JPS63129987A - 酵素反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は酵素反応方法に関するものであり、詳しくは、
酵素固定した限外濾過膜を用いて水不溶性基質から反応
生成物を得るための酵素反応方法に関する。

〈従来の技術〉 酵素反応を利用した工業的な規梗での実施は医薬品、食
品などの製造において一部行われているが、そのほとん
どは水溶液中で酵素と基質を反応させて生成物を得るも
のであり、反応後における生成物と酵素の分離、反応後
の活性な酵素の回収など非常に困難な問題が多く存在し
ている。

このような問題を解決するために、担体結合法や架橋法
、包括法等の手法によって酵素を固定した、所謂固定化
酵素の開発や利用が近年試みられている。

しかし、上記手法による固定化酵素は通常、基？７溶液
との混合による接触にて酵素反応させるので、酵素反応
終了後の固定化酵素の回収は溶液状態で反応させる従来
法よりも容易となるが、分離操作を別工程として反応後
に行う必要がある。

そこで、本発明者らは酵素反応を行うと同時に、反応生
成物と基質の分離を行える機能を有する固定化酵素とし
て、限外濾過膜のような選択性透過膜に酵素を固定した
酵素固定膜を既に提案している（特願昭６０−２２５４
３５号公報）。

〈発明が解決しようとする問題点〉 ところが、このように膜を利用した酵素固定Ｄｉは酵素
反応と反応生成物の分離が同時に行え、且つ連続操作に
よる反応が可能であるという利点を有する反面、上記反
応等は適度な加圧条件下で原液を選択性透過膜に供給す
ることによって行うので、水不溶性基質が原液中に存在
する場合、経時的に該透過膜の膜面、膜中に基質が付着
して透過液量の減少や反応効率の低下を起こす場合があ
った。

〈問題点を解決するための手段〉 本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討を重ね
た結果、水不溶性基質を、酵素固定した限外濾過膜にて
酵素反応させるに際し、水不溶性基質を酵素固定した水
不溶性担体と水中にて接触させて該基質を可溶化廿しめ
たのち、可溶分を濾過する前工程を行い、得られた濾液
を前記限外）［づ過膜へ供給することによって、限外濾
過膜に基質が付着して透過液量が経時的に減少すること
もなく、また長時間に亘って酵素活性および反応効率を
高く維持できることを見い出し、本発明に至ったもので
ある。

即ち、本発明の酵素反応方法は、水不溶性基質を、酵素
固定した水不溶性担体と水中にて混合、接触させて可溶
化基質に変換せしめ、得られた可溶化基質を濾過する工
程と、前記工程による可溶化基質を含む濾液を酵素固定
した限外濾過膜に通液して酵素反応を行なう工程を含む
ことを特徴とするものである。

本発明において酵素を固定するための水不溶性担体は、
水不溶性基質との酵素反応終了後に、可溶化された基質
と固定化された酵素との分離を濾過操作によって簡単に
行うためのものであり、実質的に水不溶性のものである
。このような担体としては、例えば共存結合法に用いる
ポリアクリルアミド誘導体、多孔性ガラス、イミドカル
ボナート誘導体、カルボキシメチルセルロース、ブロモ
アセチルセルロースなど、イオン結合法に用いるイオン
交換基を有する物質など、物理吸着法に用いる活性炭、
アルミナ、シリカゲル、ケイ藻土など、包括法に用いる
ポリアクリルアミドゲル、に−カラギーナン、セルロー
ス誘導体などが利用できるが、酵素を固定できるもので
あれば特に限定されるものでなく、また、形状もフィル
ム状、粒状、粉末状、繊維状、フロック状など任意に選
択することができる。

上記水不溶性担体のうち、酵素反応させる水不溶性基質
との親和性が高く、固定化する酵素量を多くできるとい
う点から、水分散型高分子粒子を用いることが好ましい
。このような水分散型高分子粒子はポリ　（メタ）アク
リル酸エステル、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニルおよび
そのけん化物の如き高分子を水中に乳化、分散して微粒
子状態にするか、スチレンおよびその誘導体、（メタ）
アクリル酸エステルおよびその誘４体、（メタ）アクリ
ル酸、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリルア
ミド、酢酸ビニルおよびそのけん化物の如き単品体の一
種以上を乳化重合することによって得ることができる。

このような水分散型高分子粒子は非常に微細な状態で水
中に分散しているが、その好ましい平均粒径は０．０３
〜２μｍ、さらに好ましくはｏ、　ｔ　−ｉμｍの範囲
である。０．０３μｍ未満の粒径では該粒子を担体とす
る固定化酵素を酵素反応に使用すると、反応終了後の固
定化酵素の濾別回収が困難になることがあり、２μｍを
超える粒径では単位体積当りの粒子表面積が小さくなり
、酵素の固定化量が少なくなると共に、水分散性が悪く
なり酵素反応を有効に行い難くなる。

上記水不溶性担体に固定化する酵素は、水不溶性基質を
分解して可溶化基質とする作用を有するものであり、エ
ンド型加水分解酵素が好適に用いられる。これらの酵素
としては、例えばα−アミラーゼ、セルラーゼ、ペクチ
ナーゼ、ムラミダーゼの如き多ＩＪ！類加水分解酵素、
パパイン、ブロメライン、ペプシン、トリプシン、キモ
トリプシンの如き蛋白質加水分解酵素、その他リパーゼ
、ヌクレアーゼなどが挙げられる。これらの酵素の固定
化量は担体の形状や、大きさ、また酵素活性等により適
宜決定することができるが、通常担体１ｇ当り１〜２０
０ｎｗ程度にすることが好ましい。

なお、担体として水分散型高分子粒子を使用する場合は
、担体１ｇ当り１０〜ｌＯＯ■の範囲に設定することが
反応効率の面より望ましいものである。

水不溶性担体に上記酵素を固定化する方法としては公知
の固定化方法を用いることができるが、長期間に亘って
固定化する酵素の活性を維持さげるためには、カルボキ
シル基、アミノ基、ヒドロキシル基、水酸基の如き官能
基を有する担体、例えば（メタ）アクリル酸共重合体、
スチレンと上記官能基含有モノマーとの共重合体、酢酸
ビニルと上記官能基含有上ツマ−との共重合体およびそ
のけん化物に、ε−アミノカプロン酸、ヘキサメチレン
ジアミン、ヒドロキシルアミン、アジピン酸、ポリエヂ
レンイミンの如き水溶性の化合物をスペーサーとして共
有結合させ、該化合物に共有結合にて酵素を結合するこ
とが好ましい。また、水分散型高分子粒子への酵素の固
定化方法については、特公昭６０−１２０３３号公報に
記載の方法を採用することができる。

本発明の反応方法では上記酵素固定した水不溶性担体と
、デンプン、高分子蛋白質、脂質の如き水不溶性基質と
を、水中にて混合、接触させて酵素反応を行うが、通常
３０〜６０℃の温度で１〜３時間反応させ、反応終了後
に可溶化された基質を濾過し、濾液を後述する酵素固定
した限外濾過膜へ原液として供給する。この濾過手段と
しては少なくとも担体に固定された固定化酵素を透過さ
せないものであれば、その材質や孔径に制限はないが、
可溶化基質のみを濾液中に得る場合や、水分散型高分子
粒子のような微粒子を担体とした固定化酵素を用いる場
合には精密濾過膜を使用することが好ましい。

このような精密濾過膜としては孔径が０．０５〜２μｍ
、特に０．１〜１μｍの孔径を有するものが濾別性能の
点で好ましく、また耐熱性の点からポリプロピレン膜、
ポリスルホン膜、ポリテトラフルオロエチレン膜を用い
ることが好ましい。

本発明において水不溶性基質は上述のように可溶化され
たのち、可溶化基質が濾過される。可溶化基質を含有す
る濾液は酵素を固定化した限外濾過膜に原液として供給
され、酵素反応を受けたのち、透過液中に目的とする最
終生成物を得ることができる。

本発明において用いる限外濾過膜は、緻密層と多孔質層
とからなる異方性膜であり、酵素を多孔質層内に固定す
るものである。可溶性基質を含む原液（前工程による濾
液）は多孔質層側から限外濾過膜に供給、通液され、酵
素反応を受けたのち選択分離性を有する緻密層を経て最
終生成物のみが透過液として取り出されるものである。

このような限外濾過膜における緻密層の分画分子量は１
０００〜ｔｏｏｏｏｏｏ、好ましくは５０００〜５００
００の範囲で、多孔質層の孔径を０．１〜１１００ＩＩ
、好ましくは０．５〜５０１１ｍの範囲に調整すること
が分画性や透過流束の維持の点から好ましいものである
。

なお、本発明における分画分子量は、異なった分子量の
デキストランを用いて１．０　ｋｇ／　ｃＪ、２５℃の
条件下で透過液中のデキストランを示差屈折計にて定量
し、デキストラン阻止率が９０％のときの分画分子量の
値である。

限外濾過膜の膜材質としては、分画分子量の厳格さ、耐
熱性、機械的強度などの総合的な見地からポリスルホン
、ポリアミド、ポリイミドが好適であり、その形状は平
板状、管状、中空糸状など酵素反応装置に応して形状は
任意に選択することができる。好ましくは、有効膜面積
を大きくし、固定化された酵素と基質との接触を多くす
るために中空糸状膜とすることが望ましい。

上記限外濾過膜に固定する酵素としては、担体の種ｔｒ
４や目的とする最終生成物に応じて選択され、効率よく
水不溶性基質から最終生成物を得るためには、例えばエ
キソ型加水分解酵素または異性化酵素、転移酵素などを
使用することが好ましい。

具体的にはβ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−グ
ルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、インへルターゼ
、メリビアーゼの如き糖加水分解酵素、グルコースイソ
メラーゼの如き異性化酵素、トランスアミラーゼの如き
転移酵素が挙げられ、その他制限酵素なども固定するこ
とができる。なお、前記水不溶性担体に固定化された酵
素と同種のものを用いてよい。また、これらの酵素の固
定化量は有効膜面積および固定化方法により調節可能で
あって、使用する酵素や基質によっても異なるが、Ｊｌ
！２　ｌｃ＋＋Ｉ当り酵素蛋白量で０．１〜３．５■と
することが反応効率の面から望ましいものである。

限外濾過膜への酵素の固定化方法としては、酵素活性を
安定に維持し、さらに酵素反応の効率を高めるという点
から、官能基を有する水溶性高分子、例えばポリビニル
アルコール−ポリビニルアミン共重合体、ポリエチレン
イミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸などを
スペーサーとして介在させた共有結合法が好ましく、例
えば特願昭６０−２２５４３５号公報に記載された方法
を採用することができる。

本発明は上記したような２段階の工程を経る酵素反応方
法によって目的とする最終生成物を透過液中に得ること
ができるが、原液を限外濾過膜へ供給する際に水不溶性
基質が充分に可溶化されていない場合は、水不溶性担体
に酵素固定した固定化酵素による酵素反応をさらに行い
、充分に可溶化したのちに酵素固定した限外濾過膜へ濾
液を供給するなど、上記２段階工程のみに限らず本発明
では多段階工程での酵素反応をも含むものである。

〈発明の効果〉 以上のように、本発明の酵素反応方法は水不溶性基質を
、酵素固定した水不溶性担体と混合、接触させて酵素反
応を行い、該基質を可溶化せしめたのち濾過し、得られ
た濾液を酵素固定した限外濾過膜へ供給してさらに酵素
反応を行うものであるので、水不溶性基質を直接、酵素
固定した限外濾過膜へ供給して酵素反応を行う場合に比
べ、基質の膜面や膜内への付着が非常に少なくなり、透
過液流￥の低下を防止でき、且つ酵素活性の維持、反応
効率の低下が抑制できるものである。従って、長時間に
亘って効率よく水不溶性基質から反応生成物を得ること
ができるのである。

〈実施例〉 以下に本発明の実施例を示し、さらに詳しく説明するが
、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲で種々の応用が
可能である。

実施例１ （ａＩ　和腫型高分子粒子の調製およびＭ七至Ｎ定化ア
クリル酸３ｇ、スチレン５０ｇ１アクリロニトリル２０
ｇ、ジビニルヘンゼン２ｇからなる単噴体混合物を乳化
共重合し、平均粒径０．３８μｍの水分散型高分子粒子
の水分散液を得た。

得られた分散液（固形分重量７ｇ）に、１−シクロへキ
シル−３−（モルホリノエチル）カルボジイミド０．５
ｇを加え、ｐ　！１５．０に調整後、α−アミラーゼ５
００ｍｇをさらに添加して攪拌しながら、５℃にて２４
時間反応させてα−アミラーゼを固定化し固定化酵素を
得た。

固定化酵素のα−アミラーゼの固定化量は水分散型高分
子粒子１ｇ当り５２ｎ＋ｇであった。

（ｂ）限外濾過膜への酵素の固定囮 ポリスルホン製限外濾過ｎり用中空糸状膜（日東電工■
製、ＮＴＵ−３２５０）の小型モジュール（２φＸ２０
ＣＩＢ、５７本人り、膜面積２７５ｃＪ）の多孔質層側
から、０．１重量％のポリエチレンイミン水溶液を０．
３　ｋｇ　／　ｃａｌ加圧下、１時間通液し、ポリエチ
レンイミンを多孔質層内に物理吸着させた。次に、０．
１重量％のグルタルアルデヒド溶液（ｐ　Ｈ７，０りん
酸緩衝液）を０．３　ｋｇ　／　ｃｒＡ加圧下、４０℃
で４時間通液し、吸着されているポリエチレンイミンを
架橋した。さらに、室温下で逆洗浄し未架橋のポリエチ
レンイミンを除去後、再び多孔質層側から２．５重量％
のグルタルアルデヒド溶液（ｐ　Ｉ−１７，０りん酸緩
衝液）を０．３　ｋｇ　／　ｃＩＩｌ加圧下、４０℃で
４時間通液し、ポリエチレンイミンのアミノ基を活性化
した。そののち、０．３ｋｇ／ｃｎｌ加圧下にて１．０
■／ｍ＋のグルコアミラーゼ溶液（ｐｉ（６，０酢酸緩
衝液）を４℃で１８時間通液し、共有結合による酵素の
固定化を行った。

グルコアミラーゼの固定化量は限外ｆ！、過膜１　ｃ＋
＋１当り１．１■であった。

（Ｃ）酵量叉応。

５重量％バレイショデンプン溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液
ｐ　Ｈ５，０）に上記で得たα−アミラーゼを固定した
水分散型高分子粒子を５重量％となるように添加して反
応槽中、５０℃にて酵素反応を行った。

反応液は０．５　ｋｇ　／　ｃｎｌの加圧下、循環流量
５００ｍ１／分にて精密濾過膜（日東電工側製、膜材質
ポリテトラフルオロエチレン、０．５μｍ平膜）へ送り
、循環しながら濾過した。上記濾過の際、精密濾過膜を
透過できないα−アミラーゼを固定した水分散型高分子
粒子と可溶化されていないバレイショデンプンは回収さ
れ、反応槽へ戻し、反応槽へはりザーバーから基質とし
ての５ｉＪ’ｆＭ％ハレ・イショデンプン溶液を補給し
、？／１ｓｔを一定に保ち、連続的に酵素反応を行った
。

可溶化基質を含む′ｒＪｉ液は０．３ｋｇ／ｃＪの加圧
下、循環流星５００ｍｌ／分にて５０℃で１ｉｉｆ記で
得たＩり艮外濾過）１タヘ供給、通液し固定化グルコア
ミラーゼと酵素反応を行った。

透過液中のグルコースｒおよび透ｊ局液流〒を測定し、
結果を第１図（ａｌおよび（ｂ）に示した。

比較例１ 実施例１と同様の酵素反応を、水分散型高分子粒子に固
定したα−アミラーゼによる酵素反応（可溶化反応）お
よび精密濾過膜による濾過の上程を行わず、グルコアミ
ラーゼを固定化した限外；ｊＵ過膜へ直接、５重量％バ
レイショデンブン溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐ　Ｈ５，
０）を原液として供給し、酵素反応を行った。

透過液中のグルコース量および透過液流星を７！ｌ１１
定し、結果を第１図（ａｌおよび（ｂ））に示した。

実施例２ ２重尾％大豆カゼイン溶液（ｐＬＩ７．０りん酸緩衝液
）の酵素分解反応を行った。

アクリル酸、スチレン、ジビニルベンゼンをエタノール
存在下にて乳化共重合して得た水分散型高分子粒７−　
（平均粒径０．７μｍ）に実施例１と同様の操作にてプ
ロテアーゼを固定化して固定化酵素を得た。（プロテア
ーゼの固定化量は水分散型高分子粒子１ｇ当り２８■で
あった） 一方、限外濾過膜（［］東電工０１製、膜材質ポリアミ
ド、分画分子１５００００）にプロテアーゼを実施例１
と同様の方法にて固定化した。（プロテアーゼの固定化
量は限外濾過膜１ｄ当り１．５■であった） ２重量％大豆カゼイン溶液に上記プロテアーゼを固定し
た水分散型高分子粒子を６重量％となるように添加し、
４０℃にて酵素反応を行い、精密濾過膜（日東電工（掬
製、膜材質ポリプロピレン、孔径１μｒｎ平膜）を用い
て濾過した。なお、濾過時の操作条件は実施例１と同様
にして行った。

濾液を０．５　ｋｇ　／　ｃｎｌの加圧下、循環’Ｉｎ
”；１７００　ｍ１７分にて４０℃で上記限外濾過膜へ
供給、通液し固定化プロテアーゼと酵素反応を行った。

ｉ３ｉ過液に５重量％トリクロル酢酸を加えて高分子量
タンパク質のみ沈澱させ、ＭＬ’ｄの非タンパク性分解
質量を２８０ｎｍの吸光度にて測定した。

その結果、透過液はトリクロル酢酸で沈澱は生じず、ま
たケルプール法による窒素晴から算出して基質の７２％
が分解物として存在しており、高分子蛋白質が効率よく
分解されたことが判明した。

また、酵素反応は２０日間に亘って安定に行われ、透過
液流■も１．０ｍｌとほとんど低下は認められなかった
。

実施例３ １重量％カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液
（ｐＨ４，５酢酸緩衝液）の酵素分解反応を行った。

メチルメタクリレート、アクリル酸、ジエチレングリコ
ールを乳化共重合して得た水分散型高分子粒子（平均粒
径０．２μｍ）に実施例１と同様の操作にてセルラーゼ
を固定化して固定化酵素を得た。（セルラーゼの固定化
量は水分散型高分子粒子１ｇ当り７１■であった） 一方、限外濾過膜（日東電工■製、膜材質ポリスルホン
、分画分子量２００００）にグルコアミラーゼを実施例
１と同様の方法にて固定化した。

（グルコアミラーゼの固定化量は限外濾過膜１　ｃａｌ
当り１．１隊であった） １重量％カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液
に上記セルラーゼを固定した水分散型高分子粒子を５重
量％となるように添加し、４０’Ｃにて酵素反応を行い
、精密濾過膜（アミコン製、膜材質ポリスルホン、孔径
０．１μｍ平膜）を用いて濾過した。なお、濾過時の操
作条件は実施例１と同様にして行った。

？！、液を０．７　ｋｇ／＋Ｉ１１ノ加圧下、循環流ｆ
ｆ１５００ｍｌＺ分にて６０℃で上記限外濾過膜へ供給
、通液し固定化グルコアミラーゼと酵素反応を行った。

透過液中のグルコース量を測定した結果、基質であるカ
ルボキシメチルセルロースナトリウムはほぼ完全に分解
されており、酵素反応は３０日間に亘って安定に行われ
、透過液流間の低下もほとんど認められなかった。

実施例４ オリーブ油乳化液（オリーブ油７５ｍ１と２重足％ポリ
ビニルアルコール２２５ｍ１を乳化したものと、ｐ　Ｉ
（６，０の０．１Ｍりん酸緩衝液とを５：４で）昆合し
たもの）の酵素分解反応を行った。

スチレン、メチルメタクリレート、アクリル酸、スチレ
ンスルホン酸ナトリウムを乳化共重合して得た水分散型
高分子粒子（平均粒径０．１／ｒｍ）に実施例１と同様
の操作にてリパーゼを固定化して固定化酵素を得た。（
リパーゼの固定化量は水分散型高分子粒子１ｇ当り８８
■であった）一方、限外濾過膜（日東電工０＠製、ｎり
材質ポリイミド、分画分子量２００００）にリパーゼを
実施例１と同様の方法にて固定化した。（リパーゼの固
定化量は限外濾過膜１　ｃｔ当り１．０■であった）オ
リーブ油乳化液に上記リパーゼを固定した水分散型高分
子粒子を７重量％となるように添加し、３７℃にて酵素
反応を行い、精密濾過膜（日東電工■製、膜材質ポリテ
トラフルオロエチレン、孔径０．１μｍ平膜）を用いて
濾過した。なお、濾過時の操作条件は実施例１と同様に
して行った。

〃ε液をＱ、　４　ｋｇ　／　ｃａｌの加圧下、循環流
ｆｌｆｔ６００ｍｌＺ分にて４０℃で上記限外濾過膜へ
供給、通液し固定化リパーゼと酵素反応を行った。

透過液中の酸価を測定し、基質であるオリーブ油の加水
分解率を次式より求めた。

加水分解率（％）−（酸価／けん化価）Ｘ１００その結
果、加水分解率は３２％であり、酵素反応により脂肪酸
が効率よく得られることが判明した。

また酵素反応は２０日間に亘って安定に行われ、透過液
流量の低下もほとんど認められなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）およびｆｂ）は実施例１と比較例１にて得
られた透過液中のグルコース量および酵素反応中の透過
液流量を示す。 なお、図中における操作時間は限外濾過膜へ濾液を供給
して酵素反応を行った時間である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）水不溶性基質を、酵素固定した水不溶性担体と水
   中にて混合、接触させて可溶化基質に変換せしめ、得ら
   れた可溶化基質を濾過する工程と、前記工程による可溶
   化基質を含む濾液を酵素固定した限外濾過膜に通液して
   酵素反応を行なう工程を含むことを特徴とする酵素反応
   方法。
2. （２）水不溶性担体が水分散型高分子粒子である特許請
   求の範囲第１項記載の酵素反応方法。
3. （３）水分散型高分子粒子が平均粒径０．０３〜２μｍ
   である特許請求の範囲第２項記載の酵素反応方法。
4. （４）可溶化基質の濾過工程を精密濾過膜にて行なう特
   許請求の範囲第１項記載の酵素反応方法。
5. （５）精密濾過膜がポリプロピレン膜、ポリスルホン膜
   またはポリテトラフルオロエチレン膜である特許請求の
   範囲第４項記載の酵素反応方法。
6. （６）限外濾過膜がポリスルホン膜、ポリアミド膜また
   はポリイミド膜である特許請求の範囲第１項記載の酵素
   反応方法。