JPS63146797A - 抗生物質クロロポリスポリンｃの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 本発明はりｃ２ＣＩポリスポリンＣの製法に関する。

クロロポリスポリンＣは抗菌作用を有する新規なグリコ
ペプチド系抗生物質である。

本発明者らはクロロポリスポリンＣの製法について種々
検討した結果、同じグリコペプチド系抗生物質であるク
ロロポリスポリンＢをラムノシダーゼで加水分解するこ
とによってりｏ　ｏ　ｆリスポリンＣが得られることと
見出して本発明を完成した。

〔発明の構成〕

本発明の原料化合物であるクロロポリスポリンＢおよび
目的化合物であるクロロポリスポリンＣは下記の式を有
する。

但し、式中、クロロポリスポリンＢはＲ１がリストサミ
ンを示し、Ｒ２がマンノースを示し、Ｒ３がグルコース
を示し、Ｒ４がラムノースｔ　示ｆ。クロ；ノリスポリ
ンＣｔｄＲ１がリストサミンを示し、Ｒ２カマンノース
を示し、Ｒ３がグルコースを示し、Ｒ４が水素原子を示
す。

本発明はクロロポリスポリンＢをラムノシダーゼで加水
分解してクロロポリスポリンＣを製造することからなる
。

本反応は酵素反応であシ、本反応も一般の酵素反応と同
様に温度、時間等の影響を大きく受ける。

本反応はクロロポリスポリンＢを溶剤の存在下で２０〜
４０℃、好ましくは３７℃でラムノシダーゼ酵素標品を
刃口え、静置または攪拌下で加水分解することによって
達成される。使用されるラムノシダーゼ酵素標品として
は、ラムノシダーゼ活性を有するものであれば特に限定
はなく、例えばナリンギナーゼ、スクラーゼ（三共（夾
裂品）またはクミタナーゼ（田辺製薬（株）製品）等の
酵素標品をあげることができる。

また、本反応の反応条件下で用いられる溶剤としては、
ｐＨ５〜８の範囲で０．１〜０．ＯＩＭの燐酸緩衝液、
またはトリス塩酸緩衝液等が可能である・また、均一な
水溶液中での反応と同様に、ナリンギナーゼの生産菌で
あるアスペルギルス・ウサミやスクラーゼ生産菌である
アスペルギルス・ニガーなどの菌体の固定化や酵素自身
の固定化によっても反応が進行することは基本的には同
様である。

生成するクロロポリスポリンＣは吸着丈脂、例えばダイ
ヤイオンＨＰ２０（三菱化成工業（火製〕、アンバーラ
イトＸＡＤ　−２またはＸＡＤ−４（ローム・アンド・
ハース社製）に吸着させたのち、含水アセトンあるいは
含水メタノール等で溶出し精製することができる。また
、ポリアミド（ウェルム社裂、西ドイツ）に吸着させた
のち、全く同様に含水アセトンや含水メタノールを用い
て溶出し精製することも効果的な方法の一つである。各
精製工程を含め試料中の出発物質ならびに反応生成物の
監視にはＴＬＣやＨＰＬＣが有利である。

更にグリコにプチド系抗生物質の精製には逆相クロ７ト
グラフイーも有効に利用される手段の一つである。例え
ば均一な粒子サイズのシラン化シリカゲル、好ましくは
０．０６〜０．２団の粒径分布を示すものがよく、また
、溶離剤としてはギ酸アンモニウム水とアセトニトリル
、トリフルオロ酢酸とアセトニトリルまたはリン酸緩衝
液とアセトニトリルの混合液が適宜用いられる。より好
ましい溶離液としては０．２％トリフルオロ酢酸とアセ
トニトリルの混合比が８５：１５があげられる。

次に、本発明の原料化合物であるクロロポリスポリンＢ
および目的化合物であるクロロポリス２リンＣＫついて
更に詳細に述べる。

クロロポリスポリンＢおよびＣは下記のような理化学的
および生物学的性状を有する。

１、　クロロポリスポリンＢ　硫酸塩 １）物質の性状：両性水溶性、白色粉末２）　　比に光
ｇ　：　ＣｃｔＪｉ５−６４．５″’　（Ｃ、１，０４
、０，Ｉ　Ｎ塩酸溶液） ３）元素分析値（％）　：　Ｃ、４８，３３：　　Ｈ，
５，０５：Ｎ、５．４８；　　Ｃ４，５，１１；　　Ｓ
、１．００；４）酸加水分解： 中性Ｆ’；グルコース、マンノース、ラムノースアミノ
酸；３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｎ
−メチル−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン ５）紫外線吸収スペクトル：λｍａ　ｘ　ｎｍ　（Ｅ　
を二）第１図に示す通Ｂ　ｏ、　Ｉ　Ｎ塩酸溶液では２
８０　ｎｍ（Ｅに５１）に径大吸収を示す。

６）赤外線吸収スペクトルニジ”’ｍ−１ａｘ ＫＢｒｆイスクで測定した赤外線吸収スペクトルは第２
図に示す通りである。

７〕　核磁気共鳴吸収スＲクトル＝（δ：　ｐ　ｐｍ）
ジメチルスルホキシド中、内部基準にＴＭＳ　（テトラ
メチルシラン）を使用して測定したスペクトル（２７０
ＭＨｚ　）は第３図に示す通っである。

８）溶解性： 水、メタノールに可溶、アでトンに難溶、酢酸エチル、
クロロホルム、ベンゼンに不溶。

９）　　Ｗ色反応、ニンヒドリン、ライドンスミス反応
に陽性。

１００薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ値０．６５吸着剤
；イーストマンセルロースシート展開溶媒；ｎ−プタノ
ール：ピリソン：酢酸：水（１５：１０：３：１２） １１）高圧７紙電気泳動： ０、　Ｉ　Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）中で東
洋戸紙ノＦＥｃ　５１　Ａを用いた高圧７紙電気泳動（
３３００ｖｏｌｔ／６０α、１時間）ておいて、原点よ
シ陰り側への郡動距離は４ｃｒｎであった。なお、移動
距離はバチルス・スフチリスＰＣＩ　２１９を被検猜と
して、バイオオートグラムにより求めた。

１２）分子式 ％式％ ＦＡＢ−走による実測の結果、１８４６（ＮＩＨ＋１８
４７）であった。

１４ン抗菌カニ 一般ダラム陽性、ダラム陰性細菌に対するクロロポリス
ポリンＢの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）はミュラー・ヒ
ストン寒天培地（ディフコ社製）、嫌気性菌に対しては
ＣＡＭ寒天培地（田水製薬（株）裂）を用いた寒天培地
稀釈法によって測定した。

その結果は第１表および第２表に示す通りである。

１５）毒性： ？　ウス（ＩＣＲ１雄、５週令）に対するＬＤ５゜（ｉ
、ｖ、）は２１５　ｍ９／ｋｇであった。

２、　クロロポリスｄリンＣ硫酸塩 １）物質の性状二側性水溶性、白色粉末２）比旋光度：
〔α）ｏ、　　−６４，４°　（Ｃ，１，０８゜０、Ｉ
Ｎ塩酸溶ｔｉ、） ３）元素分析値（％１ｃ１５０．５３；　　Ｉ（，４，
６９；Ｎ、６．１４；　　Ｃ１，５，６２：　　Ｓ、１
．１２；４）酸加水分解： 中性ｓ；グルコース、マンノース アミノ酸；３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルグリシ
ン、Ｎ−メチル−ｐ−ヒトるキシフェニルグリシン ５）紫外線吸収スペクトル：λｍａＸｎｍ（Ｅに）第４
図に示す通フ０．ＩＮ塩酸溶夜では２８０ｎｍ（Ｅに５
７）に毬大吸収を示す。

６）赤外線吸収スペクトルニジＫＢ’　（ｍ−１ａｘ ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スにクトルは第５
図に示す通９である。

７〕　核磁気共鳴吸収ス被りトル：（δ：ｐｐｍ）ジメ
チルスルホキシド中、内部基準にＴＭＳ　（テトラメチ
ルシラン）を使用して測定したスペクトル（４００二Ｖ
ＩＨｚ　）は第６図に示子通っである。

８）溶解性： 水、メタノールに可溶、アセトンにＢ溶、酢酸ニチル、
クロロホルム、ベンゼンに不溶。

９）　　Ｍ色反応：ニンヒドリン、ライドンスミス反応
に陽性。

１０）薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ値　０．６５吸Ｍ
　剤：　イーストマンセルロースシート展開溶媒；ｎ−
ブタノール：ピリソン：酢酸：水　（１５二　ｌｏ：３
：１２） １１）分子式 ％式％ ＦＡＢ−兇による実測の結果、１７００　（ＭＨ＋１７
０１　）であった。

１３）抗菌カニ 一般ダラム１湯性、ダラム陰性細菌に対するクロロ−リ
スボリンＣの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）ｒ／′ｉミエ
ラー・ヒストン寒天培地（ディフコ社製）、嫌気性菌に
対してはＣＡＭ寒天培地（田水製薬（抹）製）を用いた
寒天培地稀釈法によって」１ｊ定した。その結果は第１
辰および第２表に示す通フである。

１４）毒性： マウス（ＩＣＲ，雄、５週令）に対するＬＤ５゜（ｉ、
ｖ、）は２５０　ｍｑ　／に！ｉ＋であったっ第　１　
辰 スポリンＢ　スポリンＣ スタフィロコッカス・アラ功スＦＤＡ２０９Ｐ　　ＪＣ
−１１，５６１，５６スタフイロコノカス・アウレウス
　５ＡＮＫ　７０１７５　　　３．１３　　　１．５６
スタフイロコツカス・アウレウス　スミス　　　　　　
１２．５　　　　６．２５スタフイロコツカス・エビデ
ルミゾイス　　　　　　　　３．１３　　　３．１３Ｓ
、ｕ’ＪＫ７１５７５ エンテロコツカス・フェカリス　５ＡＮＫ　７１７７８
　　　１．５６　　　１．５６バチ、１１．、、ｔ、・
スブチリスＰＣＩ　２１９　　　　　　　　　　０．７
８　　　０．’７８ミ；／ぐクテリウム・スメグマチヌ
　ＡＴＣＣ６０７２５１２，５エノシエリヒ７−　＝＋
ｌＪ　−ＮＩＨＪ　　ＪＣ−２）ｌ　ＯＯ）１００りＶ
７”／工５　’　＝　ユ’）モニニＰＣＩ　６０２　　
　　　　　）１００　　　）１００シ−−ドモナス−ニ
ルギノ−ｆＮｃＴｃ１０４９０　　　　）１００　　　
）１００セラチア・マルセノセンス　５ＡＮＫ　７３０
６０　　　　　）１００　　　）１００プロテウス・ミ
ラビリス５−Ａ＝ＮＫ　７０４６１　　　　　　＞１０
０　　　〉１００第　　２　　表 ポリンＢ　　　ポリンＣ バクテロイデス・フラノリス　　　　　　　　　　　）
１００　　　　）１００ユウパクテリウム・シリンドロ
イデス　　　　　　　　　６．２５　　　　３．１３フ
ンバクテリウム・ネクロホラム　　　　　　　　　）１
００　　　　）１００ｑシ ペプトス中セブ印コツカス・サツカロリティカス　　　
６，２５　　　　３゜１３ヘフトストレクトコツカス・
・ぐ−ブルス　　　　　　　０．７８　　　　０．３９
プロピオニバクテリウム・アクネス　　　　　　　　　
０．７８　　　　０．３９クロストリデイウム・シンビ
オ−サム　　　　　　　　１，５６　　　　０．３９ク
ロストリデイウム・ラモーサム　　　　　　　　　　１
．５６　　　　１．５６クロストリデイウム・パーツリ
ンダンス　　　　　　　０．２０　　　　０．１０クロ
ストリデイウム・デイロイシル　　　　　　　　　０．
７８　　　　０．３９以上から、クロロポリスポリンＢ
およびＣはスタフィロコッカス・アウレウス、スタフィ
ロコッカスｅエビデルミゾイス、エンチーコノカス・フ
ェカリス、バチルス・ズブチリス、ミコツククチ１）ラ
ム・スメグマチス等のグラム陽性細菌及びユウバクテリ
ウム・シリンドロイデス、ペプト＃≠ダホキコッカスタ
閂ツカロリテイカス、かビオニパクテリウム・アクネス
、クロストリディウム・シンビオ−サム、クロストリデ
ィウム・ノ！−フリンダンス、クロストリディウム・デ
イロイシル等の嫌気性のグラム陽性細菌に有効である。

りｏロポリスポリンＢおよびＣは栃木系で採取した土壌
から分離したミクロポリスポラ属に属するＳ　ＡＮＫ　
６０９８３株から生産される。

クロロポリスポリンＢおよびＣを生産する５ＡＮＫ　６
０９８３株の菌学的性状は次の通りである。

５ＡＮＫ６０９８３株の同定にあたってはＩＳＰ　［イ
ンターナショナル・ストレプトミセス・プロジェクト（
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　）　〕規定の培地およびワックス
マン（Ｓ、Ａ、Ｗａｋｓｍａｎ　）の勧告〔）・アクチ
ノミセイテス（Ｔｈｅ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）
、２巻〕の培地等を用いて培養した。培養は通常２８℃
で行った。

１）形態学的特徴 ５ＡＮＫ　６０９８３株は各種培地上で比較的良好な生
育を示す。気菌糸は肉眼上はとんどの培地で認められな
いが、グリセロール・アスパラギン寒天培地やポテトエ
キス・人参エキス寒天培地上では着生する場合もある。

気菌糸および栄養菌糸の先端あるいは中程に胞子の連鎖
が観察され、その数は１〜２０個、時には２０個以上の
場合もある。菌糸の明瞭な断裂は認められないが、培養
後期に断裂が認められる場合もある。

２）各種培養基上の諸性状 ５ＡＮＫ　６０９８３株ばうす黄〜黄茶〜黄味灰に生育
する。はとんどの培地上には気菌糸が認められないが、
一部の培地には白の気菌糸が着生する。可溶性色素の産
生は認められない。第３表に主な培地上での培養性状を
示す。

色調の表示は日本色彩研究新版１１色票”のカラーチッ
プナンバーを表わす。

第３表　　各種培地上の培養性状 （２８℃、１４日間培養） Ｇ：生育、　ＡＭ：気菌糸、　Ｒ：裏面、ｓｐ：可溶性
色素３）生理学的性質 ＳＡＬ’ＪＫ　６０９８３株の生理学的諸性質を第４表
に示す。

第４表　　　生理学的１１モ質 分解　　　アデニ／　　　　　　　− カゼイン　　　　　　　＋ キサンチン　　　　　　− ヒポキサ／チン　　　　＋ 尿　　素　　　　　　　　　　　　　十澱粉の加水分解
　　　　　　　　　士 ゼラチンの液化　　　　　　　　　　十ミルクの凝固８
　　　　　　　　　− ミルクのペプトン化８　　　　　　− 硝酸塩還元　　　　　　　　　　　＋ ＤＮａ　ｓ　ｅ　　　　　　　　　　　　　　−’。

メラノイド様色素産生　ＩＳＰ　１　　　　　−ＩＳＰ
６　　　　　　　　− ＩＳＰ７　　　　　　　　− コハク酸ナトリウム　　　− クエン酸ナトリウム　　− ピルビン酸ナトリウム　　　− 酒石酸ナトリウム　　　　− Ｄ−グルコース　　　　　＋ Ｌ−アラビノース　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　÷ イノシトール　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　＋ Ｄ−フルクトース　　　　＋ Ｌ−ラムノース　　　　　＋ シュクロース　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　＋ イノシトール　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　　　＋ Ｄ−フルクトース　　　　　　＋ Ｌ−ラムノース　　　　　　　＋ シュクロース　　　　　　　　÷ ラフィノース　　　　　　± ＮａＣ４＃を生　　　３ヂ　　　　　　　　＋５　チ　
　　　　　　　　　　　　＋ ７チ　　　　　　　　　　　　＝ １０　チ　　　　　　　　　　　　　　−生育温度範囲
　１０℃　　　　　　　　−２８＋ ３７　　　　　　　　　　　　　　　　　＋４）菌体内
成分について エム−ピー暑しジエバリヤー（Ｍ、Ｐ、Ｌｅｃｈｅｖａ
ｌｉｅｒ）らの方法〔エイ・ディーラ（Ａ、ＤｉｅｔＺ
　）　ラ著、放線菌の分類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
　ｔａｘｏｎｏｍｙ　）　、　２２５頁、１９８０年〕
に従い、菌体の酸加水分解物の４−・ぐ−クロマトグラ
フィーによる分析を行った結果、メンノアミノピメリン
酸およびアラビノース、ガラクトースが認められ、細胞
壁のタイプは■Ｗｆあることが確認された。また全菌体
塘塁はＡ塁であった。さらに白日らの方法〔ツヤ−ナル
・オプ・ノエネラル・アプライド・マイクロパイオロゾ
ー（Ｊ、　Ｇｅｎ　、　Ａｐｐｌ　、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ　、　）、２３巻、２４９頁、１９７７年〕に従い細
胞壁のアシル基を調べたところアセチル基型であった。

ところで、現在知られている放線菌の中で、胞子を菌糸
の中間に形成す・るような属は報告されていない。そし
て、他の諸性質から類縁する属を検索するとアクチノポ
リスポラ（Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、サッ
カｏｆリスポラ（Ｓ、ａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒ
ａ）　、１、シュードノカルソア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃ
ａｒｄｉａ）属、ミクロポリスポラ（Ｍｉｃｒｏｐｏｌ
ｙｓｐｏｒａ）属等があげられる。

しかし、アクチノポリスポラ属およびサンカロポリスデ
ラ属は、側屈とも気菌糸の先端にのみ胞子を着生するこ
との他、前者が高度好塩性属であること、後者がグリコ
リル基型のアシル基を有すること等から５ＡＮＫ６０９
８３株とは属を異にする。でた、シュートノカルノア属
は本株と同様、気菌糸および栄養菌糸に胞子を着生する
が、その位置は菌糸の先端のみであること、また出芽法
による胞子の発芽が認められること等によＪ　５ＡＮＫ
　６０９８３株と属を異にするものと考えられる。ミク
ロプリスポラ属と本５ＡＮＫ　６０９８３株の相異は、
胞子の着生位置が前者が菌糸の先端のみに形成するのに
対し、後者が先端および中間に形成する点のみでちる。

胞子の着生位置が菌糸の先端、中間のいずれかによるこ
とが分類学的にどのような意味を持つかについては未だ
学界でも議論されたことがほとんどない現在、この差の
みをもって属を分けることは適当でない。

従って、本発明者らは５ＡＮＫ　６０９８３株全ミクロ
ポリスポラ属の一新種とするのが最も妥尚であると考え
、ミクロポリスポラ　エスピー・（Ｍｉｃｒｏ−ｐｏｌ
ｙｓｐｏｒａ　３ｐ、　）　５ＡＮＫ　６０９８３　（
做工研条寄第５３８号；　ＦＥＲＭ　ＢＰ−５３８）と
命名した。

以上、クロロポリスポリンＢおよびＣの生産菌について
説明したが、放線菌の諸性質は一定したものでなく、自
然的、人工的江容易′Ｆ−に化することは周知の通シで
あり、本発明で使用しうる菌株はミクロポリスポラ属に
属する、クロロポリスポリンＢおよびＣを生産するすべ
ての菌株を包含するものである。

本発明における培養は一般放線菌における培！方法に準
じて行われ、液体培地中での振盪培養あるいは通気攪拌
培養によるのが好ましい。培地成分としては、たとえば
炭素源としてブドウ糖、マルトース、シニクロース、マ
ンニット、糖蜜、クリセリン、デキストリン、澱粉、大
豆油、綿実油などが、窒素源として大豆粉、落花生粉、
綿実粉、ファーマミン、魚ｓ、コーン・スチープ・リカ
ー、ペプトン、肉エキス、イースト、イースト・エキス
、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムな
どが、また、無機塩として食塩、燐酸塩、炭酸カルシウ
ム、微量金属塩などが必要に応じて適宜添加される。液
体培養に際してはシリコン油、頂物油、界面活性剤等が
消泡剤として適宜使用さ几る。

培地のＰＨは中性附近、培養温度は２４℃から３０℃、
特に２８℃前後が好ましく・。培養の経過に伴って生産
されるクロロポリスポリンＢおよびＣの力価の経時的変
化は、バチルス・ズブチリスＰＣ工２１９及ヒスタフィ
ロコッヵス・アウレウスＦＤＡ　２０９Ｐ　ＪＣ−１を
被検菌としたペーパーディスク（東洋科学産業（株）製
、直径８＋＋ｌｆｆ１、Ｔｈ１ｃｋ　）検定法によフ測
定される。通常５５〜７０時間の培蓋でクロコポリスポ
リンＢおよびＣの生産量は最高値に達する。主として培
養液中の液体部分に存在するクロロポリスポリンＢおよ
びＣは、培養終了後、菌体その他の固型部分をけいそう
土等を濾過助剤とする濾過操作、あるいは遠心分離によ
って除去し、その７液あるいは上清中から抽出・精製す
ることによって得られる。

クロロポリスポリンＢおよびＣはその物理化学的性状を
利用することＫよシ、たとえば吸着剤を用いて採取する
ことができる。吸着剤としてはたとえば、活性炭、ある
いは吸着用樹脂であるアンハーラ（トＸＡＤ−２，ＸＡ
Ｄ−４、ＸＡＤ−７等（ｏ−ムーアンド・ハース社製）
やダイヤイオンＦ（ＰＩＯ。

ａｐ２ｏ　、　ＣＨＦ２（ＩＰ　、　ｕｐ５ｏ　（三菱
化成工業０株）製）。

、ｄ　ＩＪアミドゝグル（ウェルム社製）等が使用され
、クロロポリスポリンＢおよびＣを含む液を上記の如き
吸着剤の層を通過させてクロロポリスポリンＢおよびＣ
を含む液に含でれる不純物を吸着させて取りのぞくか、
またはクロロポリスピリンＢおよびＣを吸着させた後、
メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタノール水などを用
いて溶出させることによって得られる。

このようにして得られたりａロポリスポリンＢセファデ
ックスＬＩ（−２０（ファルマシア社！りなどを用いた
分配カラムクロマトグラフィー；逆相用担体を用いた逆
相カラムクロマトグラフィー；ま７’、−ハクロロボリ
スポリンＢおよびＣと混在する不純物との溶媒に対する
分装率の差を利用した抽出法；あるいは向流分配法など
が有効な方法といえるっ以上の分離・精製手段を単独あ
るいは適宜組み合せ、反復用いることによりクロロポリ
スボリアＢおよびＣを分離・精製することができる。ク
ロロポリスポリンＢおよびＣは、また一般の脂溶性抗生
物質と同じく、培養条件によっては培養液中の菌体部分
に存在する。この場合は、アルコール類、アセトン等の
親水性有機溶媒によって抽出し、抽出液よシ溶媒を除去
し、次いで水溶液とした後、培養７液からと同様の方法
で抽出精製することができる。

〔発明の効果〕

次に実施例および参考例をあげて本発明を更に詳細て胱
明する。

実施例１ １０．５ｇのクロロ−リスゾリンＢをｐＨ５，８の０、
０６　Ｍ燐酸緩衝液２１に溶解し、ナリンギナーゼ（三
共（創製）３．８５１を加えて３７℃で２１時間反応さ
せた。ＨＰＬＣで出発物質のクロロポリスポリンＢが消
失する迄反応を継続した。反応終了後、ダイヤイオンＥ
（Ｐ２Ｏ（三菱化成工業（創製）３７０ｍＩＯカラム：
Ｃ反応混合物を通し、水洗後５０チアセトン水７００ｍ
ｅで溶出した。溶出液より減圧下でアセトンを留去後、
凍結乾燥すると、粗生成物７．８ｇが得られた。更に細
枠なりロロボリスボリンＣを得るために次の操作を行っ
た。すなわち上記粗生成物７．８ｇを５０％メタノール
３０ｍ１に溶解し、トヨ・や−ルＨＷ−４０Ｆ　（３Ｘ
　５０α）のカラムにかけ同溶媒系で展開溶出した。各
２０罰の両分を集め、ＨＰＬＣにて監視した。反応物で
あるクロロポリスポリンＣを含有する分画を集め、メタ
ノールを減圧下で留去後、塩酸でｐＨ４，０とし、凍結
乾燥を行うと、クロロポリスポリンＣ１塩酸＋４５．６
７；！　カ得られた。

実施例２ クロロポリスボリアＢＩＯｍ９をｐＨ５，８の０．１　
Ｍ燐酸緩衝ａ　５　ｍＪに溶解し、スクラーゼ（三共（
創製）２００ｍ９を加えて室温で約２４時間反応させた
。反応終了後、ダイヤイオンＥ（Ｐ２Ｏ（三菱化成工業
（株）製）５ｍｇＱカラムに反応混合物を吸着させ、水
洗し５０％アセトン水で溶出した。溶出液より活性分画
を臭め、減圧下で：！＃、縮後還結乾桑を行うと、粗生
成物５・７！りが得られた。粗生成物からの精製として
次の方法が有利に使用できた。すなわち、粗生成物８ｇ
をｐＨ３，０の水４０　ｍｇ　（稀塩酸にて）に溶解し
、ポリアミド（ウェルム社製、４　Ｘ　４０ｃｍｍ）の
カラムに吸着させ、水で展開し、２０ｍ１ずつ分画した
。Ｉ（ＰＬＣでクロロポリスポリンＣを含有する分画を
集め、減圧下で濃縮後、塩酸でＰＨ４、０とし凍結乾燥
することにより、クロロポリスボリンＣ塩酸塩４．６１
が得られた。

参考例１ ミクロポリスボラ・エスピー５ＡＮＫ　６０９８３　株
ｉ　Ａ培地８０ｍ１を含む５００ｍ１！容三角フラスコ
に一白金耳接種し、２２　Ｏｒｐｍの回転振盪培養機に
よシ２８℃で８４時間培養した。この培養ｔＬ２　Ｓ　
ｍｌをＢ培地５００ｍ１を含む２１容三角フラスコ４本
に接種し、２２　Ｏｒｐｍの回転振盪培養機により２８
℃で２４時間培養した。この培養ｆｉ７５０ｍｉを、ｎ
培１ｔ５１を含む３０１容ツヤ−ファーメンタ−２基に
接種し、２８℃、回転数１５０　ｒｐｍ／分、通気量１
５１／分で６９琴間通気攪拌培！した。

この培養液３０１に濾過助剤としてセライト５４５を加
えて濾過すると、Ｐ＠３０１が得られた。この７液をダ
イヤイオンＨＰ２０　Ｃ三菱化成工業（東製）３１に吸
着させ、水洗し５０％アセトン水で溶出し、得られた活
性分画より減圧下でアセトンを留去後、凍結乾燥すると
粗粉末４４．９が得られた。得られた粗粉末４１ｇを水
に溶解しダイヤイオンＨＰ２０　（三菱化成工業（犬製
）　１．８１に吸着させ水５１．次いで１０％アセトン
水２１で先、争後、５Ｑ％アセトン水４１で溶出した。

溶出液を減圧下で１１に濃縮し、５０００ｒｐｍで遠心
分離し、得られた沈澱を乾固するとクロロ−リスピリン
ＢおよびＣを含む粉末９．６ｇが得られた。得られた粉
末９．６ｇを５０チメタノール水１１に溶解し、あらか
じめ５０％メタノール水で調製した酸性アルミナ（ウェ
ルム社製）２００罰に吸着させ同一溶媒で溶出すると活
性分ｉ　１．１　ｌが得られた。得られた活性分画をＤ
ｏｗｅｘ　２１Ｋ　（ＯＨ−）　６０　ｍｌ！に通過さ
せ、更に得られた活性分画１．２１を減圧下で３０ｍ１
に濃、縮し凍結乾燥すると、粉末１．２３　ｐが得ちれ
た。得られた粉末１．２３　、ｐ　ｔ−ｐＨ４，０の塩
酸水に溶解し、水で充填したポリアミド（ウェルム社製
）５６９に？着させ、水４００ｍ１とメタノール１．２
ノを用いてグラノエント溶出によシ１分画２０ｍ１でフ
ラクション８０まで溶出した。次いで、フラクション３
０から６０までを集め、減圧下でメタノールを留去し、
次いで凍結乾燥するとクロロポリスポリンＢおよびＣを
含む白色粉末７３８ｍ９が得られた。

Ａ培地 グルコース　　　　　　　　３　％ キイースト　　、　　　　　　　　１　　％大豆粉　　
　　　　３　チ 炭酸カルシウム　　　　　　　０．４　　多硫酸マグネ
シウム　　　　　０．２　　％ニッサンＣＢ−４４２（
消泡剤）　　　　０．０１％（ｐＨ７，０） Ｂ培地 グルコース　　　　　　　　　５　％ イーストエキス　　　　　　　０．１　　子犬豆粉　　
　　　　１ｑ６ ポリペグトン　　　　　　　　　０．４　　’％牛肉エ
キス　　　　　　　　０．４　　係塩化ナトリウム　　
　　　　０．２５％炭酸カルシウム　　　　　　０．５
　　％二ノサンＣＢ−４４２（消泡剤）　　　０．０１
係（ｐＨ７，２） このようにして得られたクロロポリスポリンＢおよびＣ
を含む白色、粉、末４．４夕を８０ｍ１のアセトン ニトリル；緩衝１（０，２％へブタ−１ルボン酸ナトリ
ウム、２．５％酢酸及び０．５％濃アンモニア水を含む
）＝１５：８５よシなる混合溶媒に溶解し、システム５
００（ウォーターズ社製）のグレノグパノクＣ１８カー
トリッツに吸着させ、同混合溶媒系で１００〜１５０ｍ
Ｊ／分の流速で展開溶出するとクロロポリスポリンＢは
溶出液量８ｏｏｒｎｅから１７００ｍ１の間に、クロロ
ポリスポリンＣは溶出液量１７００ｍ１から４７００ｍ
ｌの間にそれぞれ溶出された。前者の活性分画を集めｐ
Ｈを７．ＯＫ調調整後圧圧下濃縮、アセトニトリルを留
去した。この濃ａｘ　８を、ダイヤイオンＨＰ２０　（
三菱化成工業（ａ）　Ｈ）のカラム（１０（ｌπ１１り
に吸着させ、水で洗浄後、７０％アセトン水５００ｍ１
！にて溶出した。溶出液を減圧下でａ縮し、凍結乾燥す
ることによ）、粉末としてクロロポリスポリンＢのへブ
タンスルホン酸塩を得た。この粉末２００ｍｇｒを５　
ｍｌの水に溶解し、１０多ドデシル硫酸ナトリウム水溶
液を滴下し、生ずる沈澱を３０００　ｒｐｍで１ｏ分間
遠心分離し回収した。更にこの沈澱を水に懸濁し、同傑
に遠心分離全行なって沈澱を洗浄した。との操作を更に
３回くシ返して、沈澱を洗浄後、３Ｍのメタノールに溶
解した。不溶物を濾過し、そのＰ液に０．５　Ｍ　トリ
ニチルアミン硫酸塩のメタノール溶液を滴下し。

生ずる沈澱を３０００ｒｐｍで１０分の遠心分離により
、回収した。この沈澱を新たに少量のメタノールに懸濁
し、同様の遠心分離によって沈澱を得た。

この操作を更に３回くりかえしたのち、得られた沈澱を
水１．５　ｍｉに溶解し、不溶物を除去後、凍結乾燥す
ることによジクロロポリスボリンＢ硫酸塩５５ｚりが得
られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はクロロポリスポリンＢの紫外線吸収スペクトル
を示し、第２図は１司物質の赤外線吸収スペクトルを示
し、第３図は同物質の核磁気共鳴スペクトルを示す。 第４図はクロロポリスポリンＣの紫外線吸収スペクトル
を示し、第５図は同物質の赤外線吸収スペクトルを示し
、第６図は同物質の核磁気共鳴スペクトルを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. クロロポリスポリンＢをラムノシダーゼで加水分解する
   ことを特徴とするクロロポリスポリンＣの製法。