JPS63142000A - モノクロナ−ル抗体 - Google Patents
モノクロナ−ル抗体Info
- Publication number
- JPS63142000A JPS63142000A JP61287822A JP28782286A JPS63142000A JP S63142000 A JPS63142000 A JP S63142000A JP 61287822 A JP61287822 A JP 61287822A JP 28782286 A JP28782286 A JP 28782286A JP S63142000 A JPS63142000 A JP S63142000A
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- JP
- Japan
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- interferon
- gamma
- monoclonal antibody
- mouse
- ifng
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ル！上０科刑匁肚
本発明は、インター７エロンーγの精製や定量１こ有用
な抗インターフェロン−７モノクローナル抗体に関する
。
な抗インターフェロン−７モノクローナル抗体に関する
。
従来の技術
ヒトリンパ球から得られるインターフェロン−γあるい
は組換えＤＮＡ技術により得られる非グリコジル化イン
ターフェロン−γでマウスを免疫し、得られる肺細胞と
マウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られるハイブリド
ーマを用いて抗インター７エロンーγモアクローナル抗
体を製造することは公知である０例えばＮａｔｕｒｅ、
２９６．２５８ （１９８２）＝ ＥＭＢＯＪ、、
２．１５２７（１９Ｓ３）−Ｊ、 Ｂｉ。
は組換えＤＮＡ技術により得られる非グリコジル化イン
ターフェロン−γでマウスを免疫し、得られる肺細胞と
マウスの骨髄腫細胞とを融合させて得られるハイブリド
ーマを用いて抗インター７エロンーγモアクローナル抗
体を製造することは公知である０例えばＮａｔｕｒｅ、
２９６．２５８ （１９８２）＝ ＥＭＢＯＪ、、
２．１５２７（１９Ｓ３）−Ｊ、 Ｂｉ。
１、 Ｃｈｅｗ、、 ２５９（７）−４３０１（１９８
４）−Ｊ、 ｌ＋ｎｕｎｏｌ、。
４）−Ｊ、 ｌ＋ｎｕｎｏｌ、。
叱λ（３）、 １３００（１９８４）などがある。
明が 決しようとする、 α
天然あるいは組換えインターフェロン−γの確実な評価
および薬剤の開発のため、優れた精製手段および簡便で
高精度の定量法が求められている。
および薬剤の開発のため、優れた精製手段および簡便で
高精度の定量法が求められている。
「 σを解決するための 段
本発明者らは特開昭６１−１３９５に記載の方法で製造
した非グリコジル化インターフェロン−７（以下ｒＩＮ
Ｆ−γと略す。）について精製、定量などに使えるモノ
クローナル抗体を得るべく研究した。
した非グリコジル化インターフェロン−７（以下ｒＩＮ
Ｆ−γと略す。）について精製、定量などに使えるモノ
クローナル抗体を得るべく研究した。
その結果、ｒＩＮＦ−γでマウスを免疫して得られる肺
細胞とマウスの骨髄腫細胞とを通常の方法で融合させて
得られるハイブリドーマが、該ｒｌ″ ＮＦ−７に対し
て反応するのみならず、天然由来のグリコジル化インタ
ー７エロンーγ（以下ｎ１ＮＦ−γと略す、）に対して
反応するモノクローナル抗体を生成し、該モノクローナ
ル抗体はその精製、定量に使用することができることを
見出し本発明を完膚した。以下１本発明の詳細な説明す
る。
細胞とマウスの骨髄腫細胞とを通常の方法で融合させて
得られるハイブリドーマが、該ｒｌ″ ＮＦ−７に対し
て反応するのみならず、天然由来のグリコジル化インタ
ー７エロンーγ（以下ｎ１ＮＦ−γと略す、）に対して
反応するモノクローナル抗体を生成し、該モノクローナ
ル抗体はその精製、定量に使用することができることを
見出し本発明を完膚した。以下１本発明の詳細な説明す
る。
本発明のモノクローナル抗体の製造は次のとおり行う。
（１）免疫化動物細胞の調製
マウスを前記ｒｌＮＦ−γで免疫して、そのマウスから
肺細胞を調製する。ｒＩＮＦ ７は特開昭６１−１３
９５中のＥ、 Ｃｏｌ １（ｐＥＣ２４８）が製造した
ものを使用する。免疫の方法は４週令のマウスの皮下。
肺細胞を調製する。ｒＩＮＦ ７は特開昭６１−１３
９５中のＥ、 Ｃｏｌ １（ｐＥＣ２４８）が製造した
ものを使用する。免疫の方法は４週令のマウスの皮下。
あるいは腹腔内に７０インドの完全アジュバントあるい
は食塩水とともにｒＩＮＦ−１を２５〜４００μｇ／匹
を投与する。３週目、４週目、６週目と４回投与する。
は食塩水とともにｒＩＮＦ−１を２５〜４００μｇ／匹
を投与する。３週目、４週目、６週目と４回投与する。
（２）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−７ザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−八ｇ８−０
１ （Ｐ ３ Ｕ １ ）［Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉ
ｃｓｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＩＩＩ
ｌｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１ １−７（１９７Ｂ） ）な
どが用いられる。
用する。たとえば、８−７ザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／Ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−八ｇ８−０
１ （Ｐ ３ Ｕ １ ）［Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉ
ｃｓｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＩＩＩ
ｌｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１ １−７（１９７Ｂ） ）な
どが用いられる。
（３） 細胞融合
融合試験は最後の免疫のための注射の後３日、目に実行
される。即ち、３日後に肺臓を摘出し、＃細胞を調整す
る。ハイブリドーマ生産のために使われる基本的方法は
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ＋Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ＋ Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８０）に述べられている方法と同じであ
る。
される。即ち、３日後に肺臓を摘出し、＃細胞を調整す
る。ハイブリドーマ生産のために使われる基本的方法は
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ＋Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ＋ Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８０）に述べられている方法と同じであ
る。
（４） モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体の大量スケールの生産のため、８−
１１週令マウスに２．６．１０．１４−テトラメチルペ
ンタデカンの０，４ｘｌが腹腔内に注射され。
１１週令マウスに２．６．１０．１４−テトラメチルペ
ンタデカンの０，４ｘｌが腹腔内に注射され。
その７日後にｌＸｌ０’ハイブリドーマ細胞が注射され
る。１０〜３０日後腹水を集め、遠心分離して固形分を
除き、 Ａｆｒｉｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの７フイ
ニテイークロマトグラフイーによって上澄から純化され
た。抗体のイソタイプ、サブクラスの決定は０ｕｃｈｔ
ｅｒ−１ｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学実験法１
５゜学会出版センター刊、 Ｐ７４．１９８１年）によ
って行う、かくして、ＩＦＮＧ−３，ＩＦＮＧ−５，Ｉ
ＰＮＧ−７と命名したハイプリドーマ株から得られるモ
ノクローナル抗体ＩＦＮＧ−３，ＩＦＮＧ−５及びＩＰ
ＮＧ−７はＩｇ（ｖｌに属することを同定した。
る。１０〜３０日後腹水を集め、遠心分離して固形分を
除き、 Ａｆｒｉｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの７フイ
ニテイークロマトグラフイーによって上澄から純化され
た。抗体のイソタイプ、サブクラスの決定は０ｕｃｈｔ
ｅｒ−１ｏｎｙ法（免疫学実験入門、生物化学実験法１
５゜学会出版センター刊、 Ｐ７４．１９８１年）によ
って行う、かくして、ＩＦＮＧ−３，ＩＦＮＧ−５，Ｉ
ＰＮＧ−７と命名したハイプリドーマ株から得られるモ
ノクローナル抗体ＩＦＮＧ−３，ＩＦＮＧ−５及びＩＰ
ＮＧ−７はＩｇ（ｖｌに属することを同定した。
］実施例 １１
（１）免疫マウス牌細胞の調製
２匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスが２種の融合試験のため免疫
された。抗原として前記ｒＩＮＦ−７を使用し、下記の
スケジュールに従って２匹の４週令メスＢ Ａ Ｌ Ｂ
／Ｃマウスが免疫された。
された。抗原として前記ｒＩＮＦ−７を使用し、下記の
スケジュールに従って２匹の４週令メスＢ Ａ Ｌ Ｂ
／Ｃマウスが免疫された。
３日目 ４ ２５（１，Ｐ、） ２００（１
，Ｐ、）ｓａｌｉｎｅ ５ａｌｉｎｅ Ｓ−Ｃ−：痔下注射 １、 Ｐ、 ：腹腔内注射 ＦＣＡ、： ７０インドの完全な７ジユバント融合試験
は最後の注射の３日目に実行された。
，Ｐ、）ｓａｌｉｎｅ ５ａｌｉｎｅ Ｓ−Ｃ−：痔下注射 １、 Ｐ、 ：腹腔内注射 ＦＣＡ、： ７０インドの完全な７ジユバント融合試験
は最後の注射の３日目に実行された。
（２）細胞融合
肺臓をＲＰ Ｍ Ｉ １６４０（日永製薬）培地中に粉
砕した。その細胞を遠心分離（１０分間＊ ２００Ｘｇ
）で集め。
砕した。その細胞を遠心分離（１０分間＊ ２００Ｘｇ
）で集め。
ＲＰＭ１１６４０倍地で洗った。一方、８−７ザグアニ
ン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１を培地（ＲＰＭ Ｉ
−１６４０１：１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清トｌＯ＃ｇ
／ｍｇ８−７ザグ７ニンを加えた培地）に培養した細胞
を融合に用いた。Ｐ３Ｕ１ミエローマは遠心分離によっ
て集められ、冷えたＲＰＭ１１６４０で洗った。
ン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１を培地（ＲＰＭ Ｉ
−１６４０１：１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清トｌＯ＃ｇ
／ｍｇ８−７ザグ７ニンを加えた培地）に培養した細胞
を融合に用いた。Ｐ３Ｕ１ミエローマは遠心分離によっ
て集められ、冷えたＲＰＭ１１６４０で洗った。
免疫した肺臓細胞とＰ３Ｕ１ミエローマを（２〜４Ｘ１
０’）： （２〜４Ｘ１０’）の割合で混合し遠心分離
（２００Ｘｇ、 １０分間ルな。細胞ベレットに５０％
（Ｗ／゛Ｖ）ポリエチレングリフール１０００を含むＲ
ＰＭ１１６４０溶液１０ｉｉ１が滴下され、室温で６分
間混合した。その混合細胞は遠心分離（２００Ｘｇ、
１０分間）で集められた。１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清
含有ＲＰＭＩＩ６４０の２４ａ（ｌを加え、よく混合し
た。（１−２Ｘ１０５）ミニｏ −ｖｃｅｌｌｓ／ｚｌ
細胞サスヘンシタン２す１を１０％（■ハ）牛胎児血清
を含む１８Ｒ１のＲＰＭ１１６４０で除々に希釈した。
０’）： （２〜４Ｘ１０’）の割合で混合し遠心分離
（２００Ｘｇ、 １０分間ルな。細胞ベレットに５０％
（Ｗ／゛Ｖ）ポリエチレングリフール１０００を含むＲ
ＰＭ１１６４０溶液１０ｉｉ１が滴下され、室温で６分
間混合した。その混合細胞は遠心分離（２００Ｘｇ、
１０分間）で集められた。１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清
含有ＲＰＭＩＩ６４０の２４ａ（ｌを加え、よく混合し
た。（１−２Ｘ１０５）ミニｏ −ｖｃｅｌｌｓ／ｚｌ
細胞サスヘンシタン２す１を１０％（■ハ）牛胎児血清
を含む１８Ｒ１のＲＰＭ１１６４０で除々に希釈した。
（１−２Ｘ１０’および１−２Ｘ１０３ミエローマｃｅ
ｌｌｓ／ｚ１）。これら希釈した細胞懸濁液は前もって
準備された４退会ＢＡＬＢ／Ｃマウスの肺臓及び胸腺由
来の供給細胞（ｆｅｅｄ−ｅｒ ｃｅｌｌ）（２Ｘｌ０
５）と混合した。この懸濁液の１００μρが２つの９６
穴ウエルプレートのウェルに展開された。５％ＣＯ２，
３７℃、湿度９５％で３日間培養した。３口径１０％牛
脂児血清、 １３．６μｇ／ｘρヒポキサンチン及び３
．９μｓ／ｊ１チミジンを含むＲＰＭ１１６４０培地（
以下ＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ培地と略す）の１００μ
βがウェルに加えられた。そρ後毎日培地の半量が新鮮
なＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ培地１００μｇで置き換え
られた。
ｌｌｓ／ｚ１）。これら希釈した細胞懸濁液は前もって
準備された４退会ＢＡＬＢ／Ｃマウスの肺臓及び胸腺由
来の供給細胞（ｆｅｅｄ−ｅｒ ｃｅｌｌ）（２Ｘｌ０
５）と混合した。この懸濁液の１００μρが２つの９６
穴ウエルプレートのウェルに展開された。５％ＣＯ２，
３７℃、湿度９５％で３日間培養した。３口径１０％牛
脂児血清、 １３．６μｇ／ｘρヒポキサンチン及び３
．９μｓ／ｊ１チミジンを含むＲＰＭ１１６４０培地（
以下ＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ培地と略す）の１００μ
βがウェルに加えられた。そρ後毎日培地の半量が新鮮
なＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ培地１００μｇで置き換え
られた。
（３）ハイブリドーマのクローニングと抗体産生１０〜
１４後、各ウェルの培養液の上ｉ■について。
１４後、各ウェルの培養液の上ｉ■について。
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって各ウェルの関連
抗体のテストを行った。０．ＩＭ ＮａＨＣＯ−−Ｎａ
ｚＣＯ＊（＋）Ｈ９，Ｏ）緩衝液にｒＩＦＮ−７１μｇ
／ｘｌ’ｒｊ解し、その溶液の１００μｐがＥＬＩＳＡ
のため前期９６穴ウエルプレートに加えられ、３時間。
抗体のテストを行った。０．ＩＭ ＮａＨＣＯ−−Ｎａ
ｚＣＯ＊（＋）Ｈ９，Ｏ）緩衝液にｒＩＦＮ−７１μｇ
／ｘｌ’ｒｊ解し、その溶液の１００μｐがＥＬＩＳＡ
のため前期９６穴ウエルプレートに加えられ、３時間。
３７℃反応後、その溶液は捨てられた。ウェルには３％
牛血清アルブミンを入れたＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ
ＨＣＬ ｐＨ７，５ｔ ５００＋ａＭ ＮａＣ１）２
００μ（を入れ１５時間、１５℃でブロックした。この
プレートはＥＬＩＳＡの標準法に従って抗ｒＩＮＦ−７
抗体の検出のために使われた。陽性ウェル中のハイブリ
ドーマはＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ培地を入れたＦａｌ
ｃｏｎ２４ウェルプレートに拡大した。そこでマイクロ
スコープにより手捏作でクローン化された。
牛血清アルブミンを入れたＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ
ＨＣＬ ｐＨ７，５ｔ ５００＋ａＭ ＮａＣ１）２
００μ（を入れ１５時間、１５℃でブロックした。この
プレートはＥＬＩＳＡの標準法に従って抗ｒＩＮＦ−７
抗体の検出のために使われた。陽性ウェル中のハイブリ
ドーマはＲＰＭ１１６４０−ＨＡＴ培地を入れたＦａｌ
ｃｏｎ２４ウェルプレートに拡大した。そこでマイクロ
スコープにより手捏作でクローン化された。
抗体価の認められた細胞について、限界希釈法によりク
ローニングを２〜４回繰り返し、抗インター７エロンー
γモノクローナ抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。
ローニングを２〜４回繰り返し、抗インター７エロンー
γモノクローナ抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。
（４）モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体の大量生産のため、ａ−ｔｔ週令マ
ウスに２．６．１０．１４テトラメチルペンタデカンの
０．４ｘ１が腹腔内に注射された。７口径ｌＸｌ０’バ
イプリドーマ細胞が注射された。１４日から２６日後そ
の腹水液が集められ、４００００Ｘｇ、 ２０分間遠心
分離した。そのモノクローナル抗体は７フイデルフロテ
インＡ７フイニテイークロマトグラフイーによって上澄
から純化された。
ウスに２．６．１０．１４テトラメチルペンタデカンの
０．４ｘ１が腹腔内に注射された。７口径ｌＸｌ０’バ
イプリドーマ細胞が注射された。１４日から２６日後そ
の腹水液が集められ、４００００Ｘｇ、 ２０分間遠心
分離した。そのモノクローナル抗体は７フイデルフロテ
インＡ７フイニテイークロマトグラフイーによって上澄
から純化された。
（５）確立されたハイブリドーマセルライン上記（１）
〜（４）までの実験で７ウスＡと７ウスＢの２匹のマウ
スを使用した。これら２匹を免疫後はその血清はｒｌＦ
Ｎ−７１１１３／ｘｌと１＝３５０００（マウスＡ）、
１ ： ７０００（マウスＢ）の希釈で反応した。こ
の２つの肺臓は独立した融合試験のために使われた。最
終的にｒＩＮＦ−γに対するモノクローナル抗体を産生
する２２のハイブリドーマセルラインがクローン化され
確立された。このうちバイブリド−ｖＮｏ ＩＦＮＧ
−３，ＩＰＮＧ−５、ＩＦＮ（’、−７の生産するモノ
クローナル抗体がヒ） ＋７ンバ球由米の天然型インタ
ーフェロン−γ（１，８Ｘ１０’単位／ｌ１１８蛋白）
（Ｍｅｌｏｙ Ｌａｂｓ。
〜（４）までの実験で７ウスＡと７ウスＢの２匹のマウ
スを使用した。これら２匹を免疫後はその血清はｒｌＦ
Ｎ−７１１１３／ｘｌと１＝３５０００（マウスＡ）、
１ ： ７０００（マウスＢ）の希釈で反応した。こ
の２つの肺臓は独立した融合試験のために使われた。最
終的にｒＩＮＦ−γに対するモノクローナル抗体を産生
する２２のハイブリドーマセルラインがクローン化され
確立された。このうちバイブリド−ｖＮｏ ＩＦＮＧ
−３，ＩＰＮＧ−５、ＩＦＮ（’、−７の生産するモノ
クローナル抗体がヒ） ＋７ンバ球由米の天然型インタ
ーフェロン−γ（１，８Ｘ１０’単位／ｌ１１８蛋白）
（Ｍｅｌｏｙ Ｌａｂｓ。
より購入）に対しても反応し、がっ、ｒインターフェロ
ン−γを臭化シアン及び／又はペプシンで分解したペプ
チドには反応しないことが判明した。この性質は試薬と
しての有望性を示すものである。
ン−γを臭化シアン及び／又はペプシンで分解したペプ
チドには反応しないことが判明した。この性質は試薬と
しての有望性を示すものである。
また免疫グロブリンクラスはＩｇＧ、であることがｆ１
明した０表１にハイブリドーマＩＦＮＣ，１−２２が生
産するモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス、ペ
プチド、天然型インター７エイロンーγとの反応性につ
いて示す。
明した０表１にハイブリドーマＩＦＮＣ，１−２２が生
産するモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス、ペ
プチド、天然型インター７エイロンーγとの反応性につ
いて示す。
表１．ｒインターフェロン−７に対するモノクローナル
抗体の性質 バイブ 免疫グロブ 力価 反応性 天然型リドーマ
リンクラス（＊ １ ）ペプチドインター（＊２）７二
ロ ＩＦＮＧ−２Ｍ１２８ ＋ ＋ＩＦＮＧ−３Ｇ
ｌ ８１９２ − ＋ＩＦＮＧ−４Ｇｌ
２０４８−− ＩＦＮＧ−５Ｇ１ ３２７６８ − ＋ＩＦＮ
Ｃ−６Ｍ １０２４ ＋＋（弱い）ＩＦＮＧ
−７Ｇ１ ３２７６８ − ＋ＩＦＮに ８
Ｇ２ａ ２０４Ｓ Ｎ、Ｄ、 −ＩＦ
Ｎ［ｌ；−９Ｍ ２５６ − ＋（弱い
）ＩＦＮＧ−１ｏ Ｇ １ ８１９２
＋ ＋ＩＦＮＧ−１１Ｇｌ ８１９２
− −ＩＦＮＧ−１２（ｉ １ ４０９６
＋ ＋ＩＦＮＧ−１，３Ａ ２０４８ ＋
十ＩＦＮＧ−１４に １ ４０９６ − −Ｉ
ＦＮＧ−１５Ｇ１３２７６８ ＋ ＋ＩＦＮＧ−１６Ｍ
３２ ＋ ＋［ＦＫ−１７Ｇ １ ３２７６
８ ＋ ＋ＩＦＮ（ニー１８ Ｇｌ
６４ − 一応性、Ｎ、Ｄ、：測定されな
かった。
抗体の性質 バイブ 免疫グロブ 力価 反応性 天然型リドーマ
リンクラス（＊ １ ）ペプチドインター（＊２）７二
ロ ＩＦＮＧ−２Ｍ１２８ ＋ ＋ＩＦＮＧ−３Ｇ
ｌ ８１９２ − ＋ＩＦＮＧ−４Ｇｌ
２０４８−− ＩＦＮＧ−５Ｇ１ ３２７６８ − ＋ＩＦＮ
Ｃ−６Ｍ １０２４ ＋＋（弱い）ＩＦＮＧ
−７Ｇ１ ３２７６８ − ＋ＩＦＮに ８
Ｇ２ａ ２０４Ｓ Ｎ、Ｄ、 −ＩＦ
Ｎ［ｌ；−９Ｍ ２５６ − ＋（弱い
）ＩＦＮＧ−１ｏ Ｇ １ ８１９２
＋ ＋ＩＦＮＧ−１１Ｇｌ ８１９２
− −ＩＦＮＧ−１２（ｉ １ ４０９６
＋ ＋ＩＦＮＧ−１，３Ａ ２０４８ ＋
十ＩＦＮＧ−１４に １ ４０９６ − −Ｉ
ＦＮＧ−１５Ｇ１３２７６８ ＋ ＋ＩＦＮＧ−１６Ｍ
３２ ＋ ＋［ＦＫ−１７Ｇ １ ３２７６
８ ＋ ＋ＩＦＮ（ニー１８ Ｇｌ
６４ − 一応性、Ｎ、Ｄ、：測定されな
かった。
［実施例２］ ｒ−インター７エイロンー７の定量ｒ
ＩＮＦ−γ分子の定量分析のため、サンドイッチＥＬＩ
ＳＡを開発した。プラスチック９６ウエルマイクロタイ
タープレートがウサギ抗「インターフェロン−γ−１８
Ｇ３３μｇ７ｘｉを含むＰＢＳで２５℃、１６時間コー
トされた。そのプレートはＰＢＳ（０，０１８ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、 ｐＨ７，（Ｌ ０．１５
ＭＮａＣｌ ）で２度洗われ、さらに非特異的反応範囲
をシールするため３％（Ｉｌｌ／Ｖ）牛血清アルブミン
を含むＰＢＳ中に４℃、１６時間インキュベートされた
。
ＩＮＦ−γ分子の定量分析のため、サンドイッチＥＬＩ
ＳＡを開発した。プラスチック９６ウエルマイクロタイ
タープレートがウサギ抗「インターフェロン−γ−１８
Ｇ３３μｇ７ｘｉを含むＰＢＳで２５℃、１６時間コー
トされた。そのプレートはＰＢＳ（０，０１８ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、 ｐＨ７，（Ｌ ０．１５
ＭＮａＣｌ ）で２度洗われ、さらに非特異的反応範囲
をシールするため３％（Ｉｌｌ／Ｖ）牛血清アルブミン
を含むＰＢＳ中に４℃、１６時間インキュベートされた
。
０．１％（Ｖハ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ Ｂ Ｓ （
Ｐ Ｂ Ｓ −Ｔｗｅｅｎと以下略す、）で２度洗った
後「インターフェロン−γを含む１００μｌのサンプル
が１５℃、１６時間インキュベートされた。そのサンプ
ルが捨てられ、そのプレートは２度Ｐ Ｂ Ｓ−Ｔｗｅ
ｅｎで洗われた６１％牛血清フルプミンを含むＰＢＳ中
の１００μｅの抗「インタ−７エロンーγモノクローナ
ル抗体が加えられ、３７℃、３時間インキュベートされ
た。２度Ｐ Ｂ Ｓ−Ｔｗｅｅｎで洗った後、ＰＯＤ（
ペルオキシダーゼ）結合抗マウスＩｇＧ（ヤギ）の１０
０μｐを適当な希釈比率でウェルに加えた。そのプレー
トは３７℃、３時間でインキエベートされた。ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎで２度洗った後、その酵素反応は０−７二二
レンジアミンを使った標準プロシコールによって行われ
た。 Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ。
Ｐ Ｂ Ｓ −Ｔｗｅｅｎと以下略す、）で２度洗った
後「インターフェロン−γを含む１００μｌのサンプル
が１５℃、１６時間インキュベートされた。そのサンプ
ルが捨てられ、そのプレートは２度Ｐ Ｂ Ｓ−Ｔｗｅ
ｅｎで洗われた６１％牛血清フルプミンを含むＰＢＳ中
の１００μｅの抗「インタ−７エロンーγモノクローナ
ル抗体が加えられ、３７℃、３時間インキュベートされ
た。２度Ｐ Ｂ Ｓ−Ｔｗｅｅｎで洗った後、ＰＯＤ（
ペルオキシダーゼ）結合抗マウスＩｇＧ（ヤギ）の１０
０μｐを適当な希釈比率でウェルに加えた。そのプレー
トは３７℃、３時間でインキエベートされた。ＰＢＳ−
Ｔｗｅｅｎで２度洗った後、その酵素反応は０−７二二
レンジアミンを使った標準プロシコールによって行われ
た。 Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ。
Ｎ ｅｗ Ｙ ｏｒｋ（１９８０）参照。
要約するとウサギ抗「インタ−７エロンーγポリクロー
ナル抗体を第１抗体として使い、ｍｌ抗体によって結合
されたｒインターフェロン−γは＃４２抗体としての「
インタ−７エロンーγモノクローナル抗体と酵素結合抗
マウス免疫グロブリンによって検出するのである。第１
図はＩＦＮＧ−５モノクロ一ナル抗体とＰＯＤ結合抗マ
ウスＩｇＧとのカップリングから得られた標準力価カー
ブを示している。ｒインター７エロンー７は５ ｎｇ／
ｍｌの濃度で検出できる。
ナル抗体を第１抗体として使い、ｍｌ抗体によって結合
されたｒインターフェロン−γは＃４２抗体としての「
インタ−７エロンーγモノクローナル抗体と酵素結合抗
マウス免疫グロブリンによって検出するのである。第１
図はＩＦＮＧ−５モノクロ一ナル抗体とＰＯＤ結合抗マ
ウスＩｇＧとのカップリングから得られた標準力価カー
ブを示している。ｒインター７エロンー７は５ ｎｇ／
ｍｌの濃度で検出できる。
［実施例３］ ｒ−インターフェロン−γに対する結
合プロフィール ２２の抗体の大部分はｐＨ３，５−１２でｒインターフ
ェロン−γを結合している。しかしＩＦＮＧ−１４のモ
ノクローナル抗体はｐＨ４，０以下ｐＨ９，５以上で結
合しない、第２図の（ａ）はＩＦＮＧ−１４生産のモノ
クローナル抗体に対する結合のｐｔ−ｉプロフィールで
ある。第２図の（ｂ）はｔＦＮＧ−５生産のモノクロー
ナル抗体に対する結合のｐＨブｏフィールである。
合プロフィール ２２の抗体の大部分はｐＨ３，５−１２でｒインターフ
ェロン−γを結合している。しかしＩＦＮＧ−１４のモ
ノクローナル抗体はｐＨ４，０以下ｐＨ９，５以上で結
合しない、第２図の（ａ）はＩＦＮＧ−１４生産のモノ
クローナル抗体に対する結合のｐｔ−ｉプロフィールで
ある。第２図の（ｂ）はｔＦＮＧ−５生産のモノクロー
ナル抗体に対する結合のｐＨブｏフィールである。
４シを米
本発明のモノクローナル抗体を用−１で組み換えインタ
ー７エロンーγのみならず天然型ンター７エロンー７を
効率よく定量し、精製することができろ。
ー７エロンーγのみならず天然型ンター７エロンー７を
効率よく定量し、精製することができろ。
第１図；ｒインターフェロン−γの含有量と〇−フェニ
レンノアミンを基質としたペルオキシダーゼによろ４９
２ｎ論の吸光度の関係を示す。 第２図； （ａ）はＩＦＮＧ−１４生産モノクロ一ナル抗体のｒイ
ンターフェロン−７との結合率とｐＨの関係を示す。 （１，）はＩＦＮＧ−５生産モノクロ一ナル抗体のｒイ
ンター７エロンーγとの結合率とｐＨの関係を示す。
レンノアミンを基質としたペルオキシダーゼによろ４９
２ｎ論の吸光度の関係を示す。 第２図； （ａ）はＩＦＮＧ−１４生産モノクロ一ナル抗体のｒイ
ンターフェロン−７との結合率とｐＨの関係を示す。 （１，）はＩＦＮＧ−５生産モノクロ一ナル抗体のｒイ
ンター７エロンーγとの結合率とｐＨの関係を示す。
Claims (2)
- （１）天然および組換えインターフェロン−γと反応す
る抗インターフェロン−γモノクローナル抗体。 - （２）天然および組換えインターフェロン−γと反応す
るが、臭化シアンまたは／及びペプシンによって分解さ
れたインターフェロン−γとは反応しない特許請求の範
囲第１項記載の抗インターフェロン−γモノクローナル
抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61287822A JPS63142000A (ja) | 1986-12-04 | 1986-12-04 | モノクロナ−ル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61287822A JPS63142000A (ja) | 1986-12-04 | 1986-12-04 | モノクロナ−ル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63142000A true JPS63142000A (ja) | 1988-06-14 |
Family
ID=17722212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61287822A Pending JPS63142000A (ja) | 1986-12-04 | 1986-12-04 | モノクロナ−ル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63142000A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7087726B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-08-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
-
1986
- 1986-12-04 JP JP61287822A patent/JPS63142000A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7087726B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-08-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| US7582445B2 (en) | 2001-02-22 | 2009-09-01 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| US7910707B2 (en) | 2001-02-22 | 2011-03-22 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| US8349331B2 (en) | 2001-02-22 | 2013-01-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
| US8557967B2 (en) | 2001-02-22 | 2013-10-15 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
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