JPH0427386A - プロテアーゼ耐性セルラーゼ、これを産生する微生物及び該セルラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はプロテアーゼ耐性を有するセルラーゼ、これを
産生ずる微生物及び該セルラーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

繊維素分解酵素（セルラーゼ）の開発は、従来、バイオ
マス資源の有効利用を一大目標として進められており、
トリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレモニウム属
、フミコーラ属等の糸状菌を中心に、シュウトモナス属
、セルロモナス属、ルミノコッカス属、バチルス属等の
細菌、更に、ストレプトコツカス属、アクチノマイセス
属等の放線菌を供給源とするセルラーゼが報告されてい
る。

しかしながら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの
工業的規模での利用は多くない。

一方、セルラーゼの産業的用途として、衣料用洗浄剤の
配合成分としての利用が大きくなっている（特公昭５９
−４９２７９号公報、特公昭６０−２３１５８号公報、
特公昭６０−３６２４０号公報等）。衣料用洗浄剤組成
物として使用し得るセルラーゼを生産する方法としては
、好アルカリ性バチルス属細菌の培養によりセルラーゼ
Ａを採取する方法（特公昭５０２８５１５号公報）、セ
ルロモナス属に属する好アルカリ性細菌を培養してアル
カリセルラーゼ３０１−Ａを生産する方法（特開昭５８
−２２４６８６号公報）、好アルカリ性バチルスＮ　ｏ
　１１３９を培養してカルボキシルメチルセルラーゼ（
ＣＭＣ）を生産する方法（Ｈｏｒｉｋｏｓｉら、　　Ｊ
、Ｇｅｎ０Ｍ１ｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１３１巻、　　
３３３９頁（１９８５年））、ストレプトマイセス属の
一種を用いてアルカリセルラーゼを生産する方法（特開
昭６１−１９４８３号公報）、好アルカリ性細菌の一種
バチルス・エスピーＫＳＭ−６３５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｓｐ、　ＫＳＭ６３５）を培養してアルカリセルラー
ゼＫを生産する方法（特開昭６３−１０９７７６号公報
）等の所謂アルカリセルラーゼを生産する方法、バチル
ス属細菌を培養してアルカリ耐性セルラーゼに−５２２
及びに−５８８を生産する方法（特開昭６４−３７２８
５号公報、特開昭６４−３７２８６号公報）等の所謂ア
ルカリ耐性セルラーゼを生産する方法が報告されている
。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これらのセルラーゼはプロテアーゼに対
する耐性を有していない。そのために、例えば、プロテ
アーゼが配合された衣料用液体洗浄剤に同時に配合する
ことができなかった。

かかる間頌を解決する手段として、セルラーゼを固定化
する方法、化学修飾することにより安定化する方法等が
考えられるが、コスト、収率等の問題より産業的利用に
適しているとはいえない。

従って、プロテアーゼ耐性を本来的に有しており、衣料
用洗浄剤の成分として好適なセルラーゼの開発が望まれ
ていた。

〔課題を解決するための手段〕

このような実情において、本発明は上記目的を達成すべ
く、プロテアーゼ耐性を有するセルラーゼを生産する微
生物を検索したところ、アスペルギルス属に属する特定
の微生物が生産するセルラーゼ群の中にかかる要件を満
たすセルラーゼを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はプロテアーゼ耐性を有する特定の新
規セルラーゼ、これを産生ずる微生物及び該酵素に代表
されるプロテアーゼ耐性セルラーゼの製造法を提供する
ものである。

本発明に用いられるアスペルギルス属に属するプロテア
ーゼ耐性セルラーゼ生産菌としては、例えばアスペルギ
ルス　ニガーＩＦＤ−３１１２５［ｒＬｌｓＴＯＦ　Ｃ
ＵＬＴＵＲＢＳ；　Ｂｉｇｈｔｈ　Ｂｄｉｔｉｏｎ、　
Ｖｏｌ、　１　（１９８８）大阪発酵研究所」に記載〕
、本発明者らが茨城県鹿島郡周辺の土壌より分離した菌
株ＫＳＭ−２４、ＫＳＭ−２５等が挙げられる。ＫＳＭ
−２４株及びＫＳＭ−２５株はそれぞれ次に示すような
菌学的性質を有する。

＜ＫＳＭ−２４株〉 （ａ）　　形態学的性質 菌糸：太さ約２μｍ、隔壁が存在する。

分生子柄：太さ約６〜８μｍ１表面は平滑である。

頂嚢：分生子柄の先端が膨大して頂嚢を生ずる。形は直
径的２２〜３２μｍの球形である。

梗子：頂嚢の全面に着生し、第１梗子、第２梗子をもつ
複列である。第１梗子は長さ約２３〜２５μｍ１第２梗
子は５〜６μｍである。

分生子：直径的１，６〜２μｍの球形で、色は黒。表面
は平滑である。

分生子頭二球状、または放射状である。

（ハ）各培地における生育状態 １）麦芽エキス寒天培地：コロニーは不規則形で中心凸
状。高さは２〜４闘。表面の色は黒色、裏は白色。コロ
ニーの生育速度は０．８３ｃｍ／日。

２）バレイショ・ブドウ糖寒天培地：コロニーは不規則
形で中心凸状。高さは２〜４■。生育は極めて良好。表
面の色は黒色、裏は白色。

コロニーの生育速度は０．４３ｃｍ／日。

３）ツアペック寒天培地：コロニーはやや不規則で中心
やや凸状。高さは２〜３ｍｍ、表面の色は黒色、裏は白
色。コロニーの生育速度は０．８３ｃｍ／日。

４）サブロー寒天培地：コロニーは円形で渦状に凸状。

高さは２〜４ｗ０表面の色は黒色、裏は白色。コロニー
の生育速度は０．８３ｃｍ／日。

５）オートミール寒天培地：コロニーは円形で偏平状。

高さは１〜２ＩＩＩｆｆｌ。生育は良好で、水滴有り。

表面の色は黒色、裏は白色。コロニーの生育速度は１．
１０ｃｍ／日。

６）ＹｐＳｓ寒天培地：コロニーは円形で偏平状。高さ
は１〜２ｍ０表面の色は黒色、裏は白色。黄色の色素を
生成。コロニーの生育速度は１．１０ｃｍ／日。

（Ｃ）　　各生理的、生態的性質 １生育ｐＨ：　ｐＨ４〜１０ ２生育温度：２０〜４０℃ ３生育ＮａＣｊｉｓ度二３Ｍ以下 ４至適ｐＨ：　ｐＨ５〜６ ５至適温度＝３０℃ ６硝酸塩資化性：　＋ ７　Ｖ−Ｐテスト： ＜ＫＳＭ−２５ン （ａ）　　形態 分生子柄の先端が膨らみ頂嚢となる。その表面に梗子が
複列に直塗ずる。胞子は黒色をし梗子の先端から、球状
または放射状に長い連鎖を形成する。

（ｂ）　　各培地における生育状態（３０ｔ’で８日間
培養） １）麦芽エキス寒天培地：コロニーは不規則形で中心凸
状。高さは２〜４ＩＴ１ｍ０表面の色は黒色、裏は白色
。コロニーの生育速度は、０．８３０ｍ／日。

２）バレイショ・ブドウ糖寒天培地：コロニは不規則形
で中心凸状。高さは２〜４ｍｌＴ１０生育は極めて良好
。表面の色は黒色、裏は白色。

コロニーの生育速度は、０．４３ｃｍ／日。

３）ツアペック寒天培地：コロニーはやや不規則で中心
やや凸状。高さは２〜３　ｍｍ０表面の色は黒色、裏は
白色。コロニーの生育速度は、０．８３ｃｍ７日。

４）サブロー寒天培地：コロニーは円形で渦状に凸状。

高さは２〜４　ｍｍ０表面の色は黒色、裏は白色。コロ
ニーの生育速度は、０．８３ｃｍ／日。

５）オートミール寒天培地：コロニーは円形で偏平状。

高さは１〜２ｍ＋ｎ０生育は良好で、水滴有り。表面の
色は黒色、裏は白色。コロニーの生育速度は、１．１０
ｃｍ／日。

６）ＹｐＳｓ寒天培地：コロニーは円形で偏平状。高さ
は１〜２　ｍｍ０表面の色は黒色、裏は白色。色素は生
成しない。コロニーの生育速度は、１．１０ｃｍ／日。

（Ｃ）　　各生理的、生態的性質 １）生育ｐＨ：ｐ８４〜１０ ２）生育温度：２０〜４０℃ ３）生育ＮａＣ１濃度二３Ｍ以下 ４）至適ｐＨ：　ｐＨ５〜６ ５）至適温度＝３０℃ ６）硝酸塩資化性：＋ ７）　Ｖ　−Ｐテスト： 以上の菌学的性質について、“微生物の分類と同定（上
）”　（長谷用武治編著、株式会社学会出版センター発
行）、“カビの分離・培養と同定”（宇田用俊−１室井
哲夫訳、医歯薬出版株式会社発行）に８己載されている
検索表を参照した結果、これらの菌株は、アスペルギル
ス　ニガーに属すると認められた。しかし、これらの菌
株の菌学的性質は公知のアスペルギルス　ニガーのいず
れとも一致しないので、これらを新規菌株と判断してア
スペルギルス　ニガー　ＫＳＭ−２４及びアスペルギル
ス　ニガー　ＫＳＭ−２５と命名し、微工研菌寄第１１
３２７号及び同第１１３２８号として工業技術院微生物
工業技術研究所にそれぞれ寄託した。

上記菌株に代表されるアスペルギルス属にｉするプロテ
アーゼ耐性セルラーゼ生産菌を用いてプロテアーゼ耐性
セルラーゼを製造するには、このような菌を培養し、そ
の培養物より採取すればよい。培養は、固体または液体
培地を用い、常法に従って行なわれる。

培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有
せしめておくことが好ましい。この炭素源及び窒素源に
ついては特別に制限はないが、その例としては、窒素源
として無機態の硝安、硫安、塩安、リン酸アンモニウム
、硝酸ソーダや大豆粉、コーンスチーブリカー、カザミ
ノ酸、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、綿実油粕、カ
ルチベータ、アジックス、グルタミン酸ソーダ等が挙げ
られる。

又、炭素源としては、籾殻、ふすま、おが屑等の植物繊
維質、ＣＭＣ，アビセル、セルロース綿、キシラン、ペ
クチンに加え、資化し得る炭素源、例えば、アラビノー
ス、キシロース、グルコース、マンノース、フラクトー
ス、ガラクトース、ショ糖、トレハロース、グリセリン
や資化し得る有機酸、例えば、クエン酸や酢酸が挙げら
れる。また、その他、リン酸、Ｍｇ２＋、Ｃａ”、Ｎ　
ａ十、Ｋ＋等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微
量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。

かくして得られた培養物からの目的物であるプロテアー
ゼ耐性セルラーゼの採取及び精製は、般の酵素の採取及
び精製の手段に準じて行うことができる。更に、必要に
応じ、後記実施例に示すごとく、プロテアーゼ耐性であ
ることを利用してプロテアーゼ処理を行うこともできる
。

即ち、培養物を遠心分離、濾過等によっ−Ｃ菌体を分離
することにより、粗酵素液を得ることができる。この粗
酵素液はそのまま使用することもできるが、必要に応じ
て、例えば、塩析法、溶媒沈澱法（メタノール、エタノ
ール、イソプロピルアルコール等）によってタンパク質
を沈澱させたり、限外濾過（例えば、旭化成社製、分画
分子量１．３万）により濃縮後、凍結乾燥により、粗酵
素粉末を得ることができる。塩析法では、例えば、硫安
（６０〜１００％飽和画分）で沈澱させた後、濾過或い
は遠心分離、脱塩することによってこれを凍結乾燥粉末
にすることができる。脱塩の方法としては、透析、セフ
ァデックスＧ−２５（ファルマシア社製）等を用いるゲ
ル濾過法等の一般的方法が用いられる。更に必要に応じ
て、例えば、プロテアーゼ処理、イオン交換クロマトグ
ラフィー分子フルイクロマトグラフィー等を適宜組み合
わせてプロテアーゼ耐性セルラーゼを分別精製すること
ができる。

上記プロテアーゼ耐性セルラーゼの製造法において、微
生物として前記アスペルギルス　ニガーＫＳＭ−２４（
微工研菌寄第１１３２７号）を用いて得られたプロテア
ーゼ耐性セルラーゼは、以下に示す酵素学的性質を有す
る。

なお、酵素活性の測定は以下の方法に従って行い、次の
緩衝液を用いた。

ｐＨ２〜３　グリシン−塩酸緩衝液 ｐＨ３〜６　クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６〜８　リ
ン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ８〜１１グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 酵素活性測定法二 （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０ｍｇＣＭＣ（ＡＯ１ＭＣ１山陽国策バルブ社製）及
び１００ｍＭ各緩衝液を含む基質溶液０．９−に０．１
ｒｎｌの酵素溶液を加え、４０℃、２０分反応した。反
応後、３．５−ジニトロサリチル酸（３，５−ｄｉｎｉ
ｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＮ　Ｓ）法
にて還元糖の定量を行った。すなわち、反応後、１．０
ＦＩＬｉ７にＤＮＳ試薬１．０ｍｌを加え、５分間、１
００℃で加熱発色させ、冷却後、４．０ｒｎｌの蒸留水
を加えて希釈した。これを波長５３５ｎｍで比色定量し
た。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μｒｎｏ１
のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単
位とした。

（２）ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性０゜１
μｍｏｊ！ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ社
製）及び１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
）を含む反応液１．　Ｏｍｆ中に適当量の酵素液を４０
℃で作用させた後、ｌＮＮａ、Ｃ（Ｌ　　Ｏ，３ｍＮ及
び蒸留水１．７ｍｌ！を順次加え、遊離するｐ−ニトロ
フェノールを４００ｎｒｎで比色定置した。酵素力価は
、上記の条件下で１分間に１μｍｏ１のｐ−ニトロフェ
ノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）　　アビセル、セルロース粉末、リン酸膨潤セル
ロース及び濾紙分解活性 １５ｍｇアとセル（メルク社製）及び１００ｍＭクエン
酸す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ５）を含む反応液２．０
−中に適当量の酵素液を加え、４０℃で振とうしながら
作用させた。反応後、冷却遠心分離（５℃、　３０００
ｒｐｍ　、　　２０分）を行い、その上！１．Ｏｍｊ！
を３，５−ジニトロサリチル酸法にて還元糖の定量を行
った。セルロース粉末分解活性はセルロース粉末（東洋
濾紙社製）を、リン酸膨潤セルロース分解活性はトミタ
らの方法（Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、：　Ｊ
、Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｎｏｌ。

５２、２３５．１９７４）により処理したセルロースを
、濾紙分解活性は濾紙（セルラーゼ活性度検定用濾紙、
東洋Ｎα５１−特）を用い、アビセル分解活性の場合と
同様に行った。酵素力価は上記の条件下で１分間に１μ
ｍｏｊ！のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素
量を１単位とした。

（４）セロビオーゼ活性 １０ｍｇセロビオース（東洋化学社製）及び１００ｍＭ
クエン酸す）　＋Ｊウム緩衝液を含む反応液１、Ｏｒｄ
中に適当量の酵素液を４０℃で作用させた後、１００℃
、１０分間処理して酵素を失活させ、次いで生成グルコ
ースをムタロターゼ・ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｃ−
Ｔｅ５ｔ、和光紬薬工業社製）で測定した。酵素力価は
上記の条件下で１分間に２μｍｏｌのグルコースを生成
する酵素量を１単位とした。

（酵素学的性質） （１）　　作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）　によく作用し
、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖を生成す
る。

（２）基質特異製 カルボキシメチルセルロースの他、リン酸膨潤セルロー
ス、アミロースに対しても若干の活性を有する。アビセ
ル、セルロース粉末、濾紙等の結晶質繊維及びｐ−ニト
ロフェニルセロビオシド、セロビオースに対する分解活
性は有していない。

（３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は３〜１ｏの広範囲であった。

至適ｐＨは６．０であり、４〜８の範囲に於いても至適
ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活性を有していた
（図１）。

（４）　ｐＨ安定性 各々のｐＨで３０℃、１時間保持した場合、ｐＨ３〜１
１と極めて広範囲で安定であった（図２）。

（５）作用温度及び至適温度 １００１００ｒｎ　Ｈ９のグリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液中で作用温度を測定した結果、作用温度は２０〜
８５℃の広範囲にわたり、その至適温度は７０℃であっ
た。また、４０〜８０℃に於いても、至適温度での活性
の５０％以上の相対活性を有していた（図３）。

（６）温度安定性 １００ｍＭ５ｐ　Ｈ９のグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液中で、１０分間各温度で処理した後、残存活性を測
定した結果、６０℃では安定しており、７５℃でも５０
％以上の残存活性を有していた（図４）。

（７）キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ。

ＮＴＡ及び５ＴＰＰを活性測定時に共存させ、その影響
を検討した結果、はとんど活性を阻害されなかった。

（８）金属イオンの影響 各種金属イオン（Ａ　Ｉ　”　　Ｆ　ｅ　”　　Ｂ　ａ
　”Ｃａ２−２　　Ｃｏ”、Ｃｕ”、１；’　ｅ２＋、
Ｈｇ２４Ｍｇ”、Ｍｎ”、Ｎｉ”、Ｓｎ”　　Ｚｎ２＋
に＋及びＮ　ａ　”）を活性測定時に共存させ、その影
響を検討した（Ｋ＋及びＮａ＋についてはそれらの塩濃
度を５０ｍＭとし、他のイオンについては、１ｍＭとし
た）。その結果、Ｃｕ”５１１２＋、及びＨｇ　２＋に
より阻害された。

（９）分子量 本酵素をＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷ　（東ソー社製）によ
るゲル濾過法により分子量測定したところ、約６万であ
った。また、ファストシステム（Ｐｈａｓｔ−ｓｙｓｔ
ｅｍ　（ファルマシア社製））による、５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法では、約５．２万の分子量
を示した。

α口　糖含量 本酵素をフェノール硫酸法により糖含量を測定したとこ
ろ、約９％（マンノース相当）の糖を含有していた。

卸　界面活性剤耐性 各界面活性剤（例えば、直鎮アルキルベンゼンスルホン
酸（ＬＡＳ）、アルキルスルホン酸ナトリウム（ＳＡＳ
）　、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（Ａｓ）及び
ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩
（ＥＳ）に対する安定性を検討するために、本酵素を界
面活性剤１０％水溶液と共に４０℃で保存し、２週間後
の残存活性を測定した。その結果、何れの界面活性剤と
共存した場合も５０％以上の残存活性を有していた（表
１）。

以下余白 表１ ＊　：　１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９）□　プロ
テアーゼ耐性 各プロテアーゼ（例えばサビナーゼ（ノボ社製）、ペプ
シン（シグマ社製）及びパパイン（シグマ社製））に対
する、本酵素の安定性を検討するために、各プロテアー
ゼＩＡＵ／−と共に、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
）中、４０℃で２週間保存し、その残存活性を測定した
。

その結果、５０％以上の残存活性を有し、プロテアーゼ
に対し極めて強い耐性を有していたく表２）。

表２ 〔実施例〕 以下、実施例を挙げて更に詳しく説明するが、本発明は
これらに限定されるものではない。

実施例１ 茨城県鹿島郡神栖町周辺の採取土壌約１ｇを１％ＮａＣ
１含有滅菌水５ｍｌ’に懸濁し、撹拌・静置後、その上
清をスクリーニング用ＣＭＣ含有寒天培地（培地１）に
塗布し、３０℃で２〜７日培養後、ハローを形成したコ
ロニーを選出し、ＣＭＣアーゼ生産菌を取得した。取得
菌は、肉眼的及び顕微鏡的に単一になるまでＳＣＩを繰
り返し、純粋な分離菌を得ることが臼来た。更に得られ
た菌を液体培地（培地２）に接種し、３０℃、３日間振
とう培養した。培養後遠心分離した上浦液に、１％ＥＳ
、サビナーゼ（ノボ社製）をＩＡＵ／ｒｄとなるように
添加し、４０ｔにて保存し、ｐＨ９におけるＣＭＣアー
ゼ活性の残存活性を測定し、プロテアーゼ耐性セルラー
ゼ住産菌を選択した。

上記の方法により、アスペルギルス　ニガーＫＳＭ−２
４（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１３２７）を取得することが出来
た。

実施例２ 実施例で得たアスペルギルス　ニガー　ＫＳＭ−２４株
を、ＣＭＣに代え３％フスマ、ポリペプトンに代え０．
５％硝酸を配合した実施例１の液体培地２に接種し、３
０ｔ’、３日間、通気量０．５ｖｖｍ。

撹拌数２０Ｏｒｐｍで３０β発酵槽により培養した。培
養後、フィルタープレスにより菌体及び不溶物を除き、
粗酵素液を得た。この粗酵素液１５Ｉ！を限外濾過（旭
化成社製９分画分子量１．３万）により濃縮、脱塩を行
い、ＩＪ２の粗酵素液を得た。さらに、凍結乾燥を行い
、乾燥粉体としてプロテアーゼ耐性酵素（比活性＄１１
０単位／ｇ）１７．２ｇを得た。

＊酵素活性はｐＨ９における測定値である。

実施例３及び比較例１ 実施例２で得られた粗酵素液を１ｏ％ＥＳ、サビナーゼ
ＩＡＵ／ｒｄ、と共存させ、４０℃、２週間後の残存活
性を測定した。その結果、６３％の活性を有していた。

また、市販のセルラーゼ（ＩＣＮバイオケミカルズ社製
、アスペルギルス　ニガー由来）についても上記と同様
に試験したところ、残存活性は５％であった。

実施例４ 実施例２で得られた乾燥粉体１ｇを１０ｒｎｌの５゜ｒ
ｎＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）に溶
解し、以下の手順により精製を行った。

（１）　　酵素溶解液にサビナーゼを０．５ＡＵ／ｒｄ
となるよう添加し、４０℃で２４時間処理し、プロテア
ーゼ耐性セルラーゼ以外の夾雑タンパク質を分解した。

（２）プロテアーゼ処理液を限外濾過（アミコン社製１
分画分子量１万）により、ｐＨ６リン酸緩衝液に交換し
た。

（３）　　上Ｍ８液をＴｓＫ−ＤＥＡＥ３ＳＷカ５ム（
東ソー社製）（５０ｒｎＭ、ｐＨ６リン酸緩衝液で平衡
化したもの）に吸着させ、ＮａＣβ濃度を０〜０．３Ｍ
まで直線的に増加させて溶出した。

（４）　　（３）の活性画分を限外濾過により濃縮し、
ｐＨ９グリシン緩衝液に交換する。

（５）　　（４）をＴＳＫ−ＤＥＡＥ５ＰＷカラム（東
’／−社製）（５０ｍＭ、ｐＨ９グリシン緩衝液で平衡
化したもの）に吸着させ、Ｎａ（、ｊ’濃度を０−０．
５Ｍまで直線的に増加させて溶出した。

（６）　　（５）ノ活性画分をＴ　Ｓ　Ｋ−Ｇ２０００
３ＳＷカーフＡ（東ソー社製）のゲル濾過クロマトグラ
フィーにより分子量分画を行い、分子量約６万の位置に
プロテアーゼ耐性セルラーゼを溶出した。

（７）　　（６）で得られた両分を、ファストシステム
（ファルマシア社製）を用いてポリアクリルアミドゲル
電気泳動後、コマシー・ブリリアント・ブルー染色法及
び銀染色を行い、単一バンドであることを確認した。

実施例５ 実施例４で得られた酵素について、ファストシステムを
用い、ＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。その結果、プロテアーゼ耐性セルラーゼは、分子量
が約５２．０００であることが示された（図５）。

実施例６ 茨城県鹿島郡波崎町周辺の採取土壌約１ｇを１％ＮａＣ
１含有滅菌水５−に懸濁し、攪拌・静置後、その上清を
スクリーニング用ＣＭＣ含有寒天培地（培地１）に塗布
して３０℃で２〜７日培養後、ハローを形成したコロニ
ーを選出し、ＣＭＣアーゼ生産菌を取得した。取得菌は
、肉眼的及び顕微鏡的に単一になるまでＳＣＩを繰り返
し、純粋な分離菌を得ることが出来た。更に得られた菌
を液体培地（培地２）に接種し、３０℃、３日間振とう
培養した。培養後遠心分離した上清液に、１％ポリオキ
シエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）
、サビナーゼ（ノボ社製）をＩＡＵ／ｍ１２となるよう
に添加し、４０℃にて保存し、ｐＨ９におけるＣＭＣア
ーゼ活性の残存活性を測定し、プロテアーゼ耐性セルラ
ーゼ生産菌を選択した。

上記の方法により、アスペルギルス　ニガーＫＳＭ−２
５（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１３２８）を取得することが出
来た。

実施例７ 実施例６で得たアスペルギルス　ニガーＫＳＭ−２５株
を、ＣＭＣに代え３％フスマ、ポリペプトンに代え０．
５％硝酸を配合した培地２に接種し、３０℃、３日間、
通気量０．５ｖｖｍ、攪拌数２００’ｒｐｍで３０ｊ２
発酵槽により培養した。培養後、フィルタープレスによ
り菌体及び不溶物を除き、粗酵素液を得た。この粗酵素
液１５βを限外濾過（旭化成社製１分画分子量１．３万
）により濃縮、脱塩を行い１１の粗酵素液を得た。更に
、凍結乾燥を行い、乾燥粉体としてプロテアーゼ耐性酵
素（比活性１０５単位／ｇ）１８．６ｇを得た。尚、酵
素活性はＰＨ９における測定値である。

実施例８ 実施例７で得られた粗酵素液を１０％ＥＳ、サビナーゼ
ＩＡＵ／ｒｎ１．と共存させ、４０℃、２週間後の残存
活性を測定した。その結果、６３％の活性を有していた
。

実施例９ 土壌からの分離菌及び微生物の保存機関より入手した菌
を液体培地（培地２）に接種し、３０℃、３日間振とう
培養した。培養後、遠心分離した上清液に、１％ＥＳ、
０．２％サビナーゼ（ノボ社製）となるように添加し、
４０℃にて保存し、ｐｈ９におけるＣＭＣアーゼ活性の
残存活性を測定し、プロテアーゼ耐性セルラーゼ生産菌
をスクリーニングした。

上記の方法により、財団法人発酵研究所より入手シタア
スペルギルス　ニガ−Ｉ　Ｆ　Ｏ−３１１２０−３１１
２５（Ａｓｐｅｒ　ｎｉｇｅｒ　ＩＦＯ−３１１２５）
が、本発明のプロテアーゼ耐性セルラーゼを生産するこ
とを確認した。

実施例１０ 実施例９で得たアスペルギルス　ニガーＩ　Ｆ　０−３
１１２５株を、ＣＭＣに代え３％フスマ、ポリペプトン
に代え０．５％硝酸を配合した培地２に接種し、３０℃
、３日間、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌数２０　Ｏｒｐｍ
で３０！！発酵槽により培養した。培養後、フィルター
プレスにより、菌体及び不溶物を除き、粗酵素液を得た
。この粗酵素液１Ｍを限外濾過（旭化成社製１分画分子
量１，３万）により濃縮、脱塩を行い１βの粗酵素液を
得た。更に、凍結乾燥を行い、乾燥粉末としてプロテア
ーゼ耐性酵素（比活性５００単位／ｇ）２．１ｇを得た
。

実施例１１ 実施例１０で得られた粗酵素液を１０％ＥＳ。

１　Ａｌｌ／−サビナーゼと共存させ、４０℃、２週間
後の残存活性を測定した。その結果、５５％の活性を有
していた。

実施例１２ 実施例１０により得られた乾燥粉体１ｇを１０−の５０
ｍＭグリシン−水酸化す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ９）
に溶解し以下の手順により精製を行った。

（１）酵素溶解液にサビナーゼを０．５ＡＵ／ｍ１２と
なるよう添加し、４０℃で２４時間処理し、プロテアー
ゼ耐性セルラーゼ以外の夾雑タンパク質を分解する。

（２）プロテアーゼ処理液を限外濾過（アミコン社製９
分画分子量１万）により、ｐＨ６！Ｊン酸緩衝液に交換
する。

（３）上記液をＴＳＫ−ＤＥＡＥ３ＳＷ　　カラム（東
ソー社製＞　　（５０ｍＭ、　ｐＨ６リン酸緩衝液で平
衡化したもの）に吸着させ、ＮａＣｌ１濃度を０〜０．
３Ｍまで直線的に増加させて溶出した。

（４）　　（３）の９８〜１１０のフラクションを限外
濾過により濃縮、ｐＨ９グリシン緩衝液に交換した。

（５）　　（４）をＴＳＫ−ＤＥＡＥ５ＰＷ　（東ソー
社製）（５０，ｍＭ、　ｐＨ９グリシン緩衝液で平衡化
したもの）に吸着させ、ＮａＣｌ！濃度を０〜０．５Ｍ
まで直線的に増加させて溶出した。

（６）　　（５）の３０〜３６フラクシヨンをＴＳＫ−
Ｇ２０００３ＳＷ（東ソー社製）のゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより分子量分画を行い、分子量約４万の位置
にプロテアーゼ耐性セルラーゼを溶出した。

（７）　　（６）で得られた両分を、ファストシステム
（ファルマシア社製）を用いてポリアクリルアミドゲル
電気泳動法、コマシー・ブＩＪ　＋Ｊアント・ブルー染
色法及び銀染色を行い、単一バンドであることを確認し
た。

実施例１３ 実施例１２で得られた酵素についてファストシステムを
用いて、ＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電算泳動を行
った。その結果、プロテアーゼ耐性セルラーゼは、分子
量が約４２．０００であることが示された。

〔発明の効果〕

本発明のプロテアーゼ耐性セルラーゼは、長期にわたっ
てプロテアーゼが共存してもその酵素活性が低下しない
。さらに、本発明のプロテアーゼ耐性セルラーゼは、界
面活性剤等の洗浄配合成分に対し極めて強い耐性を有し
ており、キレート剤によってもほとんど阻害を受けない
。

また、ｐＨ６に至適ｐＨを有しているが、ｐＨ７，０〜
９．０のアルカリ側でも、活性の発現が見られる。さら
に、温度、ｐＨ共に広範囲で補的で安定である。したが
って、本酵素は、例えば液体洗浄剤組成物の配合成分と
して有利に使用することができるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のプロテアーゼ耐性セルラーゼの酵素
反応ｐＨと相対活性の関係を示す図面である。 第２図は、同酵素の処理ｐＨと相対活性の関係を示す図
面である。 第３図は、同酵素の反応温度と相対活性の関係を示す図
面である。 第４図は、同酵素の処理温度と相対活性の関係を示す図
面である。 第５図は、同酵素のＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電
気泳動の結果を示す図面である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プロテアーゼに対して強い耐性を有するセルラーゼ
   。 ２、プロテアーゼ１ＡＵ／ｍｌとともに４０℃で保存し
   た場合、２週間後でも５０％以上の残存活性を有する請
   求項１記載のプロテアーゼ耐性セルラーゼ。 ３、次の物理化学的性質を有する請求項１又は２記載の
   プロテアーゼ耐性セルラーゼ。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に よく作用し、これらを溶解せしめ、還元糖を生成する。 （２）基質特異性 ＣＭＣの他、リン酸膨潤セルロース及びア ミロースに対しても若干の活性を有する。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は３〜１０であり、至適ｐＨ は６である。 （４）ｐＨ安定性 ３０℃で１時間保持した場合、ｐＨ３〜 １１の範囲で失活しない。 （５）作用温度及び至適温度 作用温度は２０〜８５℃の広範囲にわたり、その至適温
   度は７０℃である。 （６）温度安定性 ６０℃で１０分間保持した後もほとんど失 活しない。また、７５℃で１０分間保持した後も５０％
   以上の残存活性を有する。 ４、さらに次の物理化学的性質を有する請求項３記載の
   プロテアーゼ耐性セルラーゼ。 （１）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ及びＳＴＰＰ により活性を阻害されない。 （２）金属イオンの影響 Ｃｕ＾２＾＋、Ｓｎ＾２＾＋及びＨｇ＾２＾＋により活
   性を阻害される。 （３）分子量 約６万（ゲル濾過法による） （４）糖含量 フェノール硫酸法により、８％以上である。 （５）界面活性剤耐性 線状アルキルベンゼンスルホン酸（ＬＡＳ）、アルキル
   スルホン酸ナトリウム（ＳＡＳ）、アルキル硫酸エステ
   ルナトリウム塩（ＡＳ）又はポリオキシエチレンアルキ
   ル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）の１０％水溶液と
   共に４０℃で保存した場合、２週間後でも５０％以上の
   残存活性を有する。 ５、アスペルギルスニガー（￥Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
   ｎｉｇｅｒ￥）ＫＳＭ−２４と命名され、微工研菌寄第
   １１３２７号として寄託されたプロテアーゼ耐性セルラ
   ーゼ生産菌。 ６、アスペルギルス属に属するプロテアーゼ耐性セルラ
   ーゼ生産菌を培養し、その培養物よりプロテアーゼ耐性
   セルラーゼを採取することを特徴とするプロテアーゼ耐
   性セルラーゼの製造法。