JPS63196274A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 この発明は、細胞培養用基材に関する。さらに詳細には
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。

〈従来の技術および発明が解決しようとする問題点〉 近年、生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により
を用な生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、イ
ンターフェロン等を生産する研究が活発に行われている
。

このような方法において、従来、接着性動物細胞の培養
は、ガラス、プラスチック製のシャーレ、試験管・培養
ビンなどを用いて行なわれてきた。

また・最近、マイクロキャリアや中空糸を培養用基材と
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養用基材上に
接着させ、増殖させるには、該基材表面と細胞の接着性
が良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、
細胞の伸展、増殖に有効な形態になっていることが必要
である。

しかしながら、従来から細胞培養用基材として用いられ
ている高分子材料は賦形性、耐久性に優れるものの、上
記接着性等の点に関して不適当であり、高密度かつ長期
間の細胞培養を行なうことができず、いずれも十分な成
果を上げるに至っていない。

この点を改善するため、生体高分子であるコラーゲンや
その変性物であるゼラチンを高分子材料上に塗布したも
の（特開昭５８−７１８８４号公報参照）や、高分子材
料上に可溶性フィブロインの架橋体を形成した細胞培養
床（特開昭８１−５２２８０号公報参照）が提案されて
いる。

しかしながら、上記の高分子材料に天然高分子を複合化
した細胞培養用基材にあっては、細胞の接着性並びに接
着した細胞の伸展性、増殖性および活性維持が未だ十分
でないという問題がある。

く目　的〉 この発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、細
胞との接着性並びに細胞の伸展、増殖および活性維持に
優れ、高密度、長期間の培養を可能ならしめる細胞培養
用基材を提供することを目的とする。

く問題点を解決するための手段および作用〉上記目的を
達成するためになされた、この発明の細胞培養用基材は
、高分子材料からなる基材の表面上にオリゴ糖が担持さ
れていることを特徴とするものである。

なお、上記高分子材料は、化学的、物理的に表面処理さ
れているものや、多孔質材料であるのが好ましい。また
、上記基材が中空糸であるものが好ましい。さらには、
基材上にオリゴ糖が部分的に担持されているのが好まし
く、特に、格子模様、縞模様、水玉模様等に担持されて
いるものが好ましい。

上記の構成において、オリゴ糖とは２〜６個の単糖単位
がグリコシド結合でつながった三糖類から六糖類を意味
し、例えば、マルトース、セロビオース、ラクトース、
コンドロジン、スクロース、キシロビオース、セロトリ
オース、マルトリオース、ラフィノース、マルトテトラ
オース、スタキオース、ベルバスコース等が挙げられ、
これらオリゴ糖は細胞との親和性に優れるという特性を
有する。すなわち、細胞表面の細胞膜の構造は、脂質二
重層の中に、膜内粒子と呼ばれる各種の糖蛋白質、糖脂
質等が分布をもって埋めこまれており、これらが、上記
脂質二重層の中を自由に移動でき細胞の接着に関与して
いる。上記オリゴ糖は、膜内粒子とイオン結合、疎水結
合等により結合可能な部位を有するので、細胞との親和
性が高いと共に細胞を安定した形態、配置で保持するこ
とができる。従って、オリゴ糖が担持された本発明の細
胞培養用基材は、オリゴ糖が細胞と基材とを結ぶ役割を
果たしており細胞の接着性に優れると共に細胞がその高
次構造を損なうことなく安定した形態、配置で接着する
ことができるので、細胞の伸展、増殖が害されることが
ない。特に、ラクトースは肝細胞の接着に有効である。

なお、上記高分子材料が、化学的、物理的に表面処理さ
れているものは、オリゴ糖と基材との接着性に優れてい
る。また、上記高分子材料が、多孔質材料であるときは
、多孔質材料の孔を通じて物質代謝が容易となり長期に
亘り細胞培養することができる。特に、前記高分子材料
からなる基材が中空糸であるものは、中空部内や中空糸
の外側に培養液等を潅流することにより、中空糸上に細
胞を高密度に育成、増殖させることができる。

また、基材上にオリゴ糖が部分的に担持されているもの
、特に、格子模様、縞模様、水玉模様等にオリゴ糖が担
持されているものは、接着する細胞の位置を調整でき、
細胞が所定の間隔をもって接告するので・細胞との接着
がさらに安定化し、細胞の伸展、増殖をより一層増大さ
せることができる。

以下、この発明の詳細な説明する。

この発明の細胞培養用基材は、高分子材料からなる基材
と、この基材に担持されるオリゴ糖とからなる。

上記高分子材料としては、賦形性、機械的強度を有する
ものであればいかなるものでも使用でき、例えば、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレン、アイ
オノマー等のオレフィン系重合体、ポリテトラフルオロ
エチレン、ポリフッ化ビニリデン等のフッ素系樹脂、ポ
リスチレン等のスチレン系樹脂、ポリメチルメタクリレ
ート等のアクリル系樹脂、ポリビニルアルコール、ポリ
酢酸ビニル、ポリビニルアセタール、ポリアクリロニト
リル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリカー
ボネート、ボリアリレート、ポリフェニレンオキサイド
、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタ
レート等のポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアミ
ド、ポリイミド、ポリスルホン、セルロース系樹脂、シ
リコーン樹脂、ポリウレタンなどの種々の重合体もしく
は共重合体またはそれらのブレンド物が例示できる。

上記高分子材料からなる基材は、種々の形態に形成でき
、例えば、シャーレ、フラスコ等の成形品の他、フィル
ム、チューブ、中空糸、繊維、微粒子等の形態が例示で
きる。これらの形態のうち、長期に亘り細胞培養を行な
うには、物質代謝を容易にする孔を有する多孔質高分子
材料が好ましく、また、高密度培養を行なうには、チュ
ーブ、中空糸の形状が好適である。特に、物質代謝が容
易で、高密度培養を長期に亘り行なえる多孔質高分子材
料からなる中空糸が好ましい。この中空糸を用いるとき
、培養液を、中空糸の中空部または外側に湾流させ、必
要に応じて炭酸ガスや空気等を上記中空糸の中空部等に
送ることにより、細胞を中空糸上で育成し、増殖させる
ことができる。なお、前記中空糸としては、種々の大き
さのものが使用でき、例えば、内径５０〜１０００μｍ
程度のもの・が用いられる。

また、この発明の細胞培養用基材をマイクロキャリアー
法のビーズ担体として使用する場合には、前記高分子材
料は１００〜３００μｍ程度の粒径のものが用いられる
。

上記高分子材料からなる基材は、未処理のものであって
もよいが、オリゴ糖との接着性をよくするため、物理的
または化学的に処理されていてもよい。上記処理として
は、プラズマ処理、紫外線（レーザも含む）、電子線、
α線、β線、γ線等の照射による放射線処理、イオンス
パッタリングによるイオン処理、オゾン雰囲気下でのオ
ゾン処理、あるいは過酸化水素、過硫酸カリウム、クロ
ム酸塩等による酸化、ニトロ化し還元するアミノ基の導
入、クロロスルホン酸によるスルホン化などの化学処理
が挙げられ、オリゴ糖と基材との濡れ性が改善され、接
着性が向上する。また、上記の表面処理の内、レーザに
よる処理は、基材を化学的に改質できる他、基材表面を
微細な凹凸状に加工する物理的改質もできるので、細胞
の物質代謝をも促進できるという利点がある。

この発明の細胞培養用基材は、高分子材料からなる基材
にオリゴ糖を担持することにより得られ、例えば、必要
に応じて、物理的または化学的に前処理された高分子材
料を、オリゴ糖を水溶性接着剤溶液に分散し、該溶液を
基材上に塗布した後、乾燥することにより得られる。ま
た、基材がアミノ基を有する場合には、オリゴ糖の水酸
基を酸化し、基材のアミノ基と結合させることによって
も担持することができる。

上記オリゴ糖の担持は、単分子層、多分子層のいずれで
もよく、また基材表面の全面に担持してもよいが、基材
表面に部分的に、特にパターン化して担持したものが好
ましく、このようにパターン化して担持することにより
、基材上に接着する細胞の配置を制御でき、ひいては細
胞の接着性が安定化し、細胞の伸展、増殖および機能発
現を有利にすることができる。さらに、オリゴ糖を上記
のように部分的に担持する場合、特に、格子状、縞模様
、水玉模様等の微細模様に担持することにより、上記効
果をさらに増進できる有用な表面を形成することができ
る。基材上にオリゴ糖をパターン化して担持するには、
例えば、スクリーン印刷等の技術を応用して行なうこと
ができる。

この発明の細胞培養用基材は、種々の細胞の培養に使用
することができ、細胞の種類は特に限定されないが、肝
細胞が特に例示される。

また、この発明の細胞培養用基材を用いて動物細胞を培
養する場合、培養する細胞の種類に応じて種々の培養液
が用いられ、細胞の増殖に適した至適温度、ｐＨ等の条
件で培養が行なわれる。

〈実施例〉 以下に、実施例に基づいて、この発明をより詳細に説明
する。

実施例および比較例 四弗化エチレン樹脂多孔質フィルム（住友電気工業■製
、フロロボアＦＰ−０２２）をアンモニアガス雰囲気中
でプラズマ処理した。この時の放電出力は７０Ｗ１圧力
は０．３Ｔｏｒｒ　ｓアンモニアガス流量は７　ｃｃ／
分、処理時間は１０分間であった。処理したフィルムを
吸引式濾過ホルダーに装着した後、ラクトースの１０％
水溶液をホルダー中に入れ、１０分間真空吸引した。フ
ィルムをホルダーからとりはずし、乾燥後、４５ｍｍφ
ガラスシャーレにセットし、高圧蒸気滅菌した。次に、
０．０５％コラゲナーゼ潅流法により調整したラット分
離肝細胞を２×１０４個／ｊ播種し、６時間培養した。

培養液は、イーグルＭＥＭ培地に１０％牛脂児血清を添
加したものを用い、培養条件は、５％炭酸ガス、９５％
空気雰囲気、３７℃でインキュベートした。培養後、シ
ャーレから培養液を除き、リン酸緩衝生理食塩水により
洗浄した後、０．１％コラゲナーゼ溶液で接着細胞を遊
離せしめ、血球計算盤を用いて細胞数を測定した。この
結果、ラクトースで表面コーティングされたフィルム上
には、播種した細胞の５２％が接着していた。

一方、比較例として、多孔質フィルムをそのまま用いて
、同一の培養試験を行なったときの接着率は２％であっ
た。

〈発明の効果〉 以上のように、この発明の細胞培養用基材によれば、高
分子基材の表面上に、オリゴ糖が担持されており、オリ
ゴ糖は細胞との親和性に優れ、接着性を高めることがで
きると共に細胞を伸展、増殖に適した形態、配列で接着
させることができるので、高密度かつ長期間の細胞培養
が可能となる。

さらに、部分的に、特にパターン化してオリゴ糖が担持
された基材にあっては、細胞の接着位置を制御できるの
で、接着した細胞の伸展、増殖を一層高めることができ
るという特有の効果を奏する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、高分子材料からなる基材の表面上に、オリゴ糖が担
   持されていることを特徴とする細胞培養用基材。 ２、高分子材料が、化学的または物理的に表面処理され
   ている上記特許請求の範囲第１項記載の細胞培養用基材
   。 ３、高分子材料が、多孔質材料である上記特許請求の範
   囲第１項または第２項記載の細胞培養用基材。 ４、基材が、中空糸である上記特許請求の範囲第１項な
   いし第３項のいずれかに記載の細胞培養用基材。 ５、基材の表面上に、オリゴ糖が部分的に担持されてい
   る上記特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに
   記載の細胞培養用基材。 ６、オリゴ糖が、格子模様に担持されている上記特許請
   求の範囲第５項記載の細胞培養用基材。 ７、オリゴ糖が、縞模様に担持されている上記特許請求
   の範囲第５項記載の細胞培養用基材。 ８、オリゴ糖が、水玉模様に担持されている上記特許請
   求の範囲第５項記載の細胞培養用基材。