JPS63146786A - アルカリ耐性セルラ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリ耐性セルラーゼに関する。

〔従来の技術〕

繊維索分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマス
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されて来
た菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ属
、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シュウトモナ
ス属、セルロモナス属、ルミノコッカス属、バチルス属
等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモアクチ
ノマイセス属等の放線菌でも報告されている。しかしな
がら、現時点では、バイオマス用セルラーピの工業的規
模での利用は、多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
るく特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、持分＋ｌｒｌ　６０−３６２４０号公報
）。しかし、自然界において従来見出されたセルラーゼ
のほとんど（ま、酸性乃至中性領域に於いて最大且つ安
定な酵素活性を示す、所、７１Ｍ性若しくは中性セルラ
ーゼに分類されるものであって、衣料用洗浄剤配合成分
としての必要条件である、アルノＪり領域で最大活性を
示すか、あるいはアルカリ耐性を有するセルラーピ、所
コ１アルカリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの
存在は、極めて少ないのが実情である。

ここで言うアルカリセルラ−ゼ アルカリ領域にあるものを言い、アルカリ耐性セルラー
ぜとは、至適ｐＨは酸性から中性領域にあるが、アルカ
リ領域に於いても至適ｐＨに於ける活性に比較して充分
に活性を有しかつ安定性を保持するものを言う。

また、中性とは１３１１５〜８の範囲を言い、アルカリ
性とはこれより高いｐＨ範囲をいう。

即ち、従来、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアル
カリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生産方法
としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養によりセ
ルラーゼＡを採取する方法（Ｖｔ公昭５０−２８５１５
号公報）、セルロモナス属に属する好アルカリ性細菌を
培落してアルカリセルラーゼ　３　０　１−Ａを生産す
る方法（特開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカ
リ性バチルス　Ｎα１１３９を培養してカルボキシメチ
ルセルラーピを生産する方法（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ，Ｆ．
　、にｕｄｏ。

Ｔ．　ａｎｄ　Ｉｌｏｒ：ｋｏｓｈｉ，に、、　Ｊ．Ｇ
ｃｎ．Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ．。

１３１、３３３９，　（１９８５））及びストレプトマ
イセス属の一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する
方法（特開昭６Ｌ−１９４８３号公（％ｊ）が報告され
ているに過ぎず、しかもいずれも工業的発酵生産に適う
ものでは無かった。

ところが、最近、本発明者らは好アルカリ性微生物の一
種であるバチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．
　　ＫＳＭ−６３５＞（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８７２）が
、衣料用洗浄剤組成物として適したアルカリセルラーぜ
Ｋを効率良く生産すること、及び更に培養条件を選択す
ることにより、より高収率で、アルカリセルラーゼＫが
得られ、アルカリセルラーゼの工業的発酵生産が可能と
なることを見出した。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記バチルス　エスピーＫＳＭ−６３５
の培養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えない
。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、ＩＩＨをアル
カリ性に保ち続ける必要があるが、現在までのところ、
好アルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性発酵法の歴史
は浅（、通常の中性微生物と比較するとこれら好アルカ
リ性微生物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積
されておらず、工業的発酵生産を行うにあたっての培地
調製、培養方法が操作上の難点となっていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはかかる問題点を解決するためにアルカリ領
域に至適１）Ｈを有するアルカリセルラーゼ或いは、ア
ルカリ領域に於いても、至適ｐｌ＋に於ける最高活性に
比較しても高活性を維持し得るアルカリ耐性セルラーゼ
を生産する中性ｍ菌を１９べく、鋭意検索をおこなって
いたところ、すでに北海道大学農学部菌株保存ｆＩｌ！
ｉ設（Ａ　Ｉ−（Ｌｌ　）において保存されている菌株
がアルカリ側においても該作用を有し、且つ安定性を保
持する、所謂アルカリ耐性セルラーゼを産生することを
見出し、本発明を完成した。

本発明において用いられる菌株は、北海道大学農学部菌
株保存Ｍｉ設（Ａ）−ＩＵ）においてバチルス　ズブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　Ａ　
ＨＩＪ１６１５として保存されている公知菌株であり、
また、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ　　
Ｐ−９０１４として寄託しである。そして、この菌株は
日本微生物保存連盟（ＪＦＣＣ）に加盟する前記保存機
関から自由に分譲を受けることができる。

この菌株を用いてアルカリ耐性セルラーピ、セルラーゼ
　Ｋ−１６１５を得るには、培地に該菌株を接種し、常
法に従って培養すれば良い。培地中には、責化し得る炭
素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好まし
い。この炭素源及び窒素源については特に制限はないが
、その例としては、窒素源・として無別態の硝安、硫安
、塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダや、コーン　
グルテン　ミール、大豆粉、コーン　スチープ　リカー
、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシ
ミール、肉エキス、ペプトン、バイブロ、アジパワー、
コーン　ソイビーン　ミール、コーヒー粕、綿実油粕、
カルブベータ、アミフレックス及びアジブロン、ピスト
、フレックスなどが挙げられる。又、炭素源としては、
籾殻、麩、濾紙、−絞紙類、おが屑などの植物ｔｌＮ質
、廃糖蜜、転化糖、ＣＭＣ，アビセル、セルロース綿、
キシラン、ペクチンに加え、責化し得る炭素源、例えば
、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース
、フラクトース、蔗糖、乳糖、麦芽糖、ソルビトール、
マンニトール、イノシトール、グリセリン、可溶性デン
プンや責化し得る有ＲＷ、例えば酢酸、クエン酸等が挙
げられる。また、その他、リン酸、Ｈｇ２＋　、　（：
ａ２＋　、　Ｈｎ”　、　ｌｎ２＋　、　Ｃ０２÷。

Ｈａ”　、　　に１などの無機塩や、必要であれば、無
機、有機微醇栄１１源を培地中に適宜添加することもで
きる。

斯くして（ηられたＪ８養物中から目的物質であるセル
ラーゼに−１６１５の採取及びｇ製は、一般の酵素の採
取及び精製の手段に準じて行なうことが出来る。即ち、
遠心分離又は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を
培養液から除去して粗酵素液を得ることも出来る。この
粗酵素液は、そのまま使用することも出来るが、必要に
応じて、塩析法、沈澱法、限外ン濾過法等の分離手段に
より粗酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化して
、精製酵素として使用することも可能である。

斯クシて得られた本発明のアルカリセルラーぜ　Ｋ−１
６１５は、以下に示す酵素学的性質を有する。なお、酵
素活性の測定は、以下の方法に従って行ない、また用い
た緩衝液は次の通りである。

ｐ（１３〜８　　　マクルベイン緩衝液１１Ｈ８〜１１
　　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 １）１１１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液 酵素活性測定法； （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０ａｙＣＭＣ（Ａ−０１１，重陽国策バルブ社）、１
００μｍｏｆ各種ｔ１衝液（マクルベイン、リン酸、グ
リシン−ＮａＯｌｌ等）を含む基質用液０．９ｄに０．
ＩＩｄの酵素溶液を加え、３０℃、２０分反応した。反
応後、３．５−ジニトロ−サリチル酸（３、５−ｄｉｎ
ｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮＳ）
）法にて還元糖の定量を行った。すなわち、反応液１．
０−にＤＮＳ試薬１゜Ｏｄを加え、５分間、１００℃で
加熱発色させ、冷加後、４、Ｏｄの脱イオン水を加えて
希釈した。これを波長５３５　ｎｍで比色定量した。酵
素力（市は、上記の条件下で１分間に１μｍｏｌのグル
コースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とし
た。

（２）ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性０．１
μｍｏｌ　ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ社
）、１００μｍ０１　リン酸！！衝液（ｐ１１７．０）
を含む反応液１．０蔵中に適当量の酵素液を３０℃で作
用させた後、１　ＨＮａ２ＣＯ３を０．３　ｄ　。

脱イオン水を１．７１ｎｉ順次加え、遊１１するｐ−ニ
トロフェノールを４００ｎｆｆｉで比色定面した。酵素
力価は、上記の条件下で１分間に１μｎ＋ｏｌのｐ−二
トロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）アビセラーピ、セルロース粉末分解、及び濾紙分
解活性 ２０ＪＩ！？アビセル（メルク社）、２００μｍｏｌ　
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を含む反応液２．　Ｏｄ中
に適当量の酵素液を加え、３０℃、２５０　ｒａｎで振
とうしながら作用させた。反応後、冷却遠心分離（５℃
、３０００ｒｐｍ　、２０分）を行い、その上清１．０
ｄｅＤＮＳ法にて還元糖の定量を行った。

セルロース粉末弁Ｗ？活性はセル〔１−ス粉末（東洋縞
紙社）を、濾紙分解活性は濾紙（１？ルラーぎ粘性検定
用濾紙、東洋Ｎ０５１−特）を用い、アビセラーゼ話性
の時と同様に行った。酵素力（西は、上記の条件下で１
分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成
する酵素量を１単位とした。

（４）セロビオーゼ活性 １０ｍｇセロビオース（関東化学社）、１００μｍｏｌ
リン酸緩衝液（ｐｌ＋７．０）を含む反応液１、Ｏｄ中
に適当量の酵素液を３０℃で作用させた後、１００℃、
２分処理し酵素を失活させた侵、生成グルコース罎をム
ロターゼ・ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｃ−Ｔｅ５ｔ、
和光紬薬工業社）で測定した。

酵素力価は、上記の条件下で１分間に２１１ｍｏｌのグ
ルコースを生成する酵素量を１単位とした。

（＃Ｉ＃素学素性的性 質１）作用 セルロース、ン戸紙、アビセル、ＣＭＣ等の繊維素によ
く作用し、これらを溶ｗ４ｔ！シめ、グルコース等の還
元糖を生成する。

（２）基質特異性 木ＷＩ素はＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセル
、濾紙、ｐ−ニトロフェニルセロビオシド及びセロビオ
ースに対する活性を有していた。

（３）作用１）Ｈ及び最適ｐＨ 作用ＤＨ範囲は、３〜１２．５と極めて広範囲にわたる
。最適ｐＨよ、５〜７であり、３．５〜１０．５の範囲
に於いても至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活
性を有しており、過去に研究されたセルラーゼの中でも
最もアルカリ側で作用ｐＨ範囲が広い酵素と８えろ（第
１図）。

（４）ｐＨ安定性 各々のｐｌ＋で３０℃、１時間保持した後の残存活性を
測定し、ｐｌ＋安定性を調べた。その結果、１）Ｈ４−
１０で極めて安定で失活せず、ｐＨ３，５〜１１に於い
ても、５０％以上の活性を維持していた。本酵素は、こ
のように高アルカリ領域に於いても充分に安定である（
第２図）。

（５）最適温度 作用ｍ度は、１５〜８５℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６０℃であった。又、４５〜７５”Ｃ（７）範囲
に於いても、至適温度での活性の５０％以上を有してい
たく第３図）。

（６）温度安定性 至適ｐｌ＋に於いて、３０分間各温度で処理した後、残
存活性を測定した結果、５０℃では安定しており、５５
℃に於いても約５０％の残存活性を有していたく第４図
）。

（７）分子量 本酵素をセフ７デツクスＧ　−１００（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−１００）によるゲル濾過法に基づき分子量を測定
したところ、約１，６万に主たるピークが観察された。

（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（ＡＩ！３＋　、　ｌ
：６３＋。

３ａ２４．　ｃａ２＋、　（：ｄ２＋、　（：０２＋、
　ｃｒ２＋、　ｃｕ２＋、　ＦＯ２＋。

＋１０”　、　　Ｈｎ”　、　　Ｎｏ”　、ｆ％”　、
　　Ｐｂ”　、　　Ｚｎ２÷、　　Ｌｉ十　。

Ｋ”　、　Ｎａ＋）を活性測定時に共存させて、その影
響を検討したく各種金属イオン濃度は１ｍＨ，Ｋ”。

Ｈａ＋は５０ｎＨである）。

その結果、１１（１２＋で阻害されたが、その他の金属
イオンについては、はとんど阻害も活性化も認められな
かった。

（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯ３
、α−８ＦＥ、ＳＡＳ、石鹸、Ｓ−７０）の活性に及ぼ
す影響を調べた。界面活性剤０．０５％溶液で３０℃、
１５分間処理後、活性測定を行った。その結果、何れの
界面活性剤によってもほとんど阻害を受けなかった。強
力なデタージエントであるソデイウム・ドデシルサルフ
ェートによってもほとんど活性の阻害は認められなかっ
た。

（１０）プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電工）
、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーゼ（ノボ社
）を、活性測定時に共存（０，１Ｒｇ／ｄ＞させてその
影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対しても、
本酵素は強い耐性を有することがわかった。

（１１）キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、ぜオ
ライド、５ＴＰＰを活性測定時に１ＱｍＨ共存させ、そ
の影響を検討したが、はとんど阻害は認められなかった
。

〔発明の効果〕

本発明のヒルラーゼ　Ｋ−１６１５は、至適ρ１１を約
７に有するにもかかられず高アルカリのｐＨ１０におい
ても最適ｐ１１の８０％以上、ｐＨ１１に於いても６０
％以上の相対活性を有し、ｐＨ５〜１２に於て極めて安
定である。また、界面活性剤、プロテアーゼ、キレート
剤等の洗？ヤ剤配合成分によってもほとんど阻害を受け
ない。したがって、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分と
して有利に使用することができるものである。

また、本発明で用いる菌株、バチルス　ズブチリス　Ａ
ＨｔＪ　　１６１５は中性で生育する菌株であるので、
好アルカリ性細菌と比べ容易にアル７Ｊり耐性セルラー
ゼを工業的に生産することができる。

〔実旗例〕

以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 北海道大学農学部菌株保存ｆＩ！ｊ設（ＡＨＵ）より分
選を受りたバチルス　ズブチリス　ＡＨＵ１６１５　　
（ＫＳＭ−１６１５）を滅菌生理食塩水に懸濁した後、
これを適当に希釈して下に示ず分離用寒天培地（培地１
）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３日間培養し
、集落を形成させたところ、ＣＭＣの溶解に基づく透明
帯を形成した。この集落を下記の成体培地２に接種し、
３０℃で３日間振盪培養した。培！！後、遠心分離した
上浦液について、０１１３〜１３に於けるＣＭＣアーゼ
活性を測定し、セルラーゼ生産性を確認した。

培地１．　　　ＣＭＣ２％ ポリペプトン　　　　　　　　　０．５％酵母エキス　
　　　　　　　　　０．０５％ＫＨ２ＰＯ４０，１％ Ｎａ２　ＦＩＰＯ４・　１２Ｈ２００，２５％ＭＱＳＯ
ａ・７Ｈ２００，０２％ 寒天　　　　　　　　　　　　　　０．７５％液体培地
２．　　ＣＭｏ　　　　　　　　　　　１％ポリペプト
ン　　　　　　　　　１％ 酵母エキス　　　　　　　　　　０．５％ＫＨ２ＰＯ４
０，１％ Ｎａ２　ＨＰＯａ　　・　１　２Ｈ２００，２５％実施
例２ 実施例１においてセルラーゼ生産性の確認された微生物
を液体培地２に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。

培養後、菌体を遠心分離して除さ、粗酵素液を得た。こ
の粗酵素液１ρに対して、ドライアイス−エタノール中
で３象のエタノールを加え、生じた沈澱を遠心分離し更
に凍結乾燥を行ない乾燥粉末としてセルラーゼ　Ｋ−１
６１５９ｓ（比活性６単位／ｌ：ｌ）＋１９における測
定値。

以下同じ）を得た。

実施例３ 前記液体培地２においてＣＭＣを１％蔗糖に、ポリペプ
トンを７％コーン　スチーブ　リカーに代えた培地を用
い、実施例１に準じて３０℃で２日間振盪培養した。得
られた培養液の遠心分離上清についてそのＣＭＣアーゼ
活性を測定したところ４Ｃ単位／１であった。

４、図面の１？！Ｉｉ’ｔな説明 第１図は、酵素反応１）Ｉ＋と相対活性の関係を示す図
面である。

第２図は、酵素！ｉ！ｌ理ｐ１１と相対活性の関係を示
す図面である。

第３図は、酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。

第４図は、酵素処Ｒ湿度と相対活性の関係を示す図面で
ある。

以上 第１図 反応ｐＨ 第２図 処理ｐ）（ 第３図 反応温度（”Ｃ１ 第４図 ・Ｓ理旦蜜（０Ｃ） 手続補正書（自発） 昭和６２年３　月　４日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の酵素学的性質を有するアルカリ耐性セルラーゼ
   　Ｋ−１６１５。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セルロース、
   濾紙、アビセル等の繊維素によく作用し、これらを溶解
   せしめ、グルコース等の還元糖を生成する。 （２）基質特異性 ＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセル、濾紙、ｐ
   −ニトロフェニルセロビオシド及びセロビオースに対す
   る活性を有する。 （３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は、３〜１２．５である。最適ｐＨは、５
   〜７であり、３．５〜１０．５の範囲に於いても至適ｐ
   Ｈに於ける活性の約５０％以上の相対活性を有する。 （４）ｐＨ安定性 ｐＨ４〜１０で極めて安定で失活せず、ｐＨ３．５〜１
   １に於いても、約５０％以上の残存活性を維持する。 （５）最適温度 作用温度は、１５〜８５℃の広範囲にわたり、その至適
   温度は６０℃である。また、４５〜７５℃の範囲に於い
   ても、至適温度での活性の５０％以上を有している。 （６）分子量 約１．６万に分子量のピークを有する（セフアデックス
   Ｇ−１００を用いたゲル濾過法による）。 （７）金属イオンの影響 Ｈｇ＾２＾＋、Ｂａ＾２＾＋で阻害される。 （８）界面活性剤の影響 ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯＳ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石
   鹸、ポリオキシエチレン　セカンダリー　アルキルエー
   テルは、活性をほとんど阻害しない。 （９）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 （１０）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＳＴＰＰ、ゼオライト、クエン酸
   は活性を阻害しない。