JPS63141585A - Ｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 サミノラクトンにすると共に、ＮＡＤ　ヲＮＡＤＨに還
元スる新規なＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素（以
下Ｎ−ＡＭＤＨという）及びその製造法に関する。

〈従来の技術〉 最近、臨床検査の分野において血清中の／アル酸の測定
が行なわれており、急性及び慢性炎症、ショック、外傷
、心筋梗塞、糖尿病、肝疾患、各種癌等の病態を診断す
るのに重要な役割を持っている。

このシアル酸を測定するにあたって大別して化学法と酵
素法がある。

化学法は特異性や操作性、更には危険薬品類の使用等、
望ましくない点が多いため徐々に精度の高い酵素法に移
って来ているのが実情である。

酵素法には現在大きく別けてＡ、８２つの方法が提案さ
れている。

シアル酸にフイラミン酸アルドラーゼを作用さ−２−エ
ピメラーゼとＮ−７セチルヘキソサミンオキシダーゼで
過酸化水素を生成させて測定するものであり、Ｂ法はピ
ルビン酸からピルビン酸オキシダーゼまたは乳酸脱水素
酵素（ＬＤＨ）で、それぞれ過酸化水素またはＮＡＤＨ
を生成させて測定するものである。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかし、Ａ法はアシルグルコサミン−２−エピメラーゼ
が介在する分だけ系は複雑となり、Ｂ法は内因性のピル
ビン酸の影響を受けるという欠点がある。

本発明者等は操作が簡単でしかも精度の高いシアル酸の
測定法について検討したところ、土壌から分離したフラ
ボバクテリウム属に属する１細菌カ、Ｎ−ＡＭに作用し
てＮ−７セチルマンノサミノラクトンにすると共に、Ｎ
ＡＤをＮＡＤＨに還元すなわち本発明はＮ−ＡＭに作用
してＮ−アセチルマンノサミノラクトンにすると共に、
ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する新規な酵素Ｎ−ＡＭＤＨで
あり、また本発明はフラボバクテリウム属に属し、Ｎ−
ＡＭＤＨ生産能を有する菌株を培地に培養し、培養物よ
りＮ−ＡＭＤＨを採取することを特徴とするＮ−ＡＭＤ
Ｈの製造法である。

く問題点を解決するための手段〉 以下本発明を具体的に説明する。

本発明における新規酵素Ｎ−ＡＭＤＨの理化学的性質は
下記の通りである◇ （１）作用及び基質特異性 次の反応式に示されるごとく、Ｎ−ＡＭとＮＡＤの共存
下でＮ−ＡＭをＮ−７セチルマンノサミノラクトンに酸
化すると共に、ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する。

Ｎ−７セチルマンノサミノラクトンは水中では更に自動
的に加水分解されてＮ−アセチルマンノサミン酸ンこな
る。故に反応は事実上不可逆的である。他の中性糖やヘ
キソサミン、Ｎ−７セチルグルコサミン、Ｎ−７セチル
ガラクトサミンに対し”では全く、もしくはほとんど作
用しない。またＮＡＤＰヤ２．６−シクロロフエノール
インドフエノール等を電子受容体として、はとんど利用
しない。

（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 トリス−塩酸緩衝液を用いた場合、至適ｐＨは８．０〜
９．０である。

またリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液及びグ
リシン−苛性ソーダ緩衝液を用いて酵素活性を測定した
結果は第１図に示すとおりであるＯ 安定ｐＨ範囲は第２図に示すごとく８．５〜９．５であ
る。

使用緩衝液はリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液、グリシン−苛性ソーダ松衝液である◇ （３）作用適温の範囲 第３図に示すごと＜３５〜５０°Ｃである。

（４１ｐＨ、温度等による失活の条件 第４図に示すごと＜　１０分間の熱処理では４５°Ｃま
で安定であり、それ以上の温度では急速に失活する。４
５°Ｃ１１０分間の熱処理ではｐＨ８，５〜９．５で安
定であり、ｐＨ７以下では特に不安定である。

（５）阻害剤の影響及び安定化 上表は各種金属イオン及び阻害剤を２　ｍＭの濃度で含
有する反応液中での酵素活性を測定したものである。活
性化及び安定化のために特別に寄与する物質は知られて
いない。

（６）精製方法 本酵素のＩｃＬ離・精製は常法に従って行なうことがで
き、例えばＤＥＡＥ−セルロースを用いたカラムクロマ
トグラフィー、硫安法Ｒ１ＤＥＡＥ　−セファデックス
を用いたカラムクロマトグラフィー、５’ＡＭＰ七ファ
ロースヲ用いたカラムクロマトグラフィー、セファデッ
クスによるゲル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組
合わせて使用する。

（７）分子量 ０．０５　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液＜０．１　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１含有）を用いてセファデックスＧ　−２００のカラ
ムによるゲル濾過法により測定した値は約１１万〜１２
万である。

（８）ポリアクリルアミドゲル電気泳動７．５％ポリア
クリルアミドゲルを用いて常法によってアクリルアミド
ディスク電気泳動を行なった結果、第５図に示すごとく
、はぼ単一のバンドが認められた。４　ｍＡで１時間２
０分後の泳動距離は２８龍である。

（９）等電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動により測定した値は４
．９である。

（ＩＩ活性の測定法 ０．０５　Ｍ　ｌ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，２’）
　１．８ｍｌに６０　ｍＭ　ＮＡＤ溶液０．１ｍｌを加
える。３７°Ｃに１０分間保った後、酵素液１０μｇを
加え、０．３ＭＮ−ＡＭ溶液０．１ｍｌを加えて混合し
、反応を始める。直ちに３７°Ｃに保った吸光度測定用
セル（ｌｃ＋＋＋光路）に移し、３４０　ｎｍの波長で
１分ごとに５分または必要であればそれ以上の時間にわ
たって吸光度を測定する。１単位は１分間に１μモルの
ＮＡＤｆ−Ｉを生成させる酵素量である。

以上のように本酵素はその作用及び基質特異性において
従来全く知られていない新規な酵素である。

次に本発明による新規な酵素Ｎ−ＡＭＤＨの製造法につ
いて説明する。

使用される微生物はフラボバクテリウム属に属し、Ｎ−
ＡＭＤＨ生産能を有する菌株であって、そノ具体例とし
てはフラボバクテリウムｓｐＡ　１４１−８が挙げられ
、原菌の変種もしくは変異株も用いられる。フラボバク
テリウム８１）、ＮＬ　１４１−８は本発明者等が土壌
中より分離した菌株であり、その菌学的性質は下記の通
りである。

（ａ）形態 顕微鏡的観察（３０°Ｃ加糖ブイヨン培地、１６時間培
養） ■細胞の大きさ：０．４５〜０．５　Ｘ　Ｏ，５〜１１
　ミクロンの桿菌 ■細胞の多形性二球状に近いものから比較的長い桿状の
ものまである。末端で 相互につながった短い連鎖状態も 散見する。

■運動性：認められなし・。

■ダラム染色性：陰性 ■抗酸性：陰性 （ｂ）　　各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養＝３０°Ｃ１２日間の培養で直径０
．５龍の円形平滑で半透明な コロニーを作る。生育は比較的よ くない。

■加糖肉汁寒天平板培養：３０°Ｃ，２日間で直径０．
８＋＋＋ｍの円形平滑で半透明なコロニー、５日間で２
．０〜２．５ｆｆ肩の乳白色の粘液状のコロニーを作 る。色素の生成は認められない。

■加糖肉汁寒天斜面培地＝３０°Ｃ，２日間で乳濁した
粘液状になり、３日間での 培養では下方に流下し底部にたま る。

■加糖肉汁液体培地＝３０°Ｃ，２日間の培養で少し生
育する。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：３０’Ｃ，３日間でわずかに
生育するが液化はしない。

■　リドマスミルク：変化なし、凝固もしな（亀。

（ｃ）　　生理的性質 ■硝酸塩の還元：陽性 ■脱窒反応：陰性 ■ＭＲテスト：陰性。ただし好気的培養では陽性。

■ｖｐテスト：陰性 ■インドールの生成：陰性 ■硫化水素の生成：陰性 ■デンプンの加水分解：陰性 ■　クエン酸の利用：陰性 ■無機窒素源の利用：アンモニアは利用するが硝酸は利
用しない。

■色素の生成：陰性 ■ウレアーゼ：陽性 ■オキシダーゼ：陽性 ０カタラーゼ：陽性 ０生育の範囲：１５°Ｃ〜４１″Ｃ（至適温度３０°Ｃ
）ｐＨ４，５〜８．５（至適ｐＨ６，５付近） ■酸素に対する態度：好気性であるが嫌気的にもわずか
に生育する。

■Ｏ−Ｆテスト：変化なし、又は極めて弱い発酵。

■糖類から酸及びガスの生成：＊は好気的培養による。

秦酸の生成　ガスの生成 ［０Ｌ−７ラビノース　　　十　　　　　−（２）Ｄ−
キンロース　　　＋　　　　　−口　Ｄ−グルコース　
　　士　　　　　−［Ｉ］Ｄ−マンノース　　　十　　
　　　−圓　Ｄ−フラクトース　　＋　　　　　−圓　
Ｄ−ガラクトース　　＋　　　　　−ロ麦芽糖　　　十
　　　− ｌ　庶　　　　　糖　　　　　　　　十　　　　　　　
　−（９）乳　　　　糖　　　　　　　十　　　　　　
　　−■　トレハロース　　　　　＋　　　　　　−［
１ｌＤ−ソルビット　　　　＋　　　　　　−１１ｉ１
Ｄ−マンニット　　　十　　　　　−口　イノノット　
　　　　　十　　　　　−Ｂグリセリン　　　　十　　
　　− 皿　デンプン　　　　　　−− （ｄ）　　その他の性質 ■ペニシリン耐性＝１００単位／　ａｒｅでも生育する
。

■食塩耐性：２５％以上で生育しない。

■コロニー辺縁部の運動性：流動性は見られない。

■Ｔｗｅｅｎ　８０分解：陰性 ■エクスリンの分解：陰性 以上の新規なＮ−ＡＭＤＨ生産能を有する本菌の分類学
的諸性質を「パージエイズ・マニーアル・オブ・システ
マチック・バクテリオロジー」（１９８４年）第１巻の
分類と対比すると、本菌はダラム染色性が陰性、好気性
の無胞子桿菌で運動性を持たず、カタラーゼ陽性、オキ
シダーゼ陽性で多くの糖から好気的条件で酸を生成する
、ペニシリン耐性であるなどの性質からフラボバクテリ
ウム属に属すると思われる。

好気的条件での糖から酸を生成する性質から、フラボバ
クテリウム・スビリツチポラン（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　　ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ　）に近縁と思
われるが、エスクリンの分解、硝酸塩の還元、Ｔｗｅｅ
ｎ　８０の分解などの点で異なっており、従来知られて
いない新規な菌株と思われる。

以上の理由により本菌をフラボバクテリウムｓｐ、　Ｎ
Ｌ　１４１−８と命名した。なお、フラボバクテリウム
ｓｐ、　Ｎｕ　１４１−８は通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研条寄第１２２２号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１２２２）として寄託されている。

次に本発明で使用する培地としては、炭素源、窒素源、
無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地ならば合成
培地または天然培地のいずれでも使用可能である。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクトース、
午シロース、グリセリン等を用いることができる。窒素
源としてはアンモニウム塩の他にペプトン、カゼイン消
化物、グルタミン酸ソーダ、酵母エキス等の窒素性有機
物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄等
の塩類が使用できる。

本発明においては、Ｎ−ＡＭＤＨ生産能を有する菌株な
Ｎ　ＡＭまたはＮ−７七チルグルコサミンを含有する培
地で培養または浸漬したときにＮ−ＡＭＤＨが収量よく
得られる。該培養培地の好適な例としては、Ｎ−ＡＭ　
０．５％、肉エキス０．１％、ポリペプトン０．５％、
酵母エキス０．２％、食塩０．１４％、燐酸水素−カリ
ウム０．１％、ｐＨ６，８の培地例が挙げられる。そし
て該培地で３０°Ｃ１３６時間通気撹拌培養した場合は
、Ｎ−ＡＭを他の炭素源におきかえた場合の１０〜１０
０倍の生産力価を得ることができる。

培養温度は通常２０〜４０°Ｃの範囲で好適には３０〜
３３°Ｃの範囲で行なわれる。培養開始のｐＨは通常６
〜８の範囲で好適には７付近である。この様な条件下で
２０〜４０時間振盪又は深部撹拌培養を行なうか、また
はＮ−ＡＭ　またはＮ−７セチルグルコサミンを含有し
ないが、生育に好適な他の培地に生育した菌体を高濃度
に分散させ１〜１０時間好気的にそれらと共に浸漬すれ
ば、該培養物または菌体懸濁液中にＮ−ＡＭＤＨが生成
蓄積する。

Ｎ−ＡＭＤＨは通常は菌体中に存在するので培養物を遠
心分離、あるいは濾過によって菌体だけを分離するのが
好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可溶
化することによって溶液中に放出させる。

菌体の破壊方法はダイノミル、フレンチプレス、超音波
等の物理的なものや、トリトンＸ　−１００、ラウリル
硫酸ソーダ、ＥＤＴＡ等の化学的方法、リゾチーム等の
酵素的な方法を単独または併用して用いることができる
。この様にして得られた菌体破壊液から核酸を常法によ
って除去し、濾過または遠心分離によって不溶物を除き
Ｎ　ＡＭＤＨを得る。

更にＮ−ＡＭＤＨは必要により酵素の単離精製の常法に
従って、例えば（１）ＤＥＡＥ−セルロース塔ニよるカ
ラムクロマトグラフィー、（２）硫安による分画法ｍ　
、（３）　ＤＥＡＥ−セファデックス塔によるカラムク
ロマトグラフィー、（４１５’　−ＡＭＰセファロース
塔によるカラムクロマトグラフィー、（５）セファデッ
クスによるゲル濾過等の方法、またはその他の方法を必
要に応じ組合わせて用いることにより、精製されたＮ−
ＡＭＤＨを得ることができる。

〈発明の効果〉 本発明の新規なＮ−ＡＭＤＨを用いるとＮ−ＡＭの定量
を精度よく行なうことができ、これに基づいてシアル酸
の量を知ることができる。その結果、種々の病態診断を
効率よく行なうことができる。

〈実施例〉 実施例１ フラボバクテリウムｓｐ、　Ｎａ、　１４１−８　　（
微工研条寄第１２２２号、ＦＥＲＭ　ＢＰ−１２２２）
をグルコース０．７５％、酵母エキス０゜２％、ポリペ
プトン０．５％、肉エキス０．１％、食塩０．１４％、
燐酸水素−カリウム０．１％を含有した種培地（ｐＨ８
，０）　５０ばが入った３００　ｒｘｌ容三角フラスコ
に接種した。

３０°Ｃで２４時間振盪培養した後、同じ培地２１が入
ったジャーファーメンタ−（株式会社いわしや生物科学
製）に植菌し、３０°Ｃ１３６時間通気（２１／ｍ１ｎ
）撹拌（４００ｒｐｍ　）培養した。この培養液を８０
０Ｏｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体を集めた。

これをＮ−ＡＭ　０．２％、肉エキス０．１％、ポリペ
プトン０．５％、酵母エキス０．２％、食塩０．１４％
、燐酸水素−カリウム０．１％、　ｐＨ６，８ヲ含有し
た培地２７Ｉの入った同じジャーファーメンタ−に移し
、同じ培養条件で培養を続けた。６時間後にＮ−ＡＭＤ
Ｈの活性は最高に達した。

実施例２ フラボバクテリウムｓｐ、　Ｎ１Ｌ１４１−８をＮ−Ａ
Ｍ　０．５％、ポリペプトン０．８％、肉エキス０．１
％、酵母エキス０．２％、燐酸水素−カリウム０．１％
を含有した種培地（ｐＨ６，８）　５０　ｔｓｌに実施
例１と同様に植菌し３０°Ｃで２４時間振盪、培養した
。

これを同じ培地２ｇが入ったミニジャーファー）７ター
に植え、３０°Ｃ１４０時間通気（２ｌ　／　ｍ１ｎ）
撹拌（４００ｒｐｍ　）培養した。Ｎ−ＡＭＤＨは菌体
に蓄積されていた。

実施例３ 実施例１と同様にして得た１、７＆ｇの生菌体に０．０
２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝液ｐＨ８，０（以下これを標
準緩衝液と呼ぶ）１０１を加え、更に０．５％トリドア
Ｘ−１００、ＥＤＴＡ　２　ｍＭになる様に各々加えた
。低温室で１晩撹拌を行ない均一な懸濁液を得た。これ
をダイノミル（スウェーデン、シンマルエンタープライ
ズ社　製）によって破砕（３０００ｒｐｍ　）　した。

８０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって
上澄７．３Ｅを得た。

これに湿潤状態のＤＥＡＥ−セルロース１．４に９ヲ投
入し、ｐＨ８，０に調整した後３０分間撹拌を行ない該
酵素を吸着させた。ブフナー漏斗に移して濾過した後、
標準緩衝液４１で洗浄し、更に０．３Ｍの食塩を含有し
た標準緩衝液５１で洗浄してこの部分を集め、これをホ
ローファイバー限外濾過装置（旭化成工業株式会社製）
によって１１まで濃縮した。

これに１２５ｙの硫安を加え、溶かしてよく撹拌し、２
時間放置した後９０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離し
て上澄８５０　ｍｌを得た。更に硫安１６６　Ｊを加え
よく溶かして１晩低温室に放置した。

生じた沈殿を１２０００　ｒｐｍで２０分間遠心分離し
て集め、標準緩衝液８５０　ｍｌに溶かした。これに硫
安３５　ｇを加えて溶かし、あらかじめ硫安４％を含有
した標準緩衝液に平衡化したフェニルセファロースＣＬ
−４Ｂ（スウェーデン、ファルマシア社製）のカラム（
直径５ｃＮ×高さ３４ｃｍ）に通して酵素を吸着させた
。これをエチレングリコールの濃度勾配（０→３０％）
と硫安の逆濃度勾配（４→０％）をもった標準緩衝液１
０７Ｉで溶出した。

これを限外濾過装置で濃縮し、０．１　Ｍ食塩を含有し
た標準緩衝液に対して透析した。これをあらかじめ０．
１　Ｍ食塩含有標準緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−５０のカラム（直径５ｃｆｆＸ高さ５２
ｃ＋＋＋）に通して吸着させ、０．１　Ｍから０．２８
Ｍの食塩濃度勾配をもった標準緩衝液１゜ｌで溶出した
。

活性部を限外濾過装置で濃縮した後、０．０１　Ｍリン
燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６，５に対して透析した。これ
をあらかじめ０．０１　Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６
，０に平衡化した５’−ＡＭＰ−セファロースＣＬ−４
Ｂ（スウェーデン、ファルマ・／ア社製）のカラム（直
径４ｃｍ×高さ１６ｃｍ）に通して吸着させ、０．０１
　Ｍ　ＩＪ　７酸緩衝液ｐＨ６，０，４７！と０．５Ｍ
食塩を含有した０、０１　Ｍ　！Ｉン酸緩衝液ｐＨ８，
０，４７！を用いた食塩濃度勾配とｐＨ勾配をもった緩
衝液で溶出した。

活性部をｐＨ８，０に調整した後、限外濾過装置、更に
コロジオンバック濃縮装置でｌ　ｍｌまで濃縮し、０．
１　Ｍ食塩を含有した標準緩衝液に対して透析した。こ
れを０．１　Ｍ食塩を含有した標準緩衝液で平衡化した
セファデックスＧ−２００のカラム（直径２．５ｃｍＸ
高さ９５ｃ＋＋＋）によってゲル濾過を行なった。

活性部を集め濃縮して精製Ｎ−ＡＭＤＨ２２０単位を得
た。これは第５図に示す通りディスク電気泳動によって
、はとんど単一バンドを示す酵素標品であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐＨを示すグラフであり、第２図
は安定ｐＨを示すグラフである。第３図は本酵素の作用
適温の範囲を示すグラフであり、第４図は本酵素の熱安
定性を示すグラフである。第５図は電気泳動によるバン
ドを示す図である。なお、第１図及び第２図における使
用緩衝液はそれぞれリン酸カリウム緩衝液（〇−〇）、
トリス−塩酸緩衝液（△−△）及びグリシン−カセイソ
ーダ緩衝液＜ＱＪ−０）である。 特許出願人　財団法人　野田産業科学研究所Ｈ Ｈ 温度（°Ｃ） 過度（０Ｃ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記（１）〜（３）の理化学的性質を有するＮ−ア
   セチルマンノサミン脱水素酵素 （１）作用及び基質特異性 Ｎ−アセチルマンノサミンから水素を奪ってＮ−アセチ
   ルマンノサミノラクトンにすると共に、補酵素ＮＡＤを
   ＮＡＤＨに還元する。 他のヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソサミンに対し
   ては、ほとんどもしくは全く作用しない。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 トリス−塩酸緩衝液を用いた場合、至適ｐＨは８．０〜
   ９．０であり、安定ｐＨ範囲は８．５〜９．５である。 （３）分子量 ０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ含
   有）を用いてセファデックスＧ−２００によるゲル濾過
   法により測定した値は約１１万〜１２万である。 ２、フラボバクテリウム属に属し、Ｎ−アセチルマンノ
   サミン脱水素酵素生産能を有する菌株を培地に培養し、
   培養物よりＮ−アセチルマンノサミン脱水素酵素を採取
   することを特徴とするＮ−アセチルマンノサミン脱水素
   酵素の製造法。