JPS6319151B2

JPS6319151B2 -

Info

Publication number: JPS6319151B2
Application number: JP11076280A
Authority: JP
Inventors: Hideo Misaki; Shigeru Ikuta; Kazuo Matsura
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1980-08-12
Filing date: 1980-08-12
Publication date: 1988-04-21
Also published as: JPS5758883A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なヌクレオサイド・オキシダー
ゼ（Nucleoside oxidase）およびその製造法に
関する。本発明者らは、兵庫県小野市のたまねぎ畑の土
壌より分離したシユードモナス（Pseudomonas）
属に属する細菌Ｂ―0781菌株が、その菌体内に、
少なくとも下記一般式〔〕（ただし式中、Baseとは核酸塩基残基を示す）
で表わされるヌクレオサイドに対して基質特異性
を有し、かつ少なくとも反応式〔〕および／ま
たは反応式〔〕で表わされる反応を触媒する作用を有する、少な
くともヌクレオサイドを基質としてその糖部分を
酸化せしめる反応において、酸素を消費し、過酸
化水素を生成する新規な酵素を見い出し、本酵素
をヌクレオサイド・オキシダーゼと命名した。まず、本酵素の基質特異性、酵素作用および活
性測定法について述べる。 (1) 基質特異性：下記第１表に示す種々の化合物（ヌクレオサイ
ド、核酸塩基、糖、ヌクレオチド）を基質として
（基質濃度は1mM）、その相対活性を測定した。
その結果は、第１表に示す通りで、本酵素は、ヌ
クレオサイドの糖部分に作用し、核酸塩基や糖単
独では作用せず、またヌクレオサイドの糖部分が
リボース、デオキシリボース、アラビノースでも
作用し、ヌクレオサイドの塩基部分は各種のもの
に作用する。またヌクレオチドに対しては作用し
ない。以上のことより本酵素は少なくとも一般式
〔〕で表わされるヌクレオサイドにその基質特
異性を有すると認められる。

【表】

【表】 (2) 酵素作用 (イ) 反応生成物の同定： 0.2Mジメチルグルタル酸―水酸化ナトリウム
緩衝液（PH6.0）10ml、アデノシン500mg、ヌクレ
オサイド・オキシダーゼ180U.、カタラーゼ
15000U.、蒸留水90mlよりなる反応液100mlを通
気撹拌せしめ、PH調整した（反応が進むにつれて
PH低下を生じ、酸性物質を生成していると認めら
れる）。反応を37℃、90分間行なつた後、塩酸を
加えてPH2.0となし、生じた沈澱物を遠心分離し
て回収し、さらにこれを塩酸水溶液（PH３）で洗
浄した。次いで洗浄後、これに1N水酸化ナトリ
ウム水溶液を添加してPH8.5となし溶解せしめ、
再び塩酸でPH３として沈澱せしめ、その結晶を回
収した。本結晶の元素分析値は、Ｃ＝42.62％、
Ｈ＝3.93％、Ｎ＝24.9％、Ｏ＝28.55％であり、そ
の分子量は281であり、その分子式はC₁₀H₁₁N₅O₅
であつた。また本結晶の赤外部吸収スペクトルお
よび紫外部吸収スペクトルにおいて、合成品たる
アデノシン―5′―カルボン酸と一致した。その結
果より、本酵素反応の最終生成物は、アデノシン
―5′―カルボン酸と同定された。 (ロ) 反応生成物の経時変化の薄層クロマトグラ
ム： 0.2Mジメチルグルタル酸―水酸化ナトリウム
緩衝液（PH6.0）10ml、10mMアデノシン５ml、
ヌクレオサイド・オキシダーゼ20U.、カタラー
ゼ1000U.、蒸留水45mlよりなる反応液60mlを37
℃にて反応せしめ、反応後０分、５分、10分、20
分、60分後の各時間毎に５mlずつ採取し、各々
100℃、２分間加熱処理した後限外過し、薄層
クロマトグラフイー用試料液とした。また薄層ク
ロマトグラフイーにおいては、シリカゲルを用
い、その展開溶媒として、アセトニトリル：0.1
％塩化アンモニウム水溶液＝７：３を用いた。さ
らにその際、標準試料として、アデノシン
（「Ad」にて示す）および合成品であるアデノシ
ン―5′―カルボン酸（「Ad―Ａ」にて示す）を用
いて薄層クロマトグラフイーを行なつた。その結果、第１図に示す通り、反応５〜10分後
において、アデノシンのリボースの5′位ヒドロキ
シメチル基がアルデヒド基に酸化されたものと認
められるスポツトが認められ、さらに反応によ
り、すみやかにカルボキシル基に酸化されたもの
で、合成品であるアルデノシン―5′―カルボン酸
と同一位置にスポツトを示す最終生成物を生じた
ものと認められた。 (ハ) 反応系の酸素消費量、過酸化水素発生量： 0.2Mジメチルグルタル酸―水酸化ナトリウム
緩衝液（PH6.0）0.4ml、0.2％Ｎ、Ｎ―ジエチチル
―ｍ―トルイジン0.1ml、0.3％４―アミノアンチ
ピリン0.1ml、ペルオキシダーゼ（50U.／ml）0.1
ml、10mMアデノシン0.05ml、蒸留水0.25mlより
なる反応液1.0mlを用い、ヌクレオサイド・オキ
シダーゼ3U.を添加して、このときに消費される
酸素量（酸素電極にて測定）および発生する過酸
化水素量（活性測定法に記載の比色法に基く波長
545nmにおける吸光度にて測定）を測定した。そ
の結果、アデノシン0.05μモルより酸素消費量
0.097μモル、過酸化水素発生量0.101μモルであ
り、これより１モルのアデノシンより２分子の酸
素が消費され、２分子の過酸化水素が発生すると
認められた。 (ニ) アンモニア成分：本反応系において、アンモニア成分は検出され
なかつた。以上のことより、本酵素はアデノシンよりアデ
ノシン―5′―アルデヒドを経てアデノシン―5′―
カルボン酸を生ずる反応を触媒する作用を有す
る。またその反応式を示せば次の通りである。以上の結果、本酵素は第１表に示す種々のヌク
レオサイドに作用することから、一般式〔〕で
表わされるヌクレオサイドにその基質特異性を有
するもので、明らかに本酵素は少なくとも反応式
〔〕および／または反応式〔〕で表わされる
反応を触媒する作用を有すると認められ、従来に
全く報告されたことのない酵素作用および基質特
異性を示す新規な酵素と認められる。また本酵素の酵素作用の反応式〔〕および反
応式〔〕は、下記一般式〔〕（ただし式中、Baseとは核酸塩基を示す）で
表わされる反応を行なうものとして表現すること
ができるものである。 (3) 活性測定法： 0.2Mジメチルグルタル酸―水酸化ナトリウム
緩衝液（PH6.0）0.2ml、0.2％Ｎ、Ｎ―ジエチル―
ｍ―トルイジン0.05ml、0.3％４―アミノアンチ
ピリン0.05ml、ペルオキシダーゼ（50U.／ml）
0.05ml、10mMアデノシン0.05mlおよび蒸留水
0.10mlよりなる反応液0.5mlを小試験管にとり、
37℃で３分間予備加温した後、20μの酵素液を
添加して反応を開始する。正確に10分間、37℃で
反応を行なつた後、0.5mlの4M尿素液（0.2％セ
チルピリジニウムクロライド含有）を添加して反
応を停止する。次いでこれに2.0mlの蒸留水を加
えた後、５分以内に、層長1.0cmのセルを用いて
波長545nmにおける吸光度を測定する（A_S）。ま
た盲検として、酵素液の代りに蒸留水20μを用
いて、以下同一の操作を行なつて吸光度を測定す
る（A_B）。この酵素液使用の吸光度（A_S）と盲検
の吸光度（A_B）の吸光光差（A_S―A_B）より酵素
活性を求める。なお、A_S値が0.15以下の範囲内で
活性測定を行ない、それより高い値を示したとき
は酵素液を稀釈して同一反応を行なう。酵素活性１単位（1U.）は、アデノシンを基質
として37℃で反応を行なつた場合、１分間に1μ
モルの過酸化水素を発生する酵素量とし、計算式
は下記の通りである。酵素活性（U.／ml）＝1.25×（A_S―A_B）×稀釈倍率さらに本発明の新規なヌクレオサイド・オキシ
ダーゼに関して限定するものではないが、以下に
そのKm値、等電点、分子量、至適PH、PH安定性、
至適温度、熱安定性、金属イオン等の影響、界面
活性剤の影響について述べる。・Km値 4.5×10^-5M（アデノシンに対して）・等電点 PH4.7付近（キヤリア―アンホライトを用いた
電気泳動法にて）・分子量約24万（セフアロースCL―6B：フアルマシア
社製）・至適PH 第２図に示す通りで、図中、〇―〇はグリシン
―塩酸緩衝液（40mM）、●―●はジメチルグル
タル酸―水酸化ナトリウム緩衝液（40mM）、△
―△はリン酸緩衝液（40mM）の使用緩衝液を示
し、その酸素消費量を酸素電極により求めた。そ
の結果、用いる緩衝液により活性に差が認められ
るものの、その至適PHは５〜６（グリシン―塩酸
緩衝液にて）と認められた。・至適温度第３図に示す通りで、各温度条件にて反応せし
め、その活性測定法に基いて残存活性を求めた。
その結果、本酵素の至適温度は45〜55℃と認めら
れた。・熱安定性第４図に示す通りで、リン酸緩衝液（PH6.0、
40mM）にて10分間処理した後その活性測定法に
基いて残存活性を求めた。その結果、その熱安定
性において、本酵素は60℃で10分間まで安定であ
つた。・PH安定性第５図に示す通りで、図中、〇―〇はブライト
ロン―ロビンソン（Britton―Robinson）緩衝液
（150mM）、●―●はジメチルグルタル酸―水酸
化ナトリウム緩衝液（150mM）、△―△はリン酸
緩衝液（150mM）、▲―▲はトリス―塩酸緩衝液
（150mM）の使用緩衝液を示し、各緩衝液にて37
℃、60分間処理した後、各々40倍希釈し、その
20μを用いて活性測定法に基いてその残存活性
を求めた。その結果、そのPH安定性において、本
酵素はPH８〜９で安定であつた。・金属イオン等の影響種々の金属イオン等による本酵素の活性への影
響に関しては、第２表に示す通りであつた。

【表】・界面活性剤の影響
種々の界面活性剤による本酵素の活性への影響
に関しては、第３表に示す通りであつた。

【表】また前記の細菌Ｂ―0781菌株の肉眼的および顕
微鏡的観察に基く各種培地上における培養の特徴
は、次に記載する通りである。Ａ肉眼的観察 30℃、18〜24時間培養の結果、次の通りであ
る。普通寒天斜面培地線状に生育し、淡黄灰色〜灰白色を呈する。可
溶性色素は産生しない。普通寒天平板培地円形で周囲はなめらかな丘状の集落を形成し、
半光沢で、淡黄灰色〜灰白色を呈する。可溶性色
素は産生しない。液体培地一様に混濁後沈澱する。うすい菌膜を形成する
が軽い振盪で容易に壊れる。ゼラチン高層培地せん刺線に沿つて生育する。ゼラチンを加水分
解しない。 BCPミルク培地弱アルカリになる。ペプトン化はしない。嫌気性生育生育しない。Ｂ顕微鏡的観察まつすぐ、またはやや曲つた桿菌で、単独、二
連、または短連鎖し、極毛で運動する。大きさは
0.5×1.0〜1.5μで、芽胞は形成しない。多形性な
し。Ｃ生理的、生化学的特徴グラム染色 − 抗酸性染色 − OFテスト０カタラーゼ産生＋オキシダーゼ産生＋ウレアーゼ産生 SSR培地 − クリステンゼン培地＋ゼラチンの加水分解 − デンプンの加水分解 − カゼインの加水分解 − エスクリンの加水分解 − セルロースの加水分解 − アルギニンの加水分解＋ポリーβ―ハイドロキシブチレイトの蓄積− インドールの産生 − H₂Sの産生＋アセトインの産生 − 硝酸塩の還元 − 脱窒反応 − クエン酸塩の利用＋ DNAのGC含量 59％糖より酸の産生

【表】

【表】生育PH範囲：PH4.5〜9.0 〓〓生育温度範囲：10〜37℃ アンモニア態窒素の利用＋〓〓硝酸態窒素の利用＋本細菌Ｂ―0781菌株の上記諸性状を、バージー
ス・マヌアル・オブ・デイタミネイテイブ・バク
テリオロジイー（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology）第８版、1974お
よび医学細菌同定の手引、1974（坂崎利一訳）に
対比して同定を行なつた。本菌株は、グラム陰
性、カタラーゼ・オキシダーゼ産生の陽性、グル
コースを酸化的に分解し、極毛で運動する桿菌
で、PH7.0普通寒天（斜面）培地によく生育する
特徴を有するもので、シユードモナス属と一致す
ると認められた。さらに詳しく対比した結果、本
菌株はシユードモナス・プチダ（Pseudomonas
Putida）とよく一致するものと認められた。

【表】

【表】以上のことから本菌株をシユードモナス・プチ
ダ・Ｂ―0781（Pseudomonas putida Ｂ―0781）
と同定命名した（工業技術院生物工業技術研究
所、微生物受託番号通知書微生物受託番号微
工研菌寄第5664号 FERM―ＰNo.5664）。本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
で、少なくとも一般式〔〕で表わされるヌクレ
オサイドに対して基質特異性を有し、酵素作用と
して少なくとも反応式〔〕および／または反応
式〔〕で表わされる反応を触媒する作用を有
し、下記の理化学的性質を有する新規なヌクレオ
サイド・オキシダーゼ、・Km：4.7×10^-5M（アデノシンに対して）、・等電点：PH4.5付近（キヤリアーアンホライト
を用いた電気泳動法にて）、・分子量：約24万（セフアロースCL―6Bによる
ゲル過法）、・至適PH：PH５〜６・至適温度：45〜55℃ ・熱安定性：60℃、10分まで安定である。・PH安定性：PH８〜９で安定である。およびシユードモナス属に属する該ヌクレオサイ
ド・オキシダーゼ生産菌を培地に培養し、その培
養物より該ヌクレオサイド・オキシダーゼを採取
することを特徴とする新規な該ヌクレオサイド・
オキシダーゼの製造法である。本発明における新規なヌクレオサイド・オキシ
ダーゼとしては、前記の基質特異性および酵素作
用を有するものであればよく、その分子量、Km
値、金属イオンや界面活性剤の影響などの多少の
相異を示すものであつても、本発明に係るヌクレ
オサイド・オキシダーゼとして認められる酵素は
全て本発明に包含されるものである。また本発明の製造法における使用菌としては、
前記の菌株はその一例であつて、シユードモナス
属に属するヌクレオサイド・オキシダーゼ生産菌
であれば全て本発明において使用できる。もちろ
ん、微生物は、自然的、人工的に変異を起しやす
く、これらの変異株であつてもヌクレオサイド・
オキシダーゼ生産能を失わない限り本発明に使用
できるもので、さらに本発明のヌクレオサイド・
オキシダーゼ生産能の遺伝子的特徴を形質転換手
段などにて利用せしめてなる他の生産手段を用い
てなるヌクレオサイド・オキシダーゼも本発明に
包含されるものである。本発明を実施するに当つて、シユードモナス属
に属するヌクレオサイド・オキシダーゼ生産菌に
ついて例示すれば、シユードモナス・プチダ・Ｂ
―0781菌株が挙られ、これら菌株を抗生物質、酵
素などを生産する通常の方法で培養する。培養の
形態としては、液体培養でも固体培養でもよく、
工業的にはヌクレオサイド・オキシダーゼ生産菌
の細胞をその生産用培地に接種し、通気撹拌培養
を行なうのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用される。窒素源としては
利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコー
ン・スチーブ・リカー、大豆粉、カゼイン、ペプ
トン、酵母エキス、種々の肉エキス、硫安、塩化
アンモニウムなどが使用される。炭素源としては
同化可能な炭素化合物であればよく、例えば高級
脂肪酸、糖蜜、ブドウ糖、スターチ加水分解物な
どが使用される。その他、食塩、塩化カリウム、
硫酸マグネシウム、リン酸第一カリウム、リン酸
第二カリウムなどが必要に応じて使用される。特
にオレイン酸やパルミチン酸などの高級脂肪酸を
培地中に0.5〜１％程度添加せしめてヌクレオサ
イド・オキシダーゼの生産性を改善せしめること
が好ましい。培養温度は菌が発育し、ヌクレオサイド・オキ
シダーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、
通常25〜35℃である。培養時間は、条件によつて
多少異なるが、通常15〜50時間程度であつて、ヌ
クレオサイド・オキシダーゼが最高力価に達する
時期をみはからつて適当な時期に培養を終了すれ
ばよい。かくして得られたヌクレオサイド・オキシダー
ゼ生産菌の培養物中において、ヌクレオサイド・
オキシダーゼは、主にその菌体内に含有、蓄積さ
れている。この様にして得られた培養物よりヌクレオサイ
ド・オキシダーゼを抽出するに当り、例示すれば
まず培養物を固液分離し、得られる湿潤菌体を、
リン酸緩衝液やトリスー塩酸緩衝液などの溶液に
分散せしめ、リゾチーム処理、超音波処理、フレ
ンチプレス処理など種々の菌体処理手段を適宜選
択組合せて粗製のヌクレオサイド・オキシダーゼ
含有液を得る。次いでこの粗製のヌクレオサイド・オキシダー
ゼ含有液は、さらに公知の蛋白質や酵素などの単
離、精製手段を用いて精製されたヌクレオサイ
ド・オキシダーゼを得る。例えば、粗製のヌクレ
オサイド・オキシダーゼ含有液に、アセトン、メ
タノール、エタノールやイソプロパノールなどの
有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩や硫酸ア
ルミニウムなどによる塩析法などを用いて沈澱せ
しめ、回収すればよい。さらにこの沈澱物ば、電
気泳動法などにて単一の帯を示すまで精製すれば
よく、その精製手段としては、例えば上記の沈澱
物をリン酸緩衝液などの媒体に溶解し、これを、
ジエチルアミノエチルデキストランゲル、ジエチ
ルアミノエチルセルロース、トリエチルアミノエ
チルデキストランゲルなどのイオン交換樹脂、デ
キストランゲル、ポリアクリルアマイドゲルなど
のゲル過剤によるクロマトグラフイーを行なえ
ばよく、またこれらの手段を適宜組合せて精製す
ればよく、次いでこれを凍結乾燥手段などにより
乾燥してヌクレオサイド・オキシダーゼの精製粉
末を得る。以上の通り、本発明のヌクレオサイド・オキシ
ダーゼは、全く新規な基質特異性および酵素作用
を有する新規酵素であり、本酵素は種々の有用性
を有するものである。例えば、ヌクレオサイドを
基質とする反応系または生成する反応系における
各成分の測定のための試薬、例示すれば、プリン
ヌクレオサイドを基質とするプリンヌクレオサイ
ドホスホリラーゼ（Purine nucleoside
phosphorylase）の反応系における反応後の残存
プリンヌクレオサイドの定量用酵素として使用で
き、またはこのプリンヌクレオサイドの定量に基
くプリンヌクレオサイドホスホリラーゼ活性測定
用酵素としても使用でき、またアデノシンを基質
とするアデノシンキナーゼ（Adenosine kinase）
の反応系におけるアデノシンキナーゼ活性測定用
酵素として使用でき、さらにリボヌクレアーゼ活
性測定用酵素として利用でき、種々のヌクレオサ
イドの定量用酵素、種々のヌクレオサイドを基質
とする反応系または生成する反応系の酵素活性測
定用酵素として広く利用されるもので、全く新規
な反応系に基く種々測定法をなし得るもので、ま
たこの測定法に基く種々の臨床診断用として有用
なものである。さらに、本酵素はヌクレオサイド
より著しく簡便にヌクレオサイド―5′―カルボン
酸を生成せしめるもので、ヌクレオサイド―5′―
カルボン酸の製造用酵素として有用なものであ
る。さらに本酵素を利用するに当つて、特にその
測定法においては、本酵素の酵素作用の反応式
〔〕および／または反応式〔〕、または反応式
〔〕に基く消費される酸素量または生成される
過酸化水素量に基いて行なうことが簡便であり、
好ましくは酸素量の測定に関しては酸素電極が用
いられ、過酸化水素量の測定に関しては過酸化水
素電極やフエノール、４―アミノアンチピリン、
ペルオキシダーゼ系試薬、フエノール、４―アミ
ノフエナゾーン、ペルオキシダーゼ系試薬、Ｎ、
N′―ジエチル―ｍ―トルイジン、４―アミノア
ンチピリン、ペルオキシダーゼ系試薬などの過酸
化水素定量用呈色試薬、その他過酸化水素定量用
螢光試薬を用いて行なえばよい。またこれらの
種々利用の際に、適宜ヌクレオサイド・オキシダ
ーゼは、公知の種々の固定化酵素の手段を用いて
固定せしめて利用してもよい。次いで本発明の実施例を挙げるが、本発明は何
んらこれによつて限定されるものではない。実施例１ペプトン1.0％、カゼイン1.0％、オレイン酸1.0
％、酵母エキス粉末0.5％、KC10.2％、K₂HPO₄
0.1％、MgSO₄・7H₂O 0.05％よりなる培地（PH
7.0）（120℃、20分間滅菌処理）100mlを有する三
角フラスコに、シユードモナス・プチダ・Ｂ―
0781菌株を接種し、30℃、１日間培養して種菌を
得た。次いでこの種菌を、上記と同一組成よりな
る培地（デスフオームBC―51Yを0.1％含有）20
を有する30用ジヤーフアーメンターに移植
し、30℃、42時間、350rpm、通気量20／分の
滅菌空気の条件下通気撹拌培養した。培養終了
後、培養物を5000rpmにて10分間遠心分離して集
菌し、この菌体を７の水で洗浄後さらに
5000rpm、10分間遠心して菌体を回収した。次い
でこの菌体を、５の10mMEDTA含有20mMリ
ン酸緩衝液（PH7.0）に分散せしめ、リゾチーム
濃度0.5mg／mlになるようにリゾチームを添加し、
37℃、５時間撹拌して菌体を破壊せしめた。その
後、これを5000rpm、10分間遠心分離して不溶物
を除去して、その上清4.2を得た（2.86U.／
ml）。次いでこの上清液に、冷アセトン（−20℃）
2.5を添加し、5000rpm、10分間遠心分離して、
その上清を得た（11150U.）。さらにこの上清液
に、冷アセトン2.5を添加し、5000rpm、10分
間遠心分離して、その上清を除去し、沈澱物を回
収した。得られた沈澱物を、20mMリン酸緩衝液
（PH7.0）1.0に溶解した後、5000rpm、15分間遠
心して不溶物を除去した後その上清（9700U.）
を50℃、20分間熱処理し、15000rpm、10分間遠
心して熱変性蛋白を除去して上清を得た
（9400U.）。次いでこの上清液に、0.42飽和となる
ように硫安を添加（319ｇ）した後15000rpm、10
分間遠心して沈澱物を除去し、さらにこれに140
ｇの硫安を添加して、その沈澱物を回収した。次
いでこの沈澱物を、50mlの20mMリン酸緩衝液
（PH7.5）に溶解し、15000rpm、10分間遠心して
不溶物を除去してその上清を得（7800U.）、これ
を20mMリン酸緩衝液に対して一夜セロフアンチ
ユーブにて透析せしめた。さらにその透析後、
20mMトリス―塩酸緩衝液（PH7.5）にて平衝化
したDEAE―セルロース（セルバー社製）のカラ
ム（2.6×60cm）にチヤージせしめ、０〜
0.5MKC1含有20mMトリス―塩酸緩衝液（PH7.5）
のKC1直線濃度勾配にて溶出せしめ、その0.15〜
0.25MKC1濃度での溶出区分を回収し（5760U.）、
さらにこれをアミコンPM―10にて濃縮した。そ
の後この濃縮液を、セフアクリルＳ―200（フアル
マシア社製）のカラム（2.6×90cm）にチヤージ
して、その活性区分（280nm吸収区分で、かつそ
の酵素活性区分を回収）を、これを併合した後、
凍結乾燥して、精製したヌクレオサイド・オキシ
ダーゼ粉末51.0mg（3675U.）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のヌクレオサイド・オキシダー
ゼを用いた反応生成物の経時変化の薄層クロマト
グラムで、そのAdは標準試料としてのアデノシ
ンを示し、そのAd―Ａは標準試料としての合成
品であるアデノシン―5′―カルボン酸を示し、第
２図はヌクレオサイド・オキシダーゼの至適PHの
曲線を示し、第３図はヌクレオサイド・オキシダ
ーゼの至適温度の曲線を示し、第４図はヌクレオ
サイド・オキシダーゼの熱安定性の曲線を示し、
第５図はヌクレオサイド・オキシダーゼのPH安定
性の曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１少なくとも下記の基質特異性、酵素作用、Km
値、等電点、分子量、至適PH、至適温度、熱安定
性、PH安定性の理化学的性質を有してなる新規な
ヌクレオサイド・オキシダーゼ・基質特異性：少なくとも下記一般式〔〕で表
わされるヌクレオサイドに対して基質特異性を
有する。（ただし式中、Baseとは核酸塩基残基を示す）。・酵素作用：少なくとも反応式〔〕および／ま
たは反応式〔〕で表わされる反応を触媒する
作用を有する。・Km値：4.7×10^-5M（アデノシンに対して）・等電点：PH4.5付近（キアリア―アンホライト
を用いた電気泳動法にて）、・分子量：約24万（セフアロースCL―6Bによる
ゲル過法）、・至適PH：PH５〜６・至適温度：45〜55℃ ・熱安定性：60℃、10分まで安定である。・PH安定性：PH８〜９で安定である。２シユードモナス属に属する少なくとも下記の
基質特異性、酵素作用、Km値、等電点、分子量、
至適PH、至適温度、熱安定性、PH安定性の理化学
的性質を有するヌクレオサイド・オキシダーゼ生
産菌を培地に培養し、その培養物より該ヌクレオ
サイド・オキシダーゼを採取することを特徴とす
る新規な該ヌクレオサイド・オキシダーゼの製造
法。・基質特異性：少なくとも下記一般式〔〕で表
わされるヌクレオサイドに対して基質特異性を
有する。（ただし式中、Baseとは核酸塩基残基を示す）・酵素作用：少なくとも反応式〔〕および／ま
たは反応式〔〕で表わされる反応を触媒する
作用を有する。・Km値：4.7×10^-5M（アデノシンに対して）、・等電点：PH4.5付近（キヤリア―アンホライト
を用いた電気泳動法にて）、・分子量：約24万（セフアロースCL―6Bによる
過法）、・至適PH：PH５〜６・至適温度：45〜55℃ ・熱安定性：60℃、10分まで安定である。・PH安定性：PH８〜９で安定である。３シユードモナス属に属するヌクレオサイド・
オキシダーゼ生産菌が、シユードモナス・プチ
ダ・Ｂ―0781菌株である特許請求の範囲第２項記
載の新規なヌクレオサイド・オキシダーゼの製造
法。