JPS63181995A - 有機体システムにおける改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野］ この発明は、バチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の形質転換方
法に関するしのである。

「定義」 この明細書で用いる「形質転換する」および「形質転換
」の語は、外来性ＤＮＡが宿主細菌に導入され、それに
より宿主細菌に遺伝子変化が誘発されるような遺伝子転
移機構に関して使用する。

［背景技術］ バチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂ　Ｔ）は、数々の昆虫の幼
虫に対して有毒なデルタ・エンドトキシン（ＤＥＴ）、
結晶性蛋白を含むダラム陽性菌である。亜種によって異
なるが、ＢＴは種々の害虫に対する選択的生物殺虫剤と
して用いられている。亜種のツリンギエンシス（ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、アレスチ（ａｌｅｓｔｉ）お
よびデンドロリムス（ｄｅｎｄｒｏｌ　ｉｍｕｓ）は例
えば鱗翅類（Ｌ　ｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）に対して、亜
種のイスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）、ダ
ルムスタジエンシス（ｄａｒｍｓＬａｄｉｅｎｓｉｓ）
　７３−　Ｅ−Ｌ　Ｏ−２、キュンユエンシス（ｋｙｕ
ｓｈｕｅｎｓ　ｉｓ）およびモリソニ（ｍｏｒｒｉｓｏ
ｎｉ）ｒ’Ｇ１４は双翅類（Ｄ　１ｐｔｅｒａ）に対し
て、亜種のテネブリオシス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｓｉｓ）
は甲虫類（ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）に対して、亜種のク
ルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）　ＨＤ　−１。

ケニエ（ｋｅｎｉａｅ）、アイザワイ（ａｉｚａｗａｉ
）およびコルメリ（ｃｏｌｍｅｒｉ）は鱗翅類および双
翅類に対してそれぞれ有効であるか、亜種のダコタ（ｄ
ａｋｏｔａ）、インジアナ（ｉｎｄｉａｎａ）、トクク
エンシス（１０ｋｕｋｕｅｎｓｉｓ）およびクマモトエ
ンシス（ｋｕｍａｍｏ１０ｅｎｓ　ｉｓ）は害虫に対す
る毒性が知られていない。

工業的および生態学的見地からは、異なった活性、例え
ば高いまたは広い活性スペクトルをもつ別の生物学的殺
虫剤を用いることが望ましい。

この目的は、例えば自然界からの新規分離株の開発、細
菌の結合または細菌の形質転換により達成することかで
きる。

こうして、最近になって興味ある活性を有する新規ＢＴ
株［例えば甲虫に活性を有するバリエタス・テネプリオ
ニス（ｖａｒ、　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）］が分離さ
れ、８７株との結合の成功が報告された。

細菌の形質転換は、らし成功すれば、特定の遺伝子情報
を細菌に導入することが可能になるという利点を有する
。

ＤＥＴをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）およ
びシφ−トモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のような種々の微
生物あるいは高等植物（たばこ）に、組換えＤＮＡ技術
すなわち形質転換によってクローン化された。

しかし、このようにして遺伝子的に処理された生物は、
天然ＢＴ株に較べて少量のＤＥＴしか産生じない。した
がって、少なくともＤＥＴをコードする外来遺伝子の発
現が改善されない限り、このような生物の商品価値は疑
問である。

それ故、形質転換技術により、宿主としてＢＴ細菌を用
いて外来遺伝子（ＤＮＡ）の発現の改善を試行取得する
ことが必要と思われる。

既知の形質転換技術は基本的に細胞またはプロトプラス
トを用いて行なわれる。

細胞の形質転換は、コンビ−テント（受容能のある）細
胞すなわち外来性ＤＮＡの結合と吸収が可能な生理学的
段階に正確にある細胞の存在を要する。しかし、コンピ
ーテントＢＴ！ｌｌ１１ｍが存在するという証拠は何も
ない。

ＤＮＡによるＢＴプロトプラストの形質転換は、極めて
低収率、すなわちバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換で得られるより
かなり低い収率でしか成功しないことが報告されている
。この低収率は、一部は形質転換プロトプラストを含む
プロトプラストの再生の悪さに帰せられる。シャシ等［
ファンダメンタル・アンド・アプライド・アスペクツ・
オブ・インバーチプレート・バソロジ−（Ｆ　ｕｎｄａ
ｍｅｎｔａｌ　　ａｎｄ　　ａｐｐｌｉｅｄａｓｐｅｃ
ｔｓ　　ｏｆ　　１ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　　ｐａｔ
ｈｏｌｏｇｙ）ザムソン、プラクおよびピータース、１
９８６年、４０２頁］は、彼らがプロトプラスト法の最
適条件を見出し、プラスミドＤＮＡでＢＴまたはバチル
ス・セレウム（Ｂ、　ｃｅｒｅｕｓ）を形質転換するた
めの改善再生培地を開発したと述べているが、彼らは最
適化または改善の性質については具体的に述べていない
。

したがって、シャシ等による形質転換度は分析すること
ができない。

［発明の記載コ この発明は、ＢＴの形質転換に関する改良法を提供する
乙のである。この発明は、微生物ＢＴを高張水性媒質中
に導入するといわゆるコンピーテンス状態を発達させる
との知見に基づいている。

この明細書で用いる高張の語は、常用ＢＴ（細胞培養ま
たは生長）培地に対して高張である培地についていうも
のとする。

この発明の方法は、下記段階を含む。

（ａ）ＢＴ細胞を高張水性培地中で生長させ、（ｂ）段
階（ａ）で得た細胞培養物中にポリエチレングリコール
の存在下高張状態を維持しつつ外来性ＤＮＡを導入し、 （ｃ）高張水性培地中にある上記処理したＢＴを分ｎト
再けんだくして発現させること。

目的とする高張状態を得るためには、半透性の細胞膜を
通過仕ずＢＴ細胞に代謝されないかまたは有毒でないな
らば原則として任意の化合物を使用することができる。

一般に、目的とする高張状態はＢＴに代謝されない糖類
、特に単糖類またはン夏糖類を用いて達成するのが好都
合である。このような糖類の適当な例は、しよ糖および
乳糖である。

目的とする高張状態を達成するのに用いる糖類の濃度は
、水性培地１リットル当り糖類０．４Ｍのオーダーまた
はそれ以上が好便である。一般に、ＢＴの細胞質に対し
て基本的に等張な濃度で好結果か得られる。このような
滲透圧状態は一般に水性培地１リットル当り糖類０．４
Ｍ−０，５Ｍの濃度で得られる。しかし、高糖濃度も用
いることかできるが、一般に利点はない。

この明細書で用いる高張の語はまた、面述した状態また
は培地（媒質）を指す。

基本的に高張状態が種々の段階（ａ）　−（ｃ）の間を
通じて保たれることが重要である。

高張水性培地は基本的に中性であること、すなわちｐＩ
（７±２、好ましくは７±１を有するのが好適である。

さらに、（高張状態を維持する）糖類および場合により
（基本的に培地を中性に維持する）緩衝剤に加えて、例
えば必要な場合に１３Ｔ培養物の生長と発達を促がす等
のために他の成分を加えることができる。

このような成分は慣用されるしのであり、当業者に周知
であって、例えば栄養素および塩類を含む。

適当な栄養素の例は、例えばビーフェキス、イーストエ
キス、ペプトン、トリプトン、アミノ酸類（例えばトリ
プトファン）、ヌクレオシド（例えばチミジン）等であ
る。

適当な塩の例はＮａＣρおよびＭｇＣＱ＊・６Ｈ２０で
ある。適当な高張培地は１リットル当り０．０５−０．
１Ｍの塩類を含み得る。塩としてはマグネシウム塩（例
えばＭｇＣ（ｂ・６Ｈ２０）が好ましい。

ＢＴ細胞培養物（出発原料）は、慣用条件下で製造され
生長する。すなわち、通気下、室温で、適当な栄養培地
、例えばスビツイゼン［プロシーディンゲス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・才ブ・サイエンシズ（Ｐｒ
ｏｃ、　ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（Ｗａｓｈ）４４巻１７１−１７５頁（１９５８年）］
に記載された最少培地中、場合によりアミノ酸および塩
類、例えば触媒量のＭｎＳＯ４のようなマンガン塩等を
補足して行なう。段階（ａ）で指数生長期にあるＢＴ細
胞培養物を用いるのが有利である。

ついで、新製したＢＴ細胞培養物を出発細胞濃度が実質
的にＬｍ（ｌ当１０８未満、例えば１０４−１０６細胞
／ｆｆＬ２になるように高張培地中に希釈し、細胞濃度
が１０８／靜より僅かに少ない量、例えばＩ　０８−５
ｘ　１０８／培地顧になるまで生長させる。

新製ＢＴ細胞培養物の希釈に用いる高張培地は２０−４
０°Ｃ１例えば３７℃であるのが好適である。培養物は
この温度で生長させる。勿論、完全な通気を確保する。

発泡を防ぐため、少量のノリコーンを細胞培地に加える
のが好便である。

目的とする最終細胞ａｌｌｆｆｉ（１０９細胞／ｒｘ（
ｌより僅かに少）に到達すると、得られたコンピーテン
トＢＴ細胞をこの発明の方法の（ｂ）段階にしたがって
、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下にＤＮＡ
で処理することができる。

しかしながら、工程ｂ）に付す前に、高張培地中にリゾ
チームを含む中程度の濃度のものを用い、この発明の段
階ａ）によって得られたコンピーテントＢＴ細胞を処置
すること、および単離して高張培地中にＢＴ細胞を処置
したリゾチームを再懸濁することが有利である。使用さ
れるべきリゾチームの量はプロトプラストの製造に通常
に使用される飛より少ない。上記の量（ａ度）はもちろ
ん培地の浸透圧、温度、所望される反応時間等のような
各種のファクターによって変わる。一般に適当なリゾチ
ーム濃度は水性高張培地（この培地は実質的にプロトプ
ラスト化する目的に必要である１ｍｌ当たり２から１５
ｍｇより低い。）１ｍ１当たり２０から３００マイクロ
グラム、例えば２００マイクログラムである。細胞培養
物中でのりゾヂームの十分な分布を確かめるべきである
。反応時間は特に濃度および使用されるリゾチーム溶液
の質によって変わる。最適反応時間は標準アッセイによ
って決定し得る。

反応温度は好適には２０から４０℃であり、好ましくけ
室温以上であり、例えば約３７℃である。

上で示したように、リゾデーム処置の間、高張状態を維
持するべきである。

その後リゾチームを用いた処置は細胞懸濁物の遠心およ
び高張培地で好適には室温でのベレットの再懸濁によっ
て終了する。

それによって、段階ａ）によって、また所望によってリ
ゾデームを用いた処置によって得られ、製造されたＢＴ
細胞培養をＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡを用い、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で処置する。

その目的のために、ＤＮＡおよびＰＥＧを、細胞懸濁物
の浸透圧を上記細胞懸濁物にＤＮＡおよびＰＥＧ添加後
も基本的には変化しないで維持するするような高張溶液
中に＠濁物／溶液を含むものとして使用する。

使用されるＰＥＧの量は、ＢＴ細胞培養物中でのその濃
度が１リツトル当たり１０９から４０ｇ１例えば１リツ
トル当たり３０ｇの細胞培養用培地の範囲以内であるな
かから好適には選択する。

形質転換段階ｂ）は基本的には好適なプロトプラスト形
質転換法に適応していることが知られている条件の下で
行い得る。

従ってＰＥＧの好適量および型並びに使用されるＤＮＡ
の好適量の選択は好適にプロトプラスト形質転換の分野
で公知の方法によってなされ得る。

例えばこの工程で使用されるのに適当なＰＥＧの例はＰ
ＥＧ　　６０００である。

１０４〜１０”のＢＴ細胞当たり１００ナノグラムから
２０ナノグラムのＤＮＡｆｉが一般に良い結果を招く。

インキュベーションは好適には室温で穏やかに混合して
行う。必要インキュベーション時間は一般に短く、数分
程度である（実施例参照）。

その後細胞の溶媒（溶液／懸濁液である場合）の高張状
態を固定する以外は、形質転換細胞から成る懸濁物は通
常の方法を使用することにより後処理する。例えば懸濁
物を高張溶液で希釈し、懸濁物を混合し、遠心した後ペ
レットを高張培地で再懸濁する。

その後得られる懸濁物を２０から４０℃、例えば３７℃
の温度でインキュベートして発現させる。

例えば振とう湯浴を使用して好適には懸濁物を曝気する
。適当なインキュベーション時間は、３０分から５時間
で、さらに好ましくは２から４時間の間、例えば３時間
である。

コロニー形成単位（ｃＦ’　Ｕ）の測定のため、得られ
た細胞培養物の適当な希釈物を培養平板上に置く。形質
転換頻度は、抗体含有培養平板のような標準技術を用い
た公知方法によって決定し得る。

この発明の方法は高収率でＢＴ細胞の形質転換をさせる
。形質転換はＢＴ細胞中のゲノムライブラリーの遺伝子
クローニング、ＢＴ中のＤＥＴ遺伝子のクローニングお
よび発現、ＢＴ中のＤＥＴインビトロおよびインビボで
の遺伝子を修飾したクローニングおよび発現、有用なポ
リペプチド類の合成等ををもたらす。

形質転換ＢＴ細胞を生物学的殺害虫剤として使用する場
合、上記剤は好適には殺虫剤組成物形態、例えば懸濁濃
厚物形態または粉末形態で使用される。上記組成物は通
常の方法で得られる。

以下に示す非制限実施例において出発物質（Ｂ′Ｆ細胞
およびプラスミドＤＮＡ）は得られろ物が明白であり、
プラスミド相互作用によらないように、選択されろ。出
発物質として使用されたＢＴ細胞はプラスミド類を含ま
ず、形質転換剤として使用されたプラスミドＤＮＡはテ
トラサイクリンに対する耐性をコード化する。

他のＢＴ細胞および／または外来ＤＮＡ、特にプラスミ
ドＤＮＡはこの発明の方法で使用して同様の結果を得る
。

「実施例」 温度はセ氏であり、部は特に断らない限り重量の部であ
る。

実施例 ［出発物質コ 株ニブラスミド類を持たないバチルス・ツリンギエンシ
ス・サブスペシス・クルスタキ　Ｉ■Ｄ１　クリＢ　Ｃ
ＢａｃｉｌＬｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｒ＋ｓｉｓ　５
ｕｂｓｐ。

ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤＩ　ｃｒｙ　Ｂ）　［エム・エ
ム・レカデット・インキュベ−ト・パスチュール（パリ
）から人手］ ＤＮＡ：バチルス・サブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ
）Ｉ３Ｄ２２４（ｐＢｃ１６．１）を用い細胞交配を通
して接合することによって導入され、テトラサイクリン
耐性をコード化する、ＨＤＩクリＢ　（ｐＢｏ　１６．
．１）から抽出したｐＢｃ１６．１　　［クラフト・ジ
ェイら著、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Ｍｏｌｅｃ、ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ）１６２
巻、５９〜６７頁コ ［培地コ ＳＡ　トリプトファン： １％カザミノ酸（ディフコ）、５Ｘ１０−０Ｍ−ＭｎＳ
Ｏ，および２０ｇｇ／ｍｌ）リプトファンを補足したス
ビツィーゼン最小培地［スピツィーゼン・ジエイ、プロ
シーディング・オブ・ナンヨナル・アカデミ−・オブ・
サイエンシズ（Ｐｒｏｃ。

ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）４４ａ、１７１〜１７
５　頁コ 高張培地（Ｉ（Ｍ）　： ウシ抽出物　　　　　１．５０ｇ／ｌ ペプトン　　　　　５．ＯＯｇ／Ｉ Ｎａ　Ｃ１３，５０ｇ　／　１ ノ二一クロース　　１７１’、１５ｇ　／１マレイン酸
　　　　　２．３２ｇ／ｌ ＭｇＣｌ　２・６ＬＯ４，０７ｇ　／　１［）！（６，
フ ルリア培地（Ｌ　Ａ）・ トリプトン　　　　　Ｌｏｇ／ｌ 酵母抽出　　　　　　　５ｇ／Ｉ Ｎａ　ＣＩ　　　　　　　　Ｌｏｇ　／１アブｆ−（デ
ィフ］・バクト）　　　　　１５ｇ／ｌチミジン　　　
　　　２０ｇ　／１ 抗体、テトラサイクリン、Ｌ、Ａ平板上で１０〜１００
μｇ／ｍｌ ［溶液］ ＳＭＭ：　シュークロース　　　　１７１．１５ｇ／ｍ
！マレイノ酸　　　　　　　２Ｊ２ｇ／ｍ１ＭｇＣ１４
１１ｔＯ４，０７ｇ／′ｍｌｐｔｒｅ、５ ＰＥＧ：ＰＥＧ　　６０００　　　　４０ｇ５ＭＭ　　
　　１００ｍ　ｌまで加えるリゾチーム：新鮮に生成し
たＨＭ中２ｍｇ／ｍｌ［方法コ ＨＤＩクリＢの一夜培養物をＳＡトリプトファン１５ｍ
１中で製造し、その後２０℃で曝気しながら育成した。

次の朝、あらかじめ加温しておいた０Ｍ培地中で培養物
を５０〜１００倍に希釈して７．５ｘ　１０５／ｍ　Ｌ
の出発細胞濃度にした。シリコン（２μｍ）を加えて発
泡を抑えた。中程度の曝気をしながら３時間３０分の間
培養物を３７°Ｃて育成し、２，５ｘ　Ｉ　０８／ｍ　
ｌの細胞濃度にした。リゾチームを加えて最終濃度２０
０μｇ／ｍｌにし、細胞懸濁物１ｍｌを振とう湯浴中で
３０分間３７℃でインキュベートした（１５０ｒｐｍ）
。その後、細胞懸濁物を１分間１００００ｇで遠心し、
ベレットを室温、１ｍｌｍｌ新鮮中で再＠濁した。

プラスミドＤＮＡ１ＤＮＡ１００ｎμｇをすでに加えた
５ＭＭ５０μｌに細胞懸濁物０．５ｍｌを加えた。穏や
かに混合しなからＰＥＧ溶液１゜５ｍｌの添加すること
および室温で２分間インキュベーションすることによっ
て細胞を形質転換した。

細胞懸濁物にＨＭ５ｍｌを加え、穏やかにしかし十分に
混合しその後２０分間３０００ｇで遠心した。ベレット
をＨＭｏ、６ｍｌに再懸濁した後振とう湯浴中、３時間
３７℃でインキュベートしくＩ５０ｒｐｍ）、発現させ
た。適当な希釈物を、ＣＦＵ決定のためにＬＡ平板上、
および形質転換選択のためにテトラサイクリン含有ＬＡ
平板上に乗せた。無傷プラスミドＤＮＡＩμｇ当たりＩ
〜２×１０３形質転換物、頻度５ＸＩＯ−’〜ＩＯ−′
が得られた。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記段階、すなわち （ａ）バチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を高張水性培地中
   で生長させ、 （ｂ）段階（ａ）で得た細胞培養物中にポリエチレング
   リコールの存在下高張状態を維持しつつ外来性ＤＮＡを
   導入し、 （ｃ）高張水性培地中にある上記処理したバチルス・ツ
   リンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉ
   ｅｎｓｉｓ）を分離・再けんだくして発現させることを
   含む、バチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞の形質転換方法。
2. （２）工程（ａ）で得たバチルス・ツリンギエンシス（
   Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞
   培養物を（ｂ）および（ｃ）処理の前に高張状態を維持
   しつつ適度の濃度のリゾチームで処理し、ついで得られ
   た処理済バチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
   ｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を分離し高張水性
   培地中に再けんだくする、特許請求の範囲第１項記載の
   方法。
3. （３）高張状態が、バチルス・ツリンギエンシス（Ｂａ
   ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）によって
   代謝されない糖類を用いて得られたものである、特許請
   求の範囲第１または２項記載の方法。
4. （４）水性培地１リットル当り少なくとも０．４Ｍの糖
   類を使用する、特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）工程（ａ）で導入するバチルス・ツリンギエンシ
   ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）
   の当初細胞濃度が培地１ｍｌ当り１０＾４−１０＾６で
   あり、細胞を培地１℃当り１０＾８〜１０＾９の僅か下
   の濃度まで生長させる、特許請求の範囲第１−４項の何
   れか１項記載の方法。
6. （６）リゾチーム濃度が水性培地１ｍｌ当り２０〜３０
   ０μｇである、特許請求の範囲第２−５項の何れか１項
   記載の方法。
7. （７）高張培地が６−８の範囲のｐＨをもつ、特許請求
   の範囲第１−６項の何れか１項記載の方法。
8. （８）高張培地がマグネシウム塩を含む、特許請求の範
   囲第１−７項の何れか１項記載の方法。
9. （９）２０−４０℃の温度で実施する、特許請求の範囲
   第１−８項の何れか１項記載の方法。
10. （１０）バチルス・ツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ
    ｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞１０＾８−１０＾
    ９当り１００ナノグラム−２０μｇのＤＮＡを使用する
    、特許請求の範囲第１−９項の何れか１項記載の方法。
11. （１１）細胞培養物１リットル当りポリエチレングリコ
    ール１０−４０ｇを使用する、特許請求の範囲第１−１
    ０項の何れか１項記載の方法。
12. （１２）段階（ｃ）の高張状態を３０分−５時間維持す
    る、特許請求の範囲第１−１１項の何れか１項記載の方
    法。