JPS63164882A - トリプトフアンシンタ−ゼ生産菌等の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、エシェリヒア属に属するトリプトファンシン
ターゼ又はトリプトファナーゼ生産菌を、酵素活性を高
くかつ高収量で培養する方法に関する。

（発明の背景） 最近、Ｌ−トリプトファンは医薬用のみならず飼料添加
剤としての使用が注目されており、その安価な工業的製
法の提供が期待されている。

Ｌ−）リブトファンを製造する種々の方法の中で有望視
されているものに、インドールと１４−又はＤＬ−セリ
ンを原料とし、トリプトファンシンターゼを酵素触媒と
してＬ−トリプトファンを製造する方法、およびインド
ールとピルビン酸又はその塩とアンモニウムイオンとか
らトリプトファナーゼを酵素触媒としてＬ−トリプトフ
ァンを製造する方法がある。近年これらの酵素はＤＮＡ
組み換え技術の応用によりエシェリヒア属に属する微生
物の菌体内に大量に生産させることが回部となった。こ
れらの酵素を工業的に使用する為には、酵素を菌体内に
大量に産生じた状態のまま該産生菌を高収量で効率よく
培養する方法の開発が望まれている。

（従来技術と課題） 従来、トリプトファンシンターゼ生産菌の培養に関して
は、炭素源となるグルコース濃度の影響について主に渭
ぺられているのみで、他の微量成分の添加効果について
の知見は殆ど知られていない、さらに遺伝的に改良され
たトリプトファンシンターゼ又はトリプトファナーゼ高
生産菌については皆無に等しい。

本発明者等は、トリプトファンシンターゼ又はトリプト
ファナーゼ活性の高い該酵素生産菌を、高収量で効率良
く培養する条件を鋭意検討した結果、培地中の鉄イオン
の濃度を０．１ｍＭ以下になるように連続的又は断続的
に添加しながら培養することにより、菌体内該酵素活性
を高い状態に維持したまま、高収量で該酵素生産菌が得
られることを見出し本発明を完成させた。

（発明の構成） 本発明は、トリプトファンシンターゼ又はトリプトファ
ナーゼを含有し、該酵素活性の高い該酵素生産菌を高収
量で効率良く培養する為に、培地中の鉄イオンの濃度を
０．１ｍＭ以下になるように同イオンを連続的に又は断
続的に添加しながら上記生産菌を培養することを特徴と
する方法である。

（発明の具体的方法） 一般に、微生物は生育に鉄イオンを要求するが、トリプ
トファンシンターゼ又はトリプトファナーゼ生産菌の培
養に際して、鉄イオンを培養開始時に一括して高濃度（
０，１ｍＭを越える濃度）で培地に仕込んだ場合には、
該酵素活性及び生育に悪形響を及ぼすことが培養条件の
種々の検「・１により明らかとなった。これは、鉄イオ
ンと他の培地成分との不溶性複合体に起因するものと考
えられる０本発明者らは、前記課題に対し、鋭意検討し
た結果、エシェリヒア属に属し、トリプトファンシンタ
ーゼ又はトリプトファナーゼ生産菌の培養に関し、培地
中の鉄イオン濃度が０．１ｍＭ以下に保たれるように、
鉄イオンを連続的又は断続的に添加して培養することに
よりトリプトファンシンターゼ又はトリプトファナーゼ
の高い活性のまま、該酵素生産菌を高収量で効率良く培
養する方法を見出した。

本発明に使用する微生物としては、トリプトファンシン
ターゼ又はトリプトファナーゼ生産菌であれば特に限定
されるものではないが、例えば、トリプトファンシンタ
ーゼ生産菌としては、エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　　ＹＫ２００
１（Ｆ、ＥＲＩＩ　Ｐ−７１３９）、同に１２　ＹＫ　
２００４　（ＦＥｌ？Ｍ　Ｐ−７８３８）、同に１２　
　ＹＫ　２００９　（ＦＥＩＩＭ　　Ｐ−７９５７）及
び同に１２　ＹＫ　２０１４　（ＦＥＲ？Ｉ　Ｐ−８３
２８）などが挙げられる。一方、トリプトファナーゼ生
産菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃ
ｈｅ−ｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ目）　Ｋ１２　　ＹＫ　　
３００２　　（Ｆ［！ＲＭ　　Ｐ−８８４４）及び同に
１２　　ＹＫ　　３００３　　（ＦＥＲＭ　Ｐ−８８４
５）などが挙げられる。

前記微生物の培養に用いる培地としては、炭素源として
、グルコース、グリセロール、フラクトース、シュウク
ロース、糖蜜等の種々の炭水化物が使用出来る。また、
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリ
ウム、硝酸カリ、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモ
ニア等が好適に用いられ、無機物としては、リン酸カリ
ウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等が用い
られる。また、必要に応じて、ビタミン、アミノ酸等の
栄養源を添加することが出来る。

本発明に用いる培地中の鉄イオン濃度は０．１ｍＭ以下
に保つように連続的又は断続的に添加する。鉄イオンと
しては硫酸鉄、塩化鉄、硝酸鉄等が使用される。培！！
温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは３０℃〜４０℃で
あり、培養中の培地のｐ　Ｈは６〜９、好ましくは７〜
８である。

培養は、通気攪拌条件の下、好気的に行う。

本発明の培地中の鉄イオン濃度を０．１ｍＭ以下に制御
する方法としては、培地中の鉄イオン濃度を常法（実験
農芸化学・別巻、東京大学農学部農芸化学教室編、朝Ｃ
害店、ｐ、６３〜６４．１９６８年）Ｋ従い、比色定發
法により逐次定量して、鉄イオン濃度がＯ，１ｍＭを越
えないように連続的又は断続的に添加する。

本発明の方法によれば、トリプトファンシンターゼ又は
トリプトファナーゼ生産菌を高活性のまま高収量で培養
することが出来、該生産菌の工業的生産に大いに貢献し
得る 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例−１ 第１表に示した培地１００ｍｌを５００ｍ１ｌ容フラス
コに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものにト
リプトファンシンターゼ生産菌であるエシェリヒア・コ
リ　（Ｆ、５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ１
２　　ＹＫ２０旧（ＦＥＲＭ　ｐ−７１３９）を植菌し
、３７℃にて１日振盪培養後、該培養物の２０ｍ６を同
様にして調製したジャーファーメンタ−中の培地１００
０ｍ７！に接種し、３７℃にて回転数６００ｒｐｍ、１
ｆｆｉ気１１ｖｖｍ、ｐＨ７，２（２８％アンモニア水
で開整）で培養した。

培養中経時的に培地中の鉄イオン濃度を測定し、０．１
ｍＭを越えないように大体１〜２時間毎に鉄イオンを添
加し、最終的に添加した鉄イオンの累計量が、０．５ｍ
Ｍに相当するように１５時間培養を行った。比較例（１
）として、培養開始時に鉄イオン濃度０．５ｍＭ　（他
の培地組成は茅１表と同様）の培地を使用して鉄イオン
の添加なしに同様に培養を行った。

第　　１　　表 グルコース　　　　　　　　　　　　３０ｇＫ８２　Ｐ
Ｃ）、　　　　　　　　　　　　１．６ｇＫ、ＨＰＯＩ
　　　　　　　　　　　　５．５ｇＣＮＨｔ　）２ＳＯ
４３，０ｇ Ｍｇ５Ｏ，・７１１，０　　　　　　０．１ｇＦｅ５０
．’　７１１２０　　　　　　　２７ｍｇ（０，ＬｍＭ
） 蒸留水　　　　　　　　　　　　１０００ｍ１（ｐｌ−
１７，２） 尚、菌体ａＱ殖度は、１５時間培養後の培養液の濁度を
常法通り比濁法（実験農芸化学「下」、東京大学農学部
農芸化学教室編ｐ、２０７〜２０８．１９７８＞にて測
定し、鉄イオンを培養初期に一括して添加した場合（比
較例）の濁度を１００とする相対値で示した。

また、トリプトファンシンターゼ活性は、１５時間培＃
後の菌体を遠心分離して集菌し、１００ｍ１トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，８）Ｋて一度洗浄後、湿菌体の２０　
Ｑｍｇを秤量し、同緩衝液の１ｍｌを添加懸濁後、菌体
破砕装置（ブランソン２００）Ｋて菌体を破砕したのち
、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４０分間、４℃）Ｋよ
り（すた上澄液を常法通りＹａｎｏｆｓｋｙらの方法（
Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎＥｎｚｙｗｏｌｏＨｙ、　ｖｏ！
　、５．７９４　（１９６２）　　参照〕に従い測定し
た。なお、活性値は、鉄イオンを培養初期に一括して添
加した場合（比較例）の活性を１００とする相対値で示
した。

以上の結果を、次の第２表に示した。

第　　２　　表 注：比較例（２）は主培養の培地に鉄イオンを添加せず
且培養中にも鉄イオンを添加しないもの。

実施例−２ トリプトファンシンターゼ生産菌としてエシェリヒア・
コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　ＫＩ
２　　ＹＫ２００４　（ＦＥＲＭ　Ｐ−７８３８）を使
用する以外は実施例−１と同様の操作にて実施した。結
果は第３表に示した。

第　　３　　表 実施例−３ トリプトファンシンターゼ生産菌としてエシェリヒア・
コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ１
２　　ＹＫ２゜０９　（ＦＥＲ門Ｐ−７９５７）を使用
する以外は実施例−１と同様の操作にて実施した。但し
、培養時間は１６時間である。結果は第４表に示した。

第　　４　　表 実施例−４ トリプトファンシンターゼ生産菌としてエシェリヒア・
コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ１
２　　ＹＫ　２０１４　（ＦＥＲＭ　Ｐ−８３２８）を
使用したこと及び培養時間を１６時間としたこと以外は
実施例−１と同様の操作にて実施した。結果は第５表に
示した。

第　　５　　表 実施例−５ 第６表に示した培地１００ｍｊ＋を５００ｍｉ！容三角
フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したも
のにトリプトファナーゼ生産菌であるエシェリヒア・コ
リ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ１２Ｙ
Ｋ３００２　（ＦＥＲＭ　Ｐ−８８４４）を植菌し、３
７℃にて１日振盪培＃後、該培養物の２０ｍ１を同様に
してｍ製したジャーファーメンタ−中の培地１０００ｍ
Ｊに接種し、３７℃にて回転数６０Ｏｒｐｍ５通気身１
ｖｖｍ、ｐＨ７，２（２８％アンモニア水で調整）で培
養した。培養中経時的に培地中の鉄イオン濃度を測定し
、０．１ｍＭを越えないように逐次添加し、最終的に添
加した鉄イオン濃度が、０．５ｍＭに相当するように培
養を行った。比較例として、培養開始時に鉄イオン濃度
０．５ｍＭ（他の培養組成は第６表と同様）の培地を使
用して鉄イオンの添加なしに培養を行った。

第６表 グリセロール　　　　　　　　５ｇ ＫＨ，ＰＯ，１，６ｇ Ｋ２ＨＰ０．　　　　　　　　　５．５ｇ（ＮＨ，）２
　Ｓｏ、　　　　　　　３．０ｇＭｇ５Ｏ，・７Ｈ２０
０，１ｇ ＦｅＳＯａ　　・７Ｈ２０２７ｍｇ （０，１ｍＭ） Ｌ−）リプトファン　　　　　　　０．２ｇ蔑留水　　
　　　　　　　　１０（１０ｍ／（ｐＨ７，２） 尚、菌体増殖度は、実施例−１と同様にして測定した。

また、トリプトファナーゼ活性の測定には、２８時間培
養後の菌体を遠心分離して集菌し、１００ｍＭ１−リス
塩酸ｒｉ街液（ｐＨ７，８）Ｋて一度洗浄後、湿菌体の
２０　Ｑｍｇを秤量し、同ｉ街液の１ｍｆｆ１を添加懸
濁後、菌体破砕装置（プランソン２００）Ｋて菌体を破
砕したのち、遠心分離（１２００ｒｐｍ、４０分間、４
℃）Ｋより得た」二澄液を用いた。

活性の測定は、前記上澄液を適当に希釈（１００ｍ　Ｍ
　）リス塩ｆｆｌ　Ｄ　ｔｉｔ液、ｐ　Ｈ７，８）した
Ｈ’ｃ第７表に示した反応液１　ｍ　ｌに添加し、３７
℃で１５分間反応させた後、インドールの生成量を常法
（０，１１，Ｓｍ１ｔｈ　ａｎｄ　Ｃ，Ｙａｎｏｆｓｋ
ｙ　：”Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｙ＋ｗｏｌｏＲｙ
　　”＋へｅａｄｅｍｉｃ、　　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ
　　　（１９６２）、ｖｏ１５、　ｐ７９４〜８０６〕
に従い測定して求めた。活性値は、鉄イオンを培養初期
に一括して添加した場合（比較例）の活性を１００とす
る相対値で示した。

結果は、第８表に示した。

第　　７　　表 Ｉ、−トリプトファン　　　　　　　　１０μ霧ｏ１ｅ
ピリドキサール−５′−リン酸　　　０．０３　μｎ＋
ｏｌｅＫ　ＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　　１０
０　　／Ｊｗｏｌｅト　リ　ス８Ｍ　ｊｆｒ　液（ｐ　
　Ｈ８，０）　　　　　　　　　　　　１００　　μｍ
ｏｌｅ全容　　　　　　　　　　　　　　　１ｍβ第　
　８　　表 実施例−６ トリプトファナーゼ生産菌としてエシェリヒア・コリ　
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　　
ＹＫ３００３　（ＦＥｌｌＭ　Ｐ−８８４５）を使用す
る以外は実施例−５と同様の操作にて実施した。結果は
第９表に示した。

第　　９　　表

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）培地中の鉄イオンの濃度が０．１ｍＭ以下に保た
   れるように鉄イオンを連続的又は断続的に添加すること
   を特徴とするエシェリヒア属に属するトリプトファンシ
   ンターゼ又はトリプトファナーゼ生産菌の培養方法。
2. （２）生産菌が、少なくともトリプトファンシンターゼ
   の構造遺伝子を含むプラスミドを含有するエシェリヒア
   ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に属する
   トリプトファンシンターゼ生産菌である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）生産菌が、少なくともトリプトファナーゼの構造
   遺伝子を含むプラスミドを含有するエシェリヒア・コリ
   （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）に属するトリプ
   トファナーゼ生産菌である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。
4. （４）トリプトファンシンターゼ生産菌が、エシェリヒ
   ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２
   　ＹＫ２００１、同Ｋ１２　ＹＫ２００４、同Ｋ１２　
   ＹＫ２００９又は同Ｋ１２　ＹＫ２０１４である特許請
   求の範囲第２項記載の方法。
5. （５）トリプトファナーゼ生産菌が、エシェリヒア・コ
   リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ−１２　Ｙ
   Ｋ３００２又は同ＹＸ３００３である特許請求の範囲第
   ３項記載の方法。