２
−３．１ｅｕ２−１１２ 、ｔｒｐｌ−Ｌｈｉｓ４−５
１９ ｓ ｃｙｃｌ−１、ｃｙｐ３−１ ）である（Ｇ
。
るが、特に適していることが分っているものは、サツカ
ロミセス・セレビシアエの０Ｍ３６２株（α、１ｅｕ２
−３．１ｅｕ２−１１２ 、ｔｒｐｌ−Ｌｈｉｓ４−５
１９ ｓ ｃｙｃｌ−１、ｃｙｐ３−１ ）である（Ｇ
。
フェイ（Ｆａｙｅ）等、プロシーディング・イン・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、） ７８巻、２２５８
−２２６２頁（１９８１年））。
−２２６２頁（１９８１年））。
しかし、本発明に従って、付加的に、イーストの２μプ
ラスミドの複製オリジン及び転写ターミネータ−を含む
、プロモーターとしてのＡＤＨＩ遺伝子の５′側隣接領
域を用いるのが特に好ましい（Ｇ、アメシー（Ａｍｍｅ
ｒｅｒ）、メソッド・イン・エンザイモロジー（１，１
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎεｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１０１巻
、１９２〜２０１頁（１９８３年）参照）。
ラスミドの複製オリジン及び転写ターミネータ−を含む
、プロモーターとしてのＡＤＨＩ遺伝子の５′側隣接領
域を用いるのが特に好ましい（Ｇ、アメシー（Ａｍｍｅ
ｒｅｒ）、メソッド・イン・エンザイモロジー（１，１
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎεｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１０１巻
、１９２〜２０１頁（１９８３年）参照）。
例えば、ＩＦＮ−オメガルのための、イースト発現ベク
ターは次のように調製する（第１図参照）。
ターは次のように調製する（第１図参照）。
ａ）イーストのＡＤＨＩプロモーター断片を調製するた
めに、ＡＤＨＩプロモーターを含むプラスミド、好まし
くは、プラスミドｐｌＥｓ１０３を、３ａｍ）ＩＩ 及
びＸｈｏｌで消化し、つづいて、約１４５０塩基対長の
プロモーター断片を従来法、例えば、アガロースゲルク
ロマトグラフィー、電気溶出及び引きつづく沈殿化によ
り単離した。これに用いたプラスミド、ｐＥｓ１０３は
、プラスミドＡｘａｌｌ （Ｇ、 アメクー（Ａｍｍ
ｅｒｅｒ）、メソッド・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１０１巻、
１９２−２０１頁（１９８３年）、アカデミツク・プレ
ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）） 由来の約１
４５ Ｑｂｐ長のＡＤＨＩプ０％−クー断片（ＢａｍＨ
Ｉ−Ｘｈｏｌ）を、Ｈｉｎｃ ｆ１部位にＸｈｏｌリン
カ−を挿入することにより修正を加えた、ＰＯＣｌ２
＜ファルマシ７ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） Ｐ −Ｌ
Ｓ製品番号２７−４９４９−０１）に導入することによ
り得た。
めに、ＡＤＨＩプロモーターを含むプラスミド、好まし
くは、プラスミドｐｌＥｓ１０３を、３ａｍ）ＩＩ 及
びＸｈｏｌで消化し、つづいて、約１４５０塩基対長の
プロモーター断片を従来法、例えば、アガロースゲルク
ロマトグラフィー、電気溶出及び引きつづく沈殿化によ
り単離した。これに用いたプラスミド、ｐＥｓ１０３は
、プラスミドＡｘａｌｌ （Ｇ、 アメクー（Ａｍｍ
ｅｒｅｒ）、メソッド・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１０１巻、
１９２−２０１頁（１９８３年）、アカデミツク・プレ
ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）） 由来の約１
４５ Ｑｂｐ長のＡＤＨＩプ０％−クー断片（ＢａｍＨ
Ｉ−Ｘｈｏｌ）を、Ｈｉｎｃ ｆ１部位にＸｈｏｌリン
カ−を挿入することにより修正を加えた、ＰＯＣｌ２
＜ファルマシ７ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ） Ｐ −Ｌ
Ｓ製品番号２７−４９４９−０１）に導入することによ
り得た。
ｂ）適当なイーストベクター、例えば適当なプラスミド
、好ましくは、同出願人により、ゲッチンゲンＤ−３４
００、グリセバッハストラセ（Ｇｒ １ｓｅｂａｃｈｓ
ｔｒａｓｓｅ）、８、ジャーマン・マイクロオーガニズ
ム・コレクション（Ｇｅｒｍａｎ旧ｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ） に、１９８４年、１
２月２８日ＤＳＭ番号３１８１号として大腸菌ＰＲＩ中
に保管されている、プラスミド１）ＪＤＢ２０？ （
Ｖ、Ｄ、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ ｚイーストにおける遺
伝子クローニング、Ｒ，ウィリアム７７ （Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓｏｎ） ４５、遺伝子工学、２巻、１７５〜２０
３頁（１９８１年）、アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） 、ロンドン））を３ａｍＨＩ
で消化し、それにより、イースト−ＡＤＨＩプロモー
ター断片及びＩＦＮ−オメガ遺伝子を含む挿入物を受け
いれるため線状化する。つづいて、挿入物を含まない再
連結を防ぐのに都合がよいように、５′末端のリン酸基
を、好ましくは、ウシの腸ホスファターゼを用いて除い
た。このようにして（尋られた線状化プラスミドを、ア
ガロースゲルクロマトグラフィー、電気溶出及び引きつ
づく沈殿化等の従来法により単離した。
、好ましくは、同出願人により、ゲッチンゲンＤ−３４
００、グリセバッハストラセ（Ｇｒ １ｓｅｂａｃｈｓ
ｔｒａｓｓｅ）、８、ジャーマン・マイクロオーガニズ
ム・コレクション（Ｇｅｒｍａｎ旧ｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ） に、１９８４年、１
２月２８日ＤＳＭ番号３１８１号として大腸菌ＰＲＩ中
に保管されている、プラスミド１）ＪＤＢ２０？ （
Ｖ、Ｄ、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ ｚイーストにおける遺
伝子クローニング、Ｒ，ウィリアム７７ （Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓｏｎ） ４５、遺伝子工学、２巻、１７５〜２０
３頁（１９８１年）、アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ） 、ロンドン））を３ａｍＨＩ
で消化し、それにより、イースト−ＡＤＨＩプロモー
ター断片及びＩＦＮ−オメガ遺伝子を含む挿入物を受け
いれるため線状化する。つづいて、挿入物を含まない再
連結を防ぐのに都合がよいように、５′末端のリン酸基
を、好ましくは、ウシの腸ホスファターゼを用いて除い
た。このようにして（尋られた線状化プラスミドを、ア
ガロースゲルクロマトグラフィー、電気溶出及び引きつ
づく沈殿化等の従来法により単離した。
ｃ）ＩＦＮ−オメガ、好ましくはＩＦＮ−オメガルの構
造遺伝子を単離するために、このインターフェロンをコ
ードする、プラスミドｐＲＨＷ１２ （ＥＰ−Ａ−０，
１７０，２０４） のようなプラスミドを旧ｎｄｌｌ
で線状化し、そして、つづいて、その５′側の突き出た
末端を、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフ
ラグメントを添加することにより、両端をそろえる。好
ましくは、アガロースゲル電気泳動を用いた精製及び単
離の後、その線状型のプラスミドをＸｈｏ Ｉリンカ−
と結合する。これは、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
及びｒＡＴＰの存在下、Ｘｈｏ Ｉリンカ−（ファール
マシア（Ｐｈｏｒｍａｃｉａ） Ｐ −Ｌ ）を用い
ることにより簡便に行なわれる。Ｘｈｏ Ｉ特異的な５
′−突出部を解放させた後、その線状化したｐ ＲＨＷ
１２を、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出等によ
り精製及び単離した。
造遺伝子を単離するために、このインターフェロンをコ
ードする、プラスミドｐＲＨＷ１２ （ＥＰ−Ａ−０，
１７０，２０４） のようなプラスミドを旧ｎｄｌｌ
で線状化し、そして、つづいて、その５′側の突き出た
末端を、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフ
ラグメントを添加することにより、両端をそろえる。好
ましくは、アガロースゲル電気泳動を用いた精製及び単
離の後、その線状型のプラスミドをＸｈｏ Ｉリンカ−
と結合する。これは、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
及びｒＡＴＰの存在下、Ｘｈｏ Ｉリンカ−（ファール
マシア（Ｐｈｏｒｍａｃｉａ） Ｐ −Ｌ ）を用い
ることにより簡便に行なわれる。Ｘｈｏ Ｉ特異的な５
′−突出部を解放させた後、その線状化したｐ ＲＨＷ
１２を、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出等によ
り精製及び単離した。
それから、好ましくは、沈殿させる前に、ａ）で調製し
た断片と、この断片を合わせ、そして、この合せた断片
をＴＥバッファ等のような適当なバッファに溶かした後
、それらを、Ｔ４−ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いて連結する
。
た断片と、この断片を合わせ、そして、この合せた断片
をＴＥバッファ等のような適当なバッファに溶かした後
、それらを、Ｔ４−ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いて連結する
。
このようにして得た連結断片をＢａｍ旧で切断し、そし
て、アガロースゲル精製等の従来法により精製した。
て、アガロースゲル精製等の従来法により精製した。
ｄ）ＡＤＨＩプロモーター及びＩＦＮ−オメガ遺伝子を
含むＣ）で得られたＢａｎ旧断片を、適当な線状化した
ベクター、好ましくは、ａ）で調製したベクターと、好
ましくは、Ｔ４−Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼの存在下、連
結する。
含むＣ）で得られたＢａｎ旧断片を、適当な線状化した
ベクター、好ましくは、ａ）で調製したベクターと、好
ましくは、Ｔ４−Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼの存在下、連
結する。
ｅ）この望ましいベクターを含む、リガーゼ溶液で大腸
菌ＨＢＩＯＩをトランスフオームした。望ましい構造を
もつクローンをその他のものから選択する。ＩＦＮ−オ
メガル構造遺伝子の場合、このクローンをｐＹ−ＪＤＢ
−ＨｕＩＦＮ −オメガルと命名した。
菌ＨＢＩＯＩをトランスフオームした。望ましい構造を
もつクローンをその他のものから選択する。ＩＦＮ−オ
メガル構造遺伝子の場合、このクローンをｐＹ−ＪＤＢ
−ＨｕＩＦＮ −オメガルと命名した。
ｆ）ｅ）で得られたプラスミドＤＮＡをイースト中、好
ましくは、イースト、Ｇｌ、ｌ−３Ｃ２株に組込む。セ
ルロースを含むイーストの細胞壁を酵素的に除去する。
ましくは、イースト、Ｇｌ、ｌ−３Ｃ２株に組込む。セ
ルロースを含むイーストの細胞壁を酵素的に除去する。
スフェロプラストと呼ばれる、このようにして得た裸の
細胞を、プラスミドＤＮＡを添加した、塩化カルシウム
及び膜に透過性を与え、プラスミドＤＮＡを吸収しうる
ようにするポリエチレングリコールのようなアルコール
を含む培地にさらす。それから、そのスフ二口プラスト
を寒天の中に埋め、それらの細胞膜を再生させた後、そ
れらを培養する。
細胞を、プラスミドＤＮＡを添加した、塩化カルシウム
及び膜に透過性を与え、プラスミドＤＮＡを吸収しうる
ようにするポリエチレングリコールのようなアルコール
を含む培地にさらす。それから、そのスフ二口プラスト
を寒天の中に埋め、それらの細胞膜を再生させた後、そ
れらを培養する。
ｆ）で得られたイースト培養液を３０℃で少なくとも４
０時間インキュベーションしたのち遠心する。このイン
キユベーションの間に形成したＩＦＮ−オメガを、ガラ
スピーズによる破壊とそれにつづく、塩酸グアニジンに
よる溶出等の従来法に従い、遠心ペレットから単離する
。ＣＰＥ還元テストは、イースト培養液１リットル当り
、少なくともＩ Ｘ １０’ユニツトのＩＦＮ−オメガ
活性を示した。
０時間インキュベーションしたのち遠心する。このイン
キユベーションの間に形成したＩＦＮ−オメガを、ガラ
スピーズによる破壊とそれにつづく、塩酸グアニジンに
よる溶出等の従来法に従い、遠心ペレットから単離する
。ＣＰＥ還元テストは、イースト培養液１リットル当り
、少なくともＩ Ｘ １０’ユニツトのＩＦＮ−オメガ
活性を示した。
この新しいイースト発現クローンによるＩＦＮ−オメガ
ルの驚くべき高い合成は、ヒトのＩＦＮ−オメガルの大
腸菌中での合成がＩＦＮ−α２（Ａｒｇ） の合成よ
りも３桁程低い値であったことから、予想できないもの
であった（ＢＰ−Ａ−０，１１５，６１３参照）。その
プロモーター ＋７ボゾ一ム結合部位−遺伝子という構
造が、ｐＲｆｌＷ１２ （ＢＰ−Ａ−０，１７０，２０
４参照）及びｐＥＲ３３（ＢＰ−Ａ−０，１１５，６１
３） クローンにおけるものと同一であることから、
このことは−層驚くべきことである。このように、プラ
スミドｐＹ−ＪＤＢ−）１ｕｌＦＮ−オメガルヘ、ＩＦ
Ｎ−オメガル遺伝子の代りに、ＩＦＮ−α２ （Ａｒｇ
）を導入したときでさえ、リットル当りＩ Ｘ １０＠
ユニットのＩＦＮ−α２ （Ａｒｇ）が発現した。
ルの驚くべき高い合成は、ヒトのＩＦＮ−オメガルの大
腸菌中での合成がＩＦＮ−α２（Ａｒｇ） の合成よ
りも３桁程低い値であったことから、予想できないもの
であった（ＢＰ−Ａ−０，１１５，６１３参照）。その
プロモーター ＋７ボゾ一ム結合部位−遺伝子という構
造が、ｐＲｆｌＷ１２ （ＢＰ−Ａ−０，１７０，２０
４参照）及びｐＥＲ３３（ＢＰ−Ａ−０，１１５，６１
３） クローンにおけるものと同一であることから、
このことは−層驚くべきことである。このように、プラ
スミドｐＹ−ＪＤＢ−）１ｕｌＦＮ−オメガルヘ、ＩＦ
Ｎ−オメガル遺伝子の代りに、ＩＦＮ−α２ （Ａｒｇ
）を導入したときでさえ、リットル当りＩ Ｘ １０＠
ユニットのＩＦＮ−α２ （Ａｒｇ）が発現した。
次に示す実施例は、本発明を説明するためのものであり
それを制限するものではない。
それを制限するものではない。
参考例
ＩＦＮ−オメガルイースト発現ベクターのための構築計
画は一定の比例に応じて抽かれたものではない（第１図
参照）。
画は一定の比例に応じて抽かれたものではない（第１図
参照）。
酵素反応は製造業者の説明書に従って行なった。
その他の技術は、例えば、Ｔ、マニアチス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）（こよる“モレキユラー・フローニングーラボ
ラトリー・マニュアル″（コールド・スプリング・ハー
バ−１１９８２年）に見られるような、標準的技術を用
いた。
ｔｉｓ）（こよる“モレキユラー・フローニングーラボ
ラトリー・マニュアル″（コールド・スプリング・ハー
バ−１１９８２年）に見られるような、標準的技術を用
いた。
イーストのトランスフォーメーションにおいては、次に
示すイースト培地を用いた。
示すイースト培地を用いた。
ＹＮＢ十ＣＡＡ培地（１リツトル）；
６．７ｇ ＹＮＢ（アミノ酸なし）
５ｇ カザミノ酸
２０ｇ グルコース
水
ＹＰＤ培地（１リツトル）；
１０ｇ イースト・エクストラクト２０ｇ バ
クトーペブトン ２０ｇ グルコース 水 ２０−の５０ＸマイナスＬｅｕ ドロップアウト溶液
；０．２５ｇ トリプトファン ０、２０ ｇ アルギニン ０、１０ ｇ ヒスチジン ０、６０ ｇ インロイシン ０、４０ ｇ リジン ０、１０ ｇ メチオニン ０、６０ ｇ フェニルアラニン ０、５０ ｇ スレオニン ０、１２ ｇ アデニン ０、２４ ｇ ウラシル 水 除菌濾過 ソルビトール・プレー）（６００ｍｌ）；１０９、２
ｇ ソルビトール １２ｇ グルコース ４．０２ｇ ＹＮＢ １５ｇ 寒天 水、 オートクレーブ及び４５℃まで冷却後、ドロップアウト
溶液添加。その後、シャーレに分配する。
クトーペブトン ２０ｇ グルコース 水 ２０−の５０ＸマイナスＬｅｕ ドロップアウト溶液
；０．２５ｇ トリプトファン ０、２０ ｇ アルギニン ０、１０ ｇ ヒスチジン ０、６０ ｇ インロイシン ０、４０ ｇ リジン ０、１０ ｇ メチオニン ０、６０ ｇ フェニルアラニン ０、５０ ｇ スレオニン ０、１２ ｇ アデニン ０、２４ ｇ ウラシル 水 除菌濾過 ソルビトール・プレー）（６００ｍｌ）；１０９、２
ｇ ソルビトール １２ｇ グルコース ４．０２ｇ ＹＮＢ １５ｇ 寒天 水、 オートクレーブ及び４５℃まで冷却後、ドロップアウト
溶液添加。その後、シャーレに分配する。
トップアガー（１リツトル）；
１８２ｇ ソルビトール
２０ｇ グルコース
６．７ｇ ＹＮＢ
２５ｇ 寒天 ゛
水
オートクレーブ
ＳＥＤ （２５ｍｊり ；
１２．５ｍｌ！ ２Ｍソルビトール１．２５ｍ１
０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｌｌ、２５ｒｄ 蒸留水 １９２．７５ｍ１！ ＤＴＴ（ジチオスレイトール
）除菌濾過 ＳＣＥ （２５ｄ） ； １２．５Ｉｎ１ ２Ｍソルビトール ５ ｍ１０．５ Ｍクエン酸ナトリウム０．５ｍｌ！
０．５Ｍ ＥＤＴＡ７１ｎ！！ 滅菌
蒸留水 ＣＡＳ （２５−）； １２．５ｍｊｌ！ ２Ｍソルビトール２、５ ｍ
ｌ １００ｍＭ ＣａＣ１＊０．２５ｍ１！
ＩＭ） リ ス （ｐＨ７，５）９．７５ｍ
Ａ 滅菌蒸留水 ＰＥＧ溶液（２０ｍｊり； ４ｇ ＰＥＧ ４０００（ポリエチレングリコー
ル、サーバ（ＳＥＲＶＡ） ’）２ｍｆ １００ｍ
！Ｊ ＣａＣｊ！２０．２ｍｌ！ ＩＭ）
リ ス （ｐＨ７，５）１７、８ ｍｌ 蒸留水 除菌濾過 ＳＯＧ （５ｍｌ） ； ２．５ｍｌ ２Ｍソルビトール １．７ｍ！ＹＰＤ ０、３ ｍｌ！ １００ｍＭ ＣａＣＣ１２，５
μｍ ５０×マイナスしｅｕ ドロップアウト溶液
七 ０、５ ｍｌ！ 蒸留水 除菌濾過 実施例 ＩＦＮ−オメガルのためのイースト発現ベクターの構築 ａ）イーストＡＤＨＩプロモーター断片の調製５００μ
ｌの溶液中の５０ｇｇのプラスミドｐＢｓ１０３ （ブ
ダペスト協定に基づいて、１９８７ （年２月２７日
、デューシエ・サムラング・フォー〇マイクロオーガニ
ズメン（Ｄｅｎｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍ］ｕｎｇｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）において、大腸菌）
１８１０１株中、ＤＭＳ−Ｎα４０１３として登録され
ている）をＢａｍ旧及びＸｈｏ Ｉで２重消化した。お
よそ１４５０塩基対長のプロモーター断片を１％アガロ
ースゲルにより、ベクターから分離し、電気溶出及び沈
殿化により単離した。その断片を４０ｐｆｌのＴＥバッ
フｙ（１０ｍＭ）リス、ＩｎｔｌＢＤＴＡ 、 ｐＨ８
’）に溶かした。
０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｌｌ、２５ｒｄ 蒸留水 １９２．７５ｍ１！ ＤＴＴ（ジチオスレイトール
）除菌濾過 ＳＣＥ （２５ｄ） ； １２．５Ｉｎ１ ２Ｍソルビトール ５ ｍ１０．５ Ｍクエン酸ナトリウム０．５ｍｌ！
０．５Ｍ ＥＤＴＡ７１ｎ！！ 滅菌
蒸留水 ＣＡＳ （２５−）； １２．５ｍｊｌ！ ２Ｍソルビトール２、５ ｍ
ｌ １００ｍＭ ＣａＣ１＊０．２５ｍ１！
ＩＭ） リ ス （ｐＨ７，５）９．７５ｍ
Ａ 滅菌蒸留水 ＰＥＧ溶液（２０ｍｊり； ４ｇ ＰＥＧ ４０００（ポリエチレングリコー
ル、サーバ（ＳＥＲＶＡ） ’）２ｍｆ １００ｍ
！Ｊ ＣａＣｊ！２０．２ｍｌ！ ＩＭ）
リ ス （ｐＨ７，５）１７、８ ｍｌ 蒸留水 除菌濾過 ＳＯＧ （５ｍｌ） ； ２．５ｍｌ ２Ｍソルビトール １．７ｍ！ＹＰＤ ０、３ ｍｌ！ １００ｍＭ ＣａＣＣ１２，５
μｍ ５０×マイナスしｅｕ ドロップアウト溶液
七 ０、５ ｍｌ！ 蒸留水 除菌濾過 実施例 ＩＦＮ−オメガルのためのイースト発現ベクターの構築 ａ）イーストＡＤＨＩプロモーター断片の調製５００μ
ｌの溶液中の５０ｇｇのプラスミドｐＢｓ１０３ （ブ
ダペスト協定に基づいて、１９８７ （年２月２７日
、デューシエ・サムラング・フォー〇マイクロオーガニ
ズメン（Ｄｅｎｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍ］ｕｎｇｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）において、大腸菌）
１８１０１株中、ＤＭＳ−Ｎα４０１３として登録され
ている）をＢａｍ旧及びＸｈｏ Ｉで２重消化した。お
よそ１４５０塩基対長のプロモーター断片を１％アガロ
ースゲルにより、ベクターから分離し、電気溶出及び沈
殿化により単離した。その断片を４０ｐｆｌのＴＥバッ
フｙ（１０ｍＭ）リス、ＩｎｔｌＢＤＴＡ 、 ｐＨ８
’）に溶かした。
１）ベクターｐＪＤＢ２０７の調製
１００、！ｊｊ！溶液中の１０ μｇｐＪＤＢ２０７を
ＢａｍＨｌで切断し、線状化した。連続的な再結合を妨
ぐために、５′−末端リン酸基をウシの腸ホスファター
ゼ（ＣＩＰ）を用いて除去する。線状型のものを１％ア
ガロースゲルにより、未切断プラスミドと分離し、その
後、電気溶出及び沈殿化により抽出した。そのベクター
ＤＮＡを、２０μｌのＴＥバッファに溶かした。
ＢａｍＨｌで切断し、線状化した。連続的な再結合を妨
ぐために、５′−末端リン酸基をウシの腸ホスファター
ゼ（ＣＩＰ）を用いて除去する。線状型のものを１％ア
ガロースゲルにより、未切断プラスミドと分離し、その
後、電気溶出及び沈殿化により抽出した。そのベクター
ＤＮＡを、２０μｌのＴＥバッファに溶かした。
：）ＩＦＮ−オメガルの発現ベクター
６００μｌ溶液中、５０ｇｇのプラスミドｐＲ）ＩＷ
１２をＨｉｎｄ ■で線状化した。その５′突出端を、
ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノーフラグメント（１０ユ
ニツト）及び４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（各
２５ｍＭ）を加え、室温でインキユベーションすること
により、プラントエンドとした。その線状プラスミドを
アガロースゲル電気泳動により精製し、単離した。そし
てその断片を５０μｌのＴＥバッファに溶解した。
１２をＨｉｎｄ ■で線状化した。その５′突出端を、
ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノーフラグメント（１０ユ
ニツト）及び４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（各
２５ｍＭ）を加え、室温でインキユベーションすること
により、プラントエンドとした。その線状プラスミドを
アガロースゲル電気泳動により精製し、単離した。そし
てその断片を５０μｌのＴＥバッファに溶解した。
プロモーター断片と同等な末端を作るために、線状ｐＲ
ＨＷ１２の末端にＸｈｏ Ｉ リンカ−を付加しなけれ
ばならない。２０μβ中、３μｌのＸｈｏ Ｉリンカ−
（０，０６０Ｄ２５０ｎｍ、 ７フル？シア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ） 、Ｐ −Ｌ 、製品番号２７−７７５８
−０１、式ｄ ［ＣＣＴＣＧＡＧＧ） ）を５ユニツト
のＴ４−ポリヌクレオチド・キナーゼ及びｒＡＴＰを用
いてリン酸化した。７０℃、１０分間の加熱によりその
酵素を失活した後、５μβのこの溶液を、１０μｌの線
状ｐＲＨ１１１２と合わせ、そして、計２０μｌの反応
溶液中、Ｔ４−ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いて連結した（１
４℃、１６時間）。７０℃、１０分間の処理でリガーゼ
を失活させた後、１ｘメデイアムハツフアー（１０１Ｔ
ＩＭトリス、ｐ）１７．５．５０ｍＭ ＮａＣ１，１０
ｍＭ ＭｇＣｊ！ りを用い、その反応容積を１５０μ
ｌとした。
ＨＷ１２の末端にＸｈｏ Ｉ リンカ−を付加しなけれ
ばならない。２０μβ中、３μｌのＸｈｏ Ｉリンカ−
（０，０６０Ｄ２５０ｎｍ、 ７フル？シア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ） 、Ｐ −Ｌ 、製品番号２７−７７５８
−０１、式ｄ ［ＣＣＴＣＧＡＧＧ） ）を５ユニツト
のＴ４−ポリヌクレオチド・キナーゼ及びｒＡＴＰを用
いてリン酸化した。７０℃、１０分間の加熱によりその
酵素を失活した後、５μβのこの溶液を、１０μｌの線
状ｐＲＨ１１１２と合わせ、そして、計２０μｌの反応
溶液中、Ｔ４−ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いて連結した（１
４℃、１６時間）。７０℃、１０分間の処理でリガーゼ
を失活させた後、１ｘメデイアムハツフアー（１０１Ｔ
ＩＭトリス、ｐ）１７．５．５０ｍＭ ＮａＣ１，１０
ｍＭ ＭｇＣｊ！ りを用い、その反応容積を１５０μ
ｌとした。
Ｘｈｏ Ｉ特異的な５′突出末端を、１００ユニツトの
Ｘｈｏ Ｉで処理することにより遊離した。
Ｘｈｏ Ｉで処理することにより遊離した。
Ｘｈｏ Ｉ末端を与えられた線状ｐＲＨＷ１２をアガロ
ースゲル電気泳動により精製し、そして、ゲルから電気
溶出した。沈殿化の前に、５μｌのプロモーター断片（
ポイン）ａ）を加えた。沈殿化の後、そのＤＮＡ分子を
１４．５μｌのＴＥバッファに溶かした。そして、リガ
ーゼバッファ及び５ユニツトのＴ ４− Ｄ Ｎ Ａ
リガーゼを加えた後、１４℃、１６時間で連結した。加
熱により、その酵素を失活させた後、その溶液の容積を
、ＩＸメディアム・バッファを用いて２００μｌとし、
そしてそのＤＮＡをＢａｍＨｌで切断した。
ースゲル電気泳動により精製し、そして、ゲルから電気
溶出した。沈殿化の前に、５μｌのプロモーター断片（
ポイン）ａ）を加えた。沈殿化の後、そのＤＮＡ分子を
１４．５μｌのＴＥバッファに溶かした。そして、リガ
ーゼバッファ及び５ユニツトのＴ ４− Ｄ Ｎ Ａ
リガーゼを加えた後、１４℃、１６時間で連結した。加
熱により、その酵素を失活させた後、その溶液の容積を
、ＩＸメディアム・バッファを用いて２００μｌとし、
そしてそのＤＮＡをＢａｍＨｌで切断した。
望ましいＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により精製し
、そして２０μβの ＴＥバッファに溶かした。
、そして２０μβの ＴＥバッファに溶かした。
ｄ）断片の連結
最終的な発現ベクターは、５μｌのＢａｍ ）ＩＩ断片
（プロモーター及びＩＦＮ−オメガル遺伝子）と、ｌμ
ｌの線状ｐＪＤＢ２０７ ベクター（イースト２ｍｃｎ
ターミネータ−及びイースト２ｆＩＩＣｎ複製オリジ
ン、Ｌｅｕ２マーカー、大腸菌複製オリジン、アンピシ
リン耐性遺伝子）を、１ユニツトの７４−ＤＮＡリガー
ゼの存在下、計１０μｌの溶液中で連結することにより
生成した。
（プロモーター及びＩＦＮ−オメガル遺伝子）と、ｌμ
ｌの線状ｐＪＤＢ２０７ ベクター（イースト２ｍｃｎ
ターミネータ−及びイースト２ｆＩＩＣｎ複製オリジ
ン、Ｌｅｕ２マーカー、大腸菌複製オリジン、アンピシ
リン耐性遺伝子）を、１ユニツトの７４−ＤＮＡリガー
ゼの存在下、計１０μｌの溶液中で連結することにより
生成した。
ｅ））ランスフォーメーション
１０μ５ｊ２の大腸菌ＨＢＩＯＩ株のコンピテント細胞
に、５μｌのりガーゼ溶液を加えることにより、トラン
スフオームし、１００μｇ ／ｍ１のアンピシリンを含
むＬＢ寒天上にブレーティングした。
に、５μｌのりガーゼ溶液を加えることにより、トラン
スフオームし、１００μｇ ／ｍ１のアンピシリンを含
むＬＢ寒天上にブレーティングした。
形成した１２個のクローンをランダムに選び出し、そし
て、そこに含まれるプラスミドを、小スケール（１，５
ｍｌ！培養）で単離した。これらのプラスミドを種々の
制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行った後
、望ましい構造を持つプラスミドを選択し、ｐＹ−ＪＤ
Ｂ−１１ｕ［ＦＮ−オメガルと命名した。
て、そこに含まれるプラスミドを、小スケール（１，５
ｍｌ！培養）で単離した。これらのプラスミドを種々の
制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動を行った後
、望ましい構造を持つプラスミドを選択し、ｐＹ−ＪＤ
Ｂ−１１ｕ［ＦＮ−オメガルと命名した。
ｆ）イーストのトランスフォーメーション前培養として
、２５−のＹＰＤにイーストのコロニー（０Ｍ３−Ｃ２
株）を接種した。その培養液を３０℃で一晩生育させた
。１００−のＹＰＤに１００μｌの前培養液を接種し、
ＯＤ６６０１ｍが１となるまで（ｒｄ当り約４Ｘ１０’
細胞）、３０℃で生育させた。そのイースト細胞を遠心
（５０００ｒｐｍ、 ５分間）により分離した。
、２５−のＹＰＤにイーストのコロニー（０Ｍ３−Ｃ２
株）を接種した。その培養液を３０℃で一晩生育させた
。１００−のＹＰＤに１００μｌの前培養液を接種し、
ＯＤ６６０１ｍが１となるまで（ｒｄ当り約４Ｘ１０’
細胞）、３０℃で生育させた。そのイースト細胞を遠心
（５０００ｒｐｍ、 ５分間）により分離した。
そのペレットを１０ｍ！！のＳＥＤに再懸濁し、３０℃
で１０分間インキュベートした。その細胞をもう一度遠
心で落した（２００Ｏｒｐｍ、 ５分間）。
で１０分間インキュベートした。その細胞をもう一度遠
心で落した（２００Ｏｒｐｍ、 ５分間）。
この細胞をＬｏｍｌのＳＣＥに再度懸濁させた。
１００μｌのグルスラーゼ（Ｂ−グルクロニダーゼ（Ｂ
−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）アリールスルファター
ゼ（ａｒｙｌｓｕｌｐｈａｔａｓｅ） 、ベーリンガー
マンハイム）を加え、混合物を３０℃で３０分間インキ
ュベートし、スフェロプラストを形成した。
−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）アリールスルファター
ゼ（ａｒｙｌｓｕｌｐｈａｔａｓｅ） 、ベーリンガー
マンハイム）を加え、混合物を３０℃で３０分間インキ
ュベートし、スフェロプラストを形成した。
次に、このスフェロプラストを遠心分離（２００Ｏｒｐ
ｍで５分間）して除いた。ペレットをもう一度ＣＡＳで
洗浄し、そして５００μｌのＣＡＳに再懸濁した。
ｍで５分間）して除いた。ペレットをもう一度ＣＡＳで
洗浄し、そして５００μｌのＣＡＳに再懸濁した。
１２０μｌのスフ二口プラストを６μｇのプラスミドＤ
Ｎ Ａ ＣｐＹ−ＪＤＢ−ＨｕＩＦＮ−オメガル）と
合わせ、室温で１５分間、インキユベートした。
Ｎ Ａ ＣｐＹ−ＪＤＢ−ＨｕＩＦＮ−オメガル）と
合わせ、室温で１５分間、インキユベートした。
１ｒｎＪ２のＰ Ｅ Ｃ，溶液を添加した後、室温でさ
らに１５分間インキュベーションを行ない、それからそ
の細胞を遠心で分離した（２００Ｏｒｐｍ 、 ５分間
）。そのペレットを１５０μｌのＳＯＧに再懸濁し、３
０℃で３０分間インキュベートした。
らに１５分間インキュベーションを行ない、それからそ
の細胞を遠心で分離した（２００Ｏｒｐｍ 、 ５分間
）。そのペレットを１５０μｌのＳＯＧに再懸濁し、３
０℃で３０分間インキュベートした。
それから、５ｄのトップアガーと２５０μｌの５０×マ
イナスＬｅｕ ドロップ・アウト溶液混合物を加え、
その細胞をメルビトールプレートにブレーティングした
。２〜４日間の３０℃インキュベーションの後、コロニ
ーが出現してきた。
イナスＬｅｕ ドロップ・アウト溶液混合物を加え、
その細胞をメルビトールプレートにブレーティングした
。２〜４日間の３０℃インキュベーションの後、コロニ
ーが出現してきた。
ｇ）イースト細胞分解物
２５ｍｊ！のＹＮＢとＣＡＡ培地混合物に、トランスフ
オームしたイーストコロニーを接種した。
オームしたイーストコロニーを接種した。
イノキュレーション時間は、３０℃で少なくとも４０時
間とする。この培養液１３−を、４５００ｒｐｍ ％
５分間の遠心で分離した。そのペレットをポルテックス
することにより、２Ｍ塩酸グアニジン０．５−に再ｇｌ
した。２ｍｌのガラスピーズ（直径０．４〜０．５ ｍ
ｌｌ１）を加えた後、その混合物を４℃で１０分間、激
しく攪拌した。それから、その上清をエッペンドルフチ
ューブに移し、０℃でインキユベートした。７Ｍの塩酸
グアニジン０．５−でガラスピーズを１回洗浄し、その
洗浄液を第１の上清に加えた。この溶液をエッペンドル
フ遠心分離機により１２０００ｒｆ１ｍで１分間遠心分
離した。ＣＰＥ還元テストにより上清のインターフェロ
ン活性を調べた。イースト培養物１１当りｌＸＩＯ３ユ
ニットのＩＦＮ−オメガルが得られた。
間とする。この培養液１３−を、４５００ｒｐｍ ％
５分間の遠心で分離した。そのペレットをポルテックス
することにより、２Ｍ塩酸グアニジン０．５−に再ｇｌ
した。２ｍｌのガラスピーズ（直径０．４〜０．５ ｍ
ｌｌ１）を加えた後、その混合物を４℃で１０分間、激
しく攪拌した。それから、その上清をエッペンドルフチ
ューブに移し、０℃でインキユベートした。７Ｍの塩酸
グアニジン０．５−でガラスピーズを１回洗浄し、その
洗浄液を第１の上清に加えた。この溶液をエッペンドル
フ遠心分離機により１２０００ｒｆ１ｍで１分間遠心分
離した。ＣＰＥ還元テストにより上清のインターフェロ
ン活性を調べた。イースト培養物１１当りｌＸＩＯ３ユ
ニットのＩＦＮ−オメガルが得られた。
第１図は、ＩＦＮ−オメガルのための、イースト発現ベ
クターの調製法を示す概略図である。 ヴアック トブルンネシ［ ｙ’国７−２０００ シュトツケラウ エルンシュ・
レシュトラーセ ２−１−４ 凹 アー１１３０ ヴイーナー ヒーツインガー１ト
ラーセ ４０べ一
クターの調製法を示す概略図である。 ヴアック トブルンネシ［ ｙ’国７−２０００ シュトツケラウ エルンシュ・
レシュトラーセ ２−１−４ 凹 アー１１３０ ヴイーナー ヒーツインガー１ト
ラーセ ４０べ一
Claims (13)
- （１）ＩＦＮ−オメガに対する遺伝情報及びイースト中
での発現に必要な複製及び制御配列を含む発現ベクター
でトランスフォームしたイーストを培養し、この情報を
発現し、及びこのようにして得られたＩＦＮ−オメガを
単離することを特徴とするＩＦＮ−オメガの製造方法。 - （２）発現ベクターがＩＦＮ−オメガルに対する遺伝情
報をもつ特許請求の範囲第１項記載の方法。 - （３）発現ベクターがＡＤＨＩ−遺伝子のプロモーター
、イーストの２ｍｃｎプラスミドの複製オリジン及び転
写ターミネーターを含む特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - （４）発現ベクターがＩＦＮ−オメガルに対する遺伝情
報及びイーストのＡＤＨＩ−プロモーター及びイースト
の２ｍｃｎプラスミドの複製オリジン及び転写ターミネ
ーターを、その遺伝情報が発現できるような形で含む特
許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載の
方法。 - （５）使用される発現ベクターが次に示す制限地図を有
するプラスミドｐＹ−ＪＤＢ−ＨｕＩＦＮ−オメガルで
ある特許請求の範囲第４項記載の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ - （６）ＩＦＮ−オメガに対する遺伝情報及びイースト中
での発現に必要な複製及び制御配列を含む、イーストの
発現ベクター。 - （７）ＩＦＮ−オメガルに対する遺伝情報を含む特許請
求の範囲第６項記載のイーストの発現ベクター。 - （８）イーストのＡＤＨＩ−プロモーター及びイースト
の２ｍｃｎプラスミドの複製オリジン及び転写ターミネ
ーターを含む特許請求の範囲第６項記載のイーストの発
現ベクター。 - （９）次に示す制限地図を有するｐＹ−ＪＤＢ−ＨｕＩ
ＦＮ−オメガルと命名した、特許請求の範囲第６項乃至
第８項記載のイーストの発現ベクター。 ▲数式、化学式、表等があります▼ - （１０）特許請求の範囲第６項乃至第９項のいずれか１
項に記載のイーストの発現ベクターでトランスフォーム
したイースト。 - （１１）ＧＭ３−Ｃ２株のイーストを使用する特許請求
の範囲第１０項記載のイースト。 - （１２）必要とされる複製及び制御配列とともに、ＩＦ
Ｎ−オメガに対する遺伝情報が、その情報が発現できる
形でベクターに挿入されていることを特徴とする、特許
請求の範囲第６項乃至第９項記載のイーストの発現ベク
ターの製造方法。 - （１３）イーストが、特許請求の範囲第６項乃至第９項
のいずれか１項に記載のイーストの発現ベクターでトラ
ンスフォームされることを特徴とする、特許請求の範囲
第１０項又は第１１項に記載のトランスフォームしたイ
ーストの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3635867.3 | 1986-10-22 | ||
| DE19863635867 DE3635867A1 (de) | 1986-10-22 | 1986-10-22 | Neue hefeexpressionsvektoren fuer ifn-omega, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63123396A true JPS63123396A (ja) | 1988-05-27 |
Family
ID=6312199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62266137A Pending JPS63123396A (ja) | 1986-10-22 | 1987-10-21 | Ｉｆｎ―オメガのための新しいイースト発現ベクター、その製造方法及びその使用 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0264790A3 (ja) |
| JP (1) | JPS63123396A (ja) |
| KR (1) | KR880005267A (ja) |
| AU (1) | AU601499B2 (ja) |
| DE (1) | DE3635867A1 (ja) |
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