BE1000309A4 - Procede de transformation de cellules de bacillus thuringiensis. - Google Patents
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Abstract
Le procédé de transformation de cellules de Bacillus thuriengiensis implique la préparation de cellules compétentes en les faisant croitre dans un milieu aqueux hypertonique, le traitement de ces cellules compétentes, éventuellement après un traitement au lysozyme dans un milieu hypertonique, avec de l'ADN exogène, en présence de polyéthylèneglycol, tout en maintenant l'état hypertonique, et l'isolement et la remise en suspension des cellules de Bacillus thuringiensis ainsi traitées dans un milieu hypertonique pour permettre l'expression.
Description
<Desc/Clms Page number 1> PROCEDE DE TRANSFORMATION DE CELLULES OE BACILLUS THURINGIEUSIS La présente invention concerne un procédé de transformation de cellules de Bacillus thuringiensis. Les termes"transformer"et"transformation", utilises dans la presente invention, sont destinés ä concerner un mecanisme de transfert génétique dans lequel on introduit de l'ADN exogène dans une bactérie receveuse, en introduisant ainsi des modifications génétiques dans ladite bactérie receveuse. Les Bacillus thuringiensis (BT) sont des bactéries Gram positives contenant une protéine cristalline, la 6-endo-' toxine (DET), qui est toxique vis-à-vis des larves d'un certain nombre d'insectes. Suivant les sous-espèces, BT est utilise comme pesticide biologique selectif contre différents nuisibles. Les sous-espèces thuringiensis, alesti et dendrolimus sont, par exemple, pathogenes contre les lépido- patères ; les sous-espèces israelensis, darmstadiensis 73-E- 10-2, kyushuensis et morrisoni PG14 le sont contre les dipatères ; la sous-espèce tenebrionis l'est contre les collo- patères ; les sous-espèces kurstaki HD-l, kenyae, aizawai et colmeri le sont contre les lépidoptères et les dipteres, tandis que les sous-espèces dakota, indiana, tokokuensis et kumamotoensis ne sont pas connues pour être toxiques vis-a-vis de tous les nuisibles. D'un point de vue industriel et écologique, il est souhaitable de disposer de pesticides biologiques additionnels ayant un spectre d'activiste différent, par exemple superieur ou plus large. On peut, par exemple, atteindre ce but en mettant au point de nouveaux isolats ä partir de la nature, par conjugaison de bactéries ou par transformation de bacteries. Ainsi,. on a récemment isolé de nouvelles souches de BT ayant une activite interessante (par exemple var. tenebrio- <Desc/Clms Page number 2> nis ayant une activité contre les coléoptères) et il a également été fait état de récents succès concernant la conjugaison de souches de BT. La transformation des bacteries offre l'avantage qu'elle permet, si elle est couronnée de succès, d'introduire une information génétique spécifique dans des bactéries. Ainsi, un gene codant pour une DET a été cloné dans divers microorganismes tels que Escherichia coli, Bacillus subtilis et Pseudomonas fluorescens, et meme dans des plantes supérieures (tabac), par des techniques d'ADN recombinant, plus spécifiquement par transformation. Ces organismes manipulés génétiquement produisent cependant de faibles quantites de DET comparées aux quantités produites par des souches de BT naturelles. L'importance commerciale de ces organismes est donc discutable, au moins aussi longtemps qu'aucun moyen n'aura été trouve pour améliorer l'expression de l'ADN exogène encodant pour la DET. 11 semblerait donc indiqué d'essayer d'obtenir une meilleure expression de gènes exogènes (ADN) en utilisant une bactérie BT comme bactérie receveuse dans des techniques de transformation. Les techniques de transformation connues sont essentiellement réalisées à l'aide de cellules ou de protoplastes. La transformation de cellules implique la présence de cellules competentes, c'est-à-dire de cellules ä un état physiologique précis permettant la liaison et l'absorption d'ADN exogène. On ne dispose cependant d'aucune preuve de l'existence de cellules de BT compétentes. On a fait état du succès de la transformation de protoplastes de BT par l'ADN avec des rendements seulement très faibles, à savoir sensiblement plus faibles que ceux obtenus avec la transformation de B. subtilis. Les rendements faibles peuvent etre dus en partie à la regeneration mediocre des protoplastes, y compris du protoplaste transformé. Bien <Desc/Clms Page number 3> que Shall et coll. (Fundamental and applied aspects of invertebrate Pathology-Aspects fondamentaux et appliques de la pathologie des invertébrés -, édité par R.A. samson, J. M. Vlak et D. Peters, 1986, page 402) annoncent qu'ils ont optimisé la procedure employant des protoplastes et qu'ils ont mis au point des milieux de régénération améliorés pour transformer BT ou B. cereus avec le plasmide ADN, ils ne précisent pas la nature de l'optimisation ou de l'amelio- ration. Les fréquences de transformation indiquées par Shall et coll. sont donc difficiles ä interpréter. La présente invention a maintenant pour objet un procédé améliore de transformation de BT. 11 est base sur la découverte que les microorganismes de BT développent ce que l'on appelle un statut de compétence lorsqu'ils sont introduits dans un milieu aqueux hypertonique. Le terme"hypertonique", tel qu'il est utilise dans la présente invention, concerne un milieu qui est hypertonique vis-a-vis des milieux de BT classiques (culture ou croissance cellulaire). Le procédé de l'invention met en jeu les étapes qui consistent : a) ä cultiver des cellules de BT dans un milieu aqueux hypertonique, b) ä introduire dans la culture cellulaire obtenue dans l'étape a), et en presence de polyethylene-glycol, de l'ADN exogène tout en maintenant l'état hypertonique, et c) ä isoler et ä remettre en suspension les cellules de BT ainsi traitées dans un milieu aqueux hypertonique pour permettre l'expression. En principe, on peut employer tout composé qui ne traverse pas la membrane cellulaire semi-perméable et qui n'est pas métabolisé par, ou toxique vis-à-vis de, la cellule de BT, pour obtenir l'état hypertonique recherché. En general, l'etat hypertonique recherche est avantageusement obtenu à <Desc/Clms Page number 4> l'aide de saccharides, en particulier de mono-ou de disaccharides, qui ne sont pas métabolisés par BT. Des exemples convenables de ces saccharides sont le saccharose et le lactose. La concentration des saccharides ä employer pour obtenir l'état hypertonique recherche est avantageusement de l'ordre de 0, 4M de saccharides par litre de milieu aqueux, ou supérieure. En general, on obtiendra de bons résultats avec des concentrations essentiellement isotoniques vis-à- vis du cytoplasme de BT. Cet etat osmotique est en général obtenu avec une concentration de O, 4M à O, SM de saccharides par litre de milieu aqueux. Des concentrations supérieures en saccharides peuvent être cependant employées, mais elles n'offrent en général aucun avantage. Le terme "hypertonique" employé ci-dessous concerne un état ou un milieu tel que défini ci-dessus. Il est important que les conditions hypertoniques soient essentiellement maintenues d'un bout à l'autre des différentes étapes a) ä c) du procédé. Les milieux aqueux hypertoniques doivent etre essentiellement neutres, c'est-à-dire qu'ils doivent avantageusement avoir un pH de 7 t 2, mieux encore de 7 t 1. EMI4.1 En plus des saccharides (servant ä maintenir l'etat hypertonique) et des tampons eventuels (servant à maintenir un etat essentiellement neutre du milieu) d'autres ingrédients peuvent être et seront ajoutes, par exemple pour permettre la croissance et le développement de la culture de BT, le cas échéant, etc. Ces ingrédients supplémentaires sont classiques et connus de l'homme de métier; ils comprennent, par exemple, des nutriments et des sels. Des exemples de nutriments convenables sont, par exemple, l'extrait de boeuf, l'extrait de levure, les peptones, les tryptones, les acides amines (par exemple le tryptophane), les nucléosides comme la thymidine et ana- <Desc/Clms Page number 5> logues. Des exemples de sels convenables sont NaCl et EMI5.1 Mgd, O. Un milieu hypertonique convenable peut contenir de 0, de sels par litre. Les sels engloberont de 6Hpréférence les sels de magnesium, comme MgC12, 6H20, La culture cellulaire de BT (produit de depart) est avantageusement préparée et cultivée dans des conditions classiques, c'est-ä-dire sous aération et ä la température ambiante, dans un milieu nutritif approprie, par exemple dans le milieu minimal décrit par J. Spizizen dans Proc. EMI5.2 natl. Acad. Sei. (Wash) 44, 171-175 (1958), eventuellement supplémenté par des acides aminés, des sels, par exemple des quantités catalytiques de sel de manganese tel que MnSO etc. Il est avantageux d'employer, dans l'étape a), une culture de cellules de BT qui se trouve dans la phase de croissance exponentielle. La culture de cellules de BT fraichement préparée est ensuite diluée dans un milieu hypertonique à une concentration cellulaire de départ essentiellement inférieure ä 109 cellules par ml, par exemple de 104 ä 106 cellules par ml, et la culture cellulaire est cultivée, dans ledit milieu hypertonique, jusqu'à ce que l'on obtienne un milieu de concentration cellulaire légèrement inférieure ä 109 cellules par ml, par exemple de 108 à 5. 108 cellules par ml. Le milieu hypertonique employé pour diluer la culture de cellules de BT fraîchement préparée est avantageusement ä 20-40OC, par exemple à 37OC. On laisse ensuite la culture s'effectuer à cette température. 11 est bien évident qu'il faut garantir une aération poussée. Une légère quantité de silicone est avantageusement ajoutée au milieu de culture cellulaire pour empecher le moussage. Lorsqu'on atteint la concentration cellulaire finale souhaitee (légèrement inférieure ä 109 cellules par ml), on peut traiter les cellules de BT compétentes ainsi préparées avec l'ADN, en présence de polyéthylène-glycol (PEG), selon <Desc/Clms Page number 6> l'étape b) du procédé de l'invention. Il est toutefois avantageux de traiter les cellules de BT compétentes obtenues selon l'étape a) de l'invention avec des concentrations modérées de lysozyme dans un milieu hypertonique et d'isoler et de remettre en suspension les cellules de BT traitées au lysozyme dans un milieu hypertonique, avant de les soumettre au processus b). La quantité de lysozyme ä employer doit etre inferieure ä celle qu'on utilise normalement pour preparer des protoplastes. Cette quantité (concentration) dépendra bien entendu de divers facteurs comme la pression osmotique du milieu, sa temperature, la durée de réaction souhaitée, etc. En général, une concentration convenable en lysozyme est de 20 à 300 Ag, par - exemple de 200 lig, par ml de milieu aqueux hypertonique (ce qui est essentiellement inférieur aux 2 ä 15 mg par ml qui seraient normalement nécessaires pour des applications concernant des protoplastes). Il faut garantir une distribution adequate du lysozyme dans le milieu de culture cellulaire. La durée de reaction dépendra donc de la concentration et de la qualité de la solution de lysozyme employée. La durée de réaction optimale peut être déterminée par des essaie standards. La temperature réactionnelle est avantageusement comprise entre 20 et 40OC, de préférence supérieure a la température ambiante, par exemple d'environ 37OC. Pendant le traitement au lysozyme, il faut maintenir l'état hypertonique, tel que défini ci-dessus. Le traitement au lysozyme est ensuiteterminé par centrifugation de la suspension cellulaire et remise en suspension des agrégats dans le milieu hypertonique, avantageusement à la température ambiante. La culture des cellules de BT ainsi préparée - obtenue selon l'étape a), eventuellement suivie du traitement au lysozyme-est ensuite traitée avec de l'ADN, par exemple le plasmide ADN, en présence de polyéthylène-glycol (PEG). Dans <Desc/Clms Page number 7> ce but, l'ADN, ainsi que le PEG, sont employés en suspen- sions/solutions dans des solutions hypertoniques, de sorte que la pression osmotique de la suspension cellulaire demeure essentiellement inchangée après l'addition d'ADN et de PEG ä cette suspension cellulaire. La quantité de PEG employee sera avantageusement choisie de telle sorte que sa concentration dans la culture de cellules de BT se situe dans l'Intervalle de 100 ä 400 g par litre, par exemple ä 300 g par litre de milieu de culture cellulaire. L'étape de transformation b) peut etre essentiellement réalisée dans les conditions connues comme etant appropriée aux procédés classiques de transformation des protoplastes. En conséquence, le choix de la quantité appropriée et du type approprié de PEG et de la quantite appropriée d'ADN à employer peut être effectue convenablement par l'homme du métier de la transformation des protoplastes. Ainsi, un exemple de PEG utilisable dans ce procédé est le PEG 6000. Des quantités d'ADN de 100 ng ä 20 lig pour 108 ä 109 cellules de BT donneront en general de bons resultats. L'incubation est avantageusement réalisée sous agitation modérée à la temperature ambiante. Le temps d'incubation nécessaire est court, en general de l'ordre de quelques minutes (voir l'exemple). La suspension comprenant les cellules transformées est ensuite traitee a l'aide de procédés connus, à condition que l'état hypertonique du solvant des cellules soit maintenu (dans le cas où elles sont en solution/suspension). Ainsi, la suspension est, par exemple, diluee dans une solution hypertonique, la suspension est mélangée, centrifugée et les agrégats remis en suspension dans le milieu hypertonique. EMI7.1 La suspension resultante est ensuite incubée ä une temerature de 20 ä 40oc, par exemple ä 37OC, pour permettre l'expression. La suspension est avantageusement aérée, par <Desc/Clms Page number 8> exemple ä l'aide d'un bain marie agité . Un temps d'incu- bation approprié est de 30 minutes ä 5 heures, mieux encore compris entre 2 et 4 heures, par exemple 3 heures. On peut ensuite placer des dilutions appropriées des cultures cellulaires ainsi obtenues dans des boites de Pétri pour déterminer les unités formant colonie (CFU). On peut déterminer la fréquence de transformation par des procédés connus employant des techniques standard, comme des boites de Pétri contenant un antibiotique, l'observation visuelle, etc. Le procédé de la présente invention permet la transformation de cellules de BT avec des rendements élevés. La transformation permet le clonage de gênes de bibliothèques de génomes dans des cellules de BT, le clonage et l'expression de genes de DET dans BT, le clonage et l'expression de gènes de DET modifies in vitro et in vivo dans BT, la synthèse de polypeptides utiles, etc. Lorsque les cellules de BT transformdes sont destinees ä etre utilisées comme pesticides biologiques, elles sont avantageusement employées sous forme de compositions insecticides, par exemple sous forme de suspensions concentrées ou sous forme de poudres. Ces compositions peuvent etre obtenues d'une manibre classique. Dans l'exemple non limitatif suivant, les produits de départ (cellules de BT et plasmide ADN) sont choisis de telle sorte que les résultats ne soient pas ambigus et ne puissent etre dus ä une interaction du plasmide ; les cellules de BT utilisees comme produit de départ ne contiennent pas de plasmides, le plasmide ADN utilisé comme agent de transformation encodant pour la résistance ä la tétracy- cline. On remarquera que d'autres cellules de BT et/ou d'ADN exogènes, en particulier un plasmide ADN, peuvent etre utilisées dans le procédé de l'invention avec des résultats analogues. <Desc/Clms Page number 9> Les températures sont exprimées en centigrades et les parties en poids, sauf indication contraire. Exemple Produits de depart Souche : Bacillus thurinctiensis. sous-espèce kurstaki HDl cry B (obtenue auprès de M.-M. Lecadet, Institut Pasteur, Paris), ne contenant pas de plasmides. ADN : pBC16. 1 (Kraft. J. et coll. (1978) Molec. gen. Genet. 162 ; 59-67), extrait de HD1 cry B (pBCl6. 1), dans lequel il a été introduit par conjugaison par adaptation cellulaire avec B. subtilis BD224 (pBC16. 1), codant pour la résistance ä la tétracycline. Milieux SA Trp : Milieu minimal spizizen (Spizizen J. (1958) Proc. natl. Acad. Sei. (Wash.) 44 ; 171-175) supplémenté par des Casaminoacides ä 1\ (Difco), 5 x 10-6M de MnSO4 et 20 g/ml de tryptophane. EMI9.1 <tb> <tb> Milieu <SEP> hypertonique <SEP> (MH) <SEP> : <tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 1,50 <SEP> g/l <tb> Peptone <SEP> 5,00 <SEP> g/l <tb> NaCl <SEP> 3, <SEP> 50 <SEP> g/l <SEP> <tb> Saccharose <SEP> 171, <SEP> 15 <SEP> g/l <SEP> <tb> Acide <SEP> maléfique <SEP> 2, <SEP> 32 <SEP> g/l <SEP> <tb> MgCl2,6H2O <SEP> 4,07 <SEP> g/l <tb> pH <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> <tb> Milieu <SEP> Luria <SEP> (LA) <SEP> : <SEP> <tb> Tryptone <SEP> 10 <SEP> g/l <tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5 <SEP> g/l <tb> NaCl <SEP> 10 <SEP> g/l <tb> Gelose <SEP> (Difco <SEP> Bacto) <SEP> 15 <SEP> g/1 <tb> Thymidine <SEP> 20 <SEP> mg/l <tb> Antibiotiques <SEP> : <SEP> Tétracycline, <SEP> 10-100 <SEP> g/ml <SEP> sur <SEP> des <tb> plaques <SEP> ä <SEP> milieu <SEP> Luria. <tb> Solutions <tb> SMM <SEP> : <SEP> <tb> <Desc/Clms Page number 10> EMI10.1 <tb> <tb> Saccharose <SEP> 171, <SEP> 15 <SEP> g/l <SEP> <tb> Acide <SEP> maléique <SEP> 2, <SEP> 32 <SEP> g/l <SEP> <tb> MgCl2,6H2O <SEP> 4,07 <SEP> g/l <tb> pH <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> <tb> PEG <SEP> : <tb> PEG <SEP> 6000 <SEP> 40 <SEP> 9 <tb> SMM <SEP> qsp <SEP> 100 <SEP> ml <tb> Lysozyme : 2 mg/ml dans MH, fraichement prépqaré. Procédé On prépare une culture d'une nuit de HD1 cry B dans 15 ml de SA Trp et on la fait croître sous aération ä 2Q C. La lendemain matin, la culture est diluée ä 50-100 fois dans un milieu MH préchauffé, jusqu'à une concentration cellulaire de depart de 7, 5 x 105 par millilitre. On ajoute 2 il de silicone pour empêcher le moussage. La culture croit 370C sous aération modérée pendant trois heures et demie, à savoir jusqu'à une concentration cellulaire de 2, 5 x 108 - 3 x 108 par ml. Le lysozyme est ajoute jusqu'à une concentration finale de 200 ug/ml et 1 ml de suspension cellulaire est incubé pendant 30 minutes ä 37OC, dans un bain marie agité (150 t/min) . La suspension cellulaire est ensuite centrifugée pendant une minute sous 10 000 G et les agrégats sont remis en suspension dans 1 ml de MH frais à la température ambiante. On ajoute 0, 5 ml de suspension cellulaire ä 50 l de SMM, auxquels ont té ajoutés 100 ng-10 lig de plasmide ADN. Les cellules sont transformées par addition de 1, 5 ml de solution de PEG, agitation modérée et incubation de 2 min. à la température ambiante. On ajoute 5 ml de MH à la suspension cellulaire, que l'on mélange doucement mais ä fond et que l'on centrifuge pendant 20 minutes sous 3000 G. On remet les agrégats en suspension dans 0, 6 ml de MH et on incube pendent 3 heures ä 370C dans un bain marie agité (150 t/m:in)pour permettre l'expression. On place les dilutions appropriées dans des boites ä longue durée d'action pour dé- <Desc/Clms Page number 11> terminer les CFU et dans des boîtes à longue durée d'action contenant de la tétracycline pour la selection. de la substance transformatrice. On obtient 1-2 x 103 substances transformatrices par ag de plasmide ADN intact, avec une fréquence de 5x10-5-10-4.
Claims (12)
- REVENDICATIONS 1. - procédé de transformation de cellules de Bacillus thuringiensis, caractérisé en ce qu'il comprend les etapes qui consistent : a) ä cultiver des cellules de Bacillus thuringiensis dans un milieu aqueux hypertonique, b) ä introduire dans la culture cellulaire obtenue dans l'étape a), et en présence de polyéthylène-glycol, de l'ADN exogène tout en maintenant l'etat hypertonique, et c) à isoler et ä remettre en suspension les cellules de Bacillus thuringiensis ainsi traitées dans un milieu aqueux hypertonique pour permettre l'expression.
- 2. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce. que llon traite la culture de cellules de Bacillus thuringiensis de l'étape a) avec des concentrations modérées de lysozyme, tout en maintenant les conditions hypertoniques, et en ce que l'on isole les cellules de Bacillus thuringiensis ainsi traitées et on les remet en suspension dans un milieu aqueux hypertonique avant le traitement selon les étapes b) et c).
- 3. - procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on obtient l'état hypertonique en employant des saccharides qui ne sont pas métabolises par Bacillus thuringiensis.
- 4. - procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'on emploie au moins 0, 4M de saccharides par litre de milieu aqueux.
- 5. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ä 4, caractérisé en ce que la concentration initiale en cellules de Bacillus thuringiensis introduite dans l'étape a) est de 104 ä 106 cellules par ml de milieu et en ce que les cellules sont cultivées jusqu'à une concentration de 108 ä un peu moins de 109 cellules par ml de milieu.
- 6. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 ä 5, caractérisé en ce que la concentration en lysozyme est de 20 ä 300 microgrammes par ml de milieu aqueux. <Desc/Clms Page number 13>
- 7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ä 6, caractérisé en ce que le milieu hypertonique a un pH dans l'intervalle de 6 à 8.
- 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ä 7, caractérisé en ce que le milieu hypertonique comprend un sel de magnesium.
- 9. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est réalisé ä une température comprise entre 20 et 40 C.
- 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérise en ce que l'on emploie 100 nanogrammes ä 20 microgrammes d'ADN pour 108 à 109 cellules de Bacillus thuringiensis.
- 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ä EMI13.1 10, caractérisé en ce que l'on emploie 100 & 400 g de poly- éthylène-glycol par litre de culture cellulaire.
- 12. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'on maintient l'état hypertonique de l'étape c) pendant 30 minutes ä 5 heures.
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