JPS6231301B2 - - Google Patents

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JPS6231301B2
JPS6231301B2 JP53021701A JP2170178A JPS6231301B2 JP S6231301 B2 JPS6231301 B2 JP S6231301B2 JP 53021701 A JP53021701 A JP 53021701A JP 2170178 A JP2170178 A JP 2170178A JP S6231301 B2 JPS6231301 B2 JP S6231301B2
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JP
Japan
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rubella
rubella virus
human serum
insoluble
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Uiriamu Satsufuoodo Junia Jon
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Abbott Laboratories
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Abbott Laboratories
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/20—Rubella virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36211—Rubivirus, e.g. rubella virus
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は風疹ビールス抗原とその製法および該
抗原を利用する免疫化学測定用試薬に関する。本
発明の抗原は試験液体中の風疹抗体の迅速検出お
よび定量に有用な特殊免疫分析試薬開発に使用さ
れる。本発明の抗原および試薬は患者（例えば妊
姙年令の女性）の免疫学的状態確立に有用であり
また診断的計画上も価値あるものである。
試験液体中の風疹対抗抗体検出に普通用いる方
法は不溶性風疹ビールス粒子による幼児赤血球凝
集現象の抗体抑制作用に基づく。この方法の本質
的段階には（すべて凝集抑制作用を試験する前
に）非特定脂肪蛋白質抑制剤を除去するカオリン
による試験液体の吸収および液体中にあるクロス
―反応性抗体を除去する為の幼児赤血球による血
清吸収がある。この種の血球凝集抑制作用
（HAI）試験はかなり信頼出来るが上記の血清前
処理段階の為に時間がかかる。最終結果は試験液
採取後少なくも５―７時間たたぬと普通利用出来
ない。風疹に対する他の抗体検出法は例ればH.
M.メーヤーらのAm.J.Clin.Pathol.，57：803―
813（1972）にまとめて記載されている。
HAI試験に使われる不溶性血球凝集素とは別
に、溶解性風疹ビールス抗原を得る為従来試験が
なされている。その方法は２主要“溶解性”抗原
（シーターおよびアイオタという）の同定法を記
載しているがこれらの抗原を風疹に感染した細胞
培養から決定的に分離し特性づける試みは殆んど
成功せずまた風疹に対する抗体の検出および定量
に有効な抗原に増感された粒子の発育に有用な溶
解性抗原はこれ迄に分離されていない。
本発明によれば溶解性風疹ビールス抗原は風疹
ビールスに感染した組織培養細胞の成長を助ける
媒質から分離される。抗原は40000乃至60000ダル
トンの分子量をもち、50％飽和硫酸アンモニウム
に不溶性でありかつ免疫電気泳動においてβ易動
性を示す。
更に明確にいえば新規抗原は風疹ビールスに反
応性の人間血清によつて単一線沈澱を形成する
（血球凝集抑制試験によつて示されるとおり）特
徴をもつ。更にこの抗原は500乃至10000の特定風
疹抗原活性（S.R.A.A）をもつことを特徴とす
る。
精製抗原は親和力クロマトグラフ法；ゲル透過
クロマトグラフ法および相互逆受動性血球凝集
（RPHA）活性に基づく分離法を含む処理によつ
て単離される。
本発明の免疫学的試薬は安定化赤血球、ベント
ナイト、コロジウム、コレステロール結晶、石
英、合成樹脂類、種々の人造ラテツクス、および
燐脂質およびステリン類からつくつたリポサム類
の様な免疫学的に不活性な粒状物質を増感させる
に抗原を用いた場合に出来るのである。増感した
粒子は直接凝集試験に用いられ、その場合与えら
れた試験液体中にある風疹抗体は粒子凝集現象の
観察によつて迅速に検出されまた標準稀釈法によ
つて定量される。この受動的凝集法は従来のHAI
法が必要とした様な試験液体からの非―特定抑制
剤又は抗―赤血球抗体の除去を要しないのであ
る。
本発明の増感粒子はまた放射免疫試験（RIA）
法および酵素免疫試験（EIA）法にも使用出来
る。更に本発明の溶解性抗原はよく知られた免疫
沈澱試験法実施に有用であると期待される。
本発明の抗原および試薬の使用および免疫学的
試験法実施に伴なう利益は次の明細記述によつて
明白となるであろう。
本発明に溶解性抗原は風疹ビールスに感染した
細胞の培養媒質から分離される。抗原を得る為の
組織培養育成に適した細胞種類にはベービーハム
スター腎臓（BHK―21）、豚のスタバイル腎臓
（PS）、血清協会うさぎ角膜（SIRC）およびこの
技術分野でよく知られたものがある。一般にHAI
試験用不溶性風疹血球凝集素の製造に用いる組織
培養（スチユワートらのN.N.Jour Med.276，No.
10 554―７（1967）の方法による）は本発明によ
る使用によく適している。
抗原の分離は成長媒質成分の２段階クロマトグ
ラフ分離法によつて行なう。上記したとおり培養
媒質は成るべく先づ強制透析によつて濃縮してお
き初めに風疹ビールスと反応する抗体を含むと知
られた人間血清から誘導されたIgGが共役結合し
た又は共有結合した固相より成るカラムをとおし
て親和力クロマトグラフ分離法によつて処理す
る。好ましいカラムの固有物質にはアガロースビ
ーズがある。
未結合物質を洗つた後IgGに結合した抗原を適
当な緩衝液で溶離する。PH８以上のグリシン―水
酸化ナトリウム緩衝液が好ましい。特にPHの高い
緩衝液を用いた場合溶離物質を中和した方がよい
であろう。
親和力カラムに結合し緩衝液で溶離される高分
子量物質から抗原を分離するには例えばセフアデ
ツクスＧ―150カラムを用いてゲル透過クロマト
グラフ法を行なつて出来る。カラムからの流出物
を280nmにおける紫外線分光光度計で検べまた精
製抗原を含む分別部分を同定するに逆受動的血球
凝集標準法を用いる。凝集には例えば親和力カラ
ムをつくるに用いたと同一源からの人間IgGで増
感した赤血球を用いる。
かくして得た抗原は50％硫酸アンモニウムに不
溶であり、約3.4Sの沈澱係数をもち、セフアデツ
クスＧ―150クロマトグラフ法で測定した場合約
40000乃至60000の推定分子量をもちかつ免疫電気
泳動においてβ易動性を示す。
この抗原は血球凝集抑制試験において風疹ビー
ルスと反応する人間血清で単一線沈澱を形成する
特徴をもつ。抗原はまた明らかに特徴として約
500乃至10000の特殊風疹抗原活性（S.R.A.A）を
もつ。本明細書でいうS.R.A.A値は次の基準によ
つて示される。風疹感染細胞の成長からのどんな
粗組織培養媒質でも280nmにおける吸光度を表わ
す。感染したBHK―21細胞からの代表的粗媒質
は水と比較した場合約1.1の吸光度を示す。粗媒
質はまたRPHAによつて検べると比較的固定した
滴定量をもつ。感染したBHK―21細胞からの代
表的粗媒質は１：32の滴定量をもつ。感染した
BHK―21細胞からの代表的粗媒質は１：32の滴
定量を示す。粗培養媒質中に発見される物質の
“全A280単位”は容量（ml）と280nmにおける吸
光度の積と定義される。RPHA滴定量の逆数を全
A280単位で除してS.R.A.Aが決定される。故に、
S.R.A.Aは全A280単位で除したRPHA滴定量の逆
数と等しい。
次の実施例は(1)本発明の抗原を含む“濃縮”細
胞培養媒質の製造；(2)親和カクロマトグラフ法お
よび逆受動的血球凝集法に使用する人間のIgGの
製造；(3)親和力ゲルの製造；(4)ゲル透過クロマト
グラフ法カラムの製造；(5)“濃縮”媒質から抗原
の精製および(6)風疹抗原で増感した赤血球の製造
を例証するものである。
実施例 抗原を含む濃縮媒質の製造 BHK―21細胞を20ローラーびんに単層とし
てつけギルクリスト種風疹ビールスを接種した。
培養３―４日後媒質を収穫し帯状遠心分離をして
流出物を貯えた。この流出物を２―８℃でアミコ
ンDC―２中空繊維透析濃縮器中で100倍に濃縮し
た。濃縮物質を9000rpmの遠心分離器で６乃至18
時間処理して透明とした。得た濃縮物質は−20℃
で貯蔵した。
実施例 IgGの製造 約１：640の風疹滴定量をもつた人間の再石灰
化した血漿を次の順序によつて硫酸アンモニウム
で沈澱させ透析し精製した。
(1) 飽和硫酸アンモニウムと風疹ポジチブの人間
の再石灰化した血漿の等容量150mlづつを室温
で電磁撹拌しながら毎分６乃至10mlの割合で混
合した。PHを水酸化ナトリウムで約7.3に調整
した。
(2) 混合物を約１時間撹拌し生成した沈澱を２―
８℃で9000rpmの遠心分離器で30分間処理して
捕集した。
(3) 分離した沈澱を透析管に入れPH8.0の0.01M
K2HPO4／0.01M KH2PO4緩衝液２に対し透
析し同一緩衝液を２づつ５回交換して48時間
続けた。
(4) 透析した物質を回収し更にホワツトマン
DE52ジエチルアミノエチルセルロース微粒
（予め膨潤させた）陰イオン交換樹脂をとおし
て精製し捕集したIgGを濃縮し、遠心分離によ
り清澄とし貯えた。
(5) 回収したIgGの最終収量は全血清70mlに対し
150乃至160mgである。
実施例 親和力ゲルの製造 セフアローズ4b（フアーマシア）又は適当な
アガローズ固相をアセトニトリル中97％（アルド
リツヒ）の臭化シアンで活性化した後人間のIgG
（実施例で製造した）と結合させた。IgGの固
相との結合はキユアトレカサス（J.Biol.Chem.，
245：3059―65（1970）、マーチS.C.らのAnalyt.
Biochem.，60：149―52（1974）の修正法）の方
法によつて行なわせた。
実施例 ゲル透過カラムの製造 親和力カラムから溶離した抗原精製に使用する
ゲル透過カラムは次の方法によつて製造した。
(1) 0.15M NaCl／0.02％NaN3中に0.05Mトリス
―HClのPH8.0緩衝液１中にセフアデツクス
Ｇ―150（フアーマシア）18ｇを加え混合し室
温で３日間膨潤させガスを抜いた。
(2) 緩衝液を入れ一部排出したカラムに膨潤ゲル
スラリを加え充填中３―５cmの静水圧をもたせ
た。
(3) カラムは蠕動性ポンプを用いて操作し、4.8
ml／cm2／時の流速で緩衝液の２床容量と平衡さ
せまた0.2％ブルーデキストラン2000の６―８
mlを用い均質試験をし12ml分別部分を捕集し
た。
実施例 濃縮媒質から抗原の精製 実施例の濃縮液から溶解性抗原の精製は(A)親
和力クロマトグラフ法および(B)ゲル透過クロマト
グラフ法によつて次のとおり行なつた： (A) 親和力クロマトグラフ法 (1) 実施例の親和力カラムを室温に温ため緩
衝液を床の頂部から注入した。
(2) 実施例の超遠心分離濃縮液の３床容量を
約１ml／分の流速でカラムに入れた。
(3) 0.15M NaCl―0.02％NaN3中0.05Mトリス
―HClのPH8.0緩衝液の５床容量を２―３
ml／分の流速で入れてカラムを洗つた。
(4) 次いで0.15M NaCl中0.1Mグリシン―
NaOHのPH12緩衝液の６床容量を用いて約１
ml／分流速でカラムを溶離した。
(5) 直ちに溶離した物質に1N HClを滴加し絶
えず撹拌してPH8.0に中和した。
(6) 中和した物質を単一中空繊維濃縮器中で最
初用いた容量の５倍に濃縮し遠心分離して清
澄とした。
(B) ゲル透過クロマトグラフ法 親和力カラムから溶離した物質は実施例に
つくつたとおりセフアドツクスＧ―150カラム
上でクロマトグラフ法にかけた。分子量40000
乃至60000をもつ物質を含むと思われる溶離分
別部分を捕集しRPHA滴定量を検べた。滴定量
が１：6400と等しいか又はそれ以上の分別部分
を集め併せた。S.R.A.A値は併せた分別部分の
A280値およびRPHA滴定値に基づいて決定出来
る。一般に抗原は粗成長媒質の元の80乃至100
容量から３乃至８ml容量に濃縮され500乃至
10000のS.R.A.A値をもつ。
実施例 風疹抗原に増感された赤血球 人間の赤血球が米国特許第3714345号、第
3715427号および（又は）第3925541号に発表され
た方法によつて安定化された。10％懸濁液2.0ml
につくられ500―1000rpmの遠心分離に２乃至３
分間かけられた。緩衝液を流し細胞をPH4.0の
0.01Mアセテート緩衝液2.0mlに再懸濁させた。
赤血球懸濁液に塩化クロム水溶液（10mgCrCl・
6H2O／ml）0.2mlを加えた。実施例５から得た抗
原0.05乃至0.50mlを赤血球に加えた後懸濁液を30
―32℃で30分毎に撹拌しながら２時間培養した。
増感した赤血球を遠心分離して小球状とし上澄液
を捨てた。赤血球を0.1Mりん酸塩緩衝液に再懸
濁し前記の様に遠心分離すること２回繰返して洗
つた。小球状物を0.1Mりん酸塩緩衝液に再懸濁
し、増感した赤血球の0.125％（Ｖ／Ｖ）懸濁液
とした。
実施例 本質的に実施例による増感赤血球を不特定給
血者の血清試料の抗原滴定量検定に用いその結果
をHAI法によつて得た滴定量と比較した。1336血
清試料を試験し相関係数（γ）を直線回帰分析に
より0.99と決定した。増感赤血球を使えば異種赤
血球とクロス―反応をする抗体を除去する為血清
試料を予め吸収する必要がない。更に非―特定脂
肪蛋白質抑制物を除去する為血清試料を前処理す
る必要がない。
本発明の多数の修正法および変更法がこの分野
の知識ある者には考えられるであろう。例えば抗
原―抗体検定法に有用な様なこの分野でよく知ら
れた種々の型の免疫学的に不活性な粒子を増感す
る抗原を使用出来る。こうして増感された粒子は
凝集法、放射免疫試験法、螢光法および酵素免疫
試験法による抗体検出に使用出来る。更に赤血球
およびリポサムの様な粒子は補体で仲介されたラ
イシス（lysis）に基づく試験物をつくる様に増
感出来る。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 血球凝集抑制試験において風疹ビールスに反
    応性をもつ人間の血清と単一線沈澱を形成し、
    500乃至10000の特定風疹抗原活性をもち、40000
    乃至60000の分子量をもち、50％飽和硫酸アンモ
    ニウムに不溶性でありかつ免疫電気泳動において
    β易動性を示す精製した風疹ビールス抗原の製法
    であつて、 (a) 風疹抗原と反応する抗体を含むと知られてい
    る人間の血清から誘導されたIgGが共有結合し
    ている固相より成るカラムに風疹ビールスに感
    染した細胞の組織培養の成長媒質をとおしてク
    ロマトグラフ分離を行い、 (b) 上記カラムを溶離してその中のIgGに結合し
    た物質を分離し、 (c) 分離した溶離物質をゲル透過クロマトグラフ
    法にかけて分子大きさに基づく物質分離をし、
    かつ (d) 上記分離溶離物質から相互逆受動的血球凝集
    活性に基づき風疹抗原を単離する 工程より成ることを特徴とする風疹ビールス抗原
    の製法。 ２ 工程(a)において固相がアガロースビーズより
    成る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 工程(b)において溶離物質が８より大きなPHを
    もつ緩衝溶液でありかつ工程(c)の前に上記溶離物
    質を中和する工程を含む特許請求の範囲第１項に
    記載の方法。 ４ 血球凝集抑制試験において風疹ビールスに反
    応性をもつ人間の血清と単一線沈澱を形成し、
    500乃至10000の特定風疹抗原活性をもち、40000
    乃至60000の分子量をもち、50％飽和硫酸アンモ
    ニウムに不溶性でありかつ免疫電気泳動において
    β易動性を示すことを特徴とする精製した風疹ビ
    ールス抗原。 ５ 血球凝集抑制試験において風疹ビールスに反
    応性をもつ人間の血清と単一線沈澱を形成し、
    500乃至10000の特定風疹抗原活性をもち、40000
    乃至60000の分子量をもち、50％飽和硫酸アンモ
    ニウムに不溶性でありかつ免疫電気泳動において
    β易動性を示す精製した風疹ビールス抗原により
    表面部分が活性化された個別粒子より成ることを
    特徴とする免疫化学測定用試薬。 ６ 粒子が赤血球である特許請求の範囲第５項に
    記載の試薬。
JP2170178A 1977-03-01 1978-02-28 Immunological test substance for rubella and production and use thereof Granted JPS53107414A (en)

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US77323177A 1977-03-01 1977-03-01

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NL (1) NL7802216A (ja)
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