JPS63196272A - 細胞培養用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 く産業上の利用分野〉 この発明は、細胞培養用基材に関する。さらに詳細には
、動物細胞を培養するために使用される細胞培養用基材
に関するものである。

く従来の技術〉 近年、生物の細胞を培養し、その細胞の代謝活動により
有用な生理活性物質、例えば、ワクチン、ホルモン、イ
ンターフェロン等を生産する研究が活発に行われている
。

このような方法において、従来、接着性動物細胞の培養
は、ガラス、プラスチック製のシャーレ、試験管、培養
ビンなどを用いて行なわれてきた。

また、最近、マイクロキャリアや中空糸を培養用基材と
して用い、より高密度の培養や、長期の培養を行なう試
みがなされつつある。接着性動物細胞を培養周基村上に
接着させ、増殖させるには、該基材表面と細胞の接着性
が良好であることと共に接着した細胞の形態、配列が、
細胞の伸展、増殖に有効な形態になっていることが必要
である。

しかしながら、従来から細胞培養用基材として用いられ
ている高分子材料は賦形性、耐久性に優れるものの、上
記接着性等の点に関して不適当であり、高密度かつ長期
間の細胞培養を行なうことができず、いずれも十分な成
果を上げるに至っていない。

一方、糖、蛋白質、脂質およびこれらの複合化合物は、
細胞の接着に関与することが知られている。高分子材料
上に、これらの物質をコーティングして培養用基材とす
る試みがあり、既にコラーゲンやその変性物であるゼラ
チンを塗布した培養用シャーレが市販されている他、可
溶性フィブロインの架橋体が積層された細胞培養床（特
開昭６１−５２２８０号公報参照）が提案されている。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、上記の従来技術は、第１に高分子基材へ
の糖蛋白質等の固定が十分でな（容易に脱離してしまう
こと、第２に表面が均質の高分子基村上に糖蛋白質等を
固定しているため、糖蛋白質等が、不安定となり、細胞
との接着性に劣ると共に接着した細胞の伸展、増殖が十
分でなく、高密度、長期間の細胞培養ができないという
問題点がある。

く目　的〉 この発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、細
胞との接着性に優れ、細胞の増殖と機能維持を行うこと
のでき、高密度、長期間の細胞培養を可能ならしめる細
胞培養用基材を提供することを目的とする。

く問題点を解決するための手段および作用〉上記の問題
点を解決すべくなされた、この発明の細胞培養用基材は
、紫外線で表面処理された高分子基材の表面上に、糖、
蛋白質、脂質およびこれらの複合化合物（以下、これら
を、糖蛋白質等と称する）のいずれか１種類以上が担持
されていることを特徴とするものである。

なお、上記高分子基材は、多孔質材料であるのが好まし
い。また、上記基材が中空糸であるものが好ましい。さ
らには、基材が、紫外線にて部分的に処理されているの
が好ましく、特に、格子模様、縞模様、水玉模様等に紫
外線処理されているのが好ましい。

上記の構成の細胞培養用基材によれば、高分子材料から
なる基材の表面上に糖蛋白質等が固定化されているため
、細胞との接着性を高めることができる。すなわち、細
胞表面の細胞膜の構造は、脂質二重層の中に、膜内粒子
と呼ばれる各種の糖蛋白質、糖脂質等が分布をもって埋
めこまれており、これらが、上記脂質二重層の中を自由
に移動でき細胞の接着に関与している。上記糖蛋白質等
は、膜内粒子とイオン結合、疎水結合等により結合可能
な部位を有するので、細胞との接着性が高まると共に細
胞を安定した形態、配置で保持することができる。さら
に、該基材の表面は紫外線により表面処理されているの
で、表面に親水性基、例えば、カルボニル基、カルボキ
シ基、水酸基等を有しており、上記親水性基を有する部
位により基材と糖蛋白質等との接着性が高まり、ひいて
は細胞と基材との接着性を高めることができる。

また、上記高分子基材が、多孔質材料であるときは、多
孔質材料の孔を通じて物質代謝が容易となり長期に亘り
細胞培養することができる。特に、前記高分子基材が中
空糸であるものは、中空部内や中空糸の外側に培養液等
を潅流することにより、中空糸上に細胞を高密度に育成
、増殖させることができる。

基材が紫外線の部分的な処理により微細加工されて、親
水性の程度の異なる部分が微細模様で配置されている基
材表面にあっては、糖蛋白質等が細胞の伸展、増殖に適
した配置、形態をもって基材上に固定化されるので、細
胞との接着性に優れ、また接着した細胞の伸展、増殖に
、より有効な細胞培養用基材とすることができる。特に
、格子模様、縞模様、水玉模様等に紫外線処理されてい
るものは、上記の効果を一層高めることができる。

以下、この発明の詳細な説明する。

この発明の細胞培養用基材は、紫外線照射により表面処
理された高分子基材の表面上に、糖蛋白質等のいずれか
１種類以上が担持された構造を宵する。

上記高分子基材の材料としては、賦形性、機械的強度を
有するものであればいかなるものでも使用でき、例えば
、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレン
、アイオノマー等のオレフィン系重合体、ポリテトラフ
ルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン等のフッ素系樹
脂、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、ポリメチルメタ
クリレート等のアクリル系樹脂、ポリビニルアルコール
、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセクール、ポリアクリ
ロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポ
リカーボネート、ボリアリレート、ポリフェニレンオキ
サイド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテ
レフタレート等のポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、ポ
リアミド、ポリイミド、ポリスルホン、セルロース系樹
脂、シリコーン樹脂、ポリウレタンなどの種々の重合体
もしくは共重合体またはそれらのブレンド物が例示でき
る。

上記高分子材料からなる基材は、種々の形態に形成でき
、例えば、シャーレ、フラスコ等の成形品の他、フィル
ム、チューブ、中空糸、繊維、微粒子等の形態が例示で
きる。これらの形態のうち、長期に亘り細胞培養を行な
うには、物質代謝を容易にする孔を有する多孔質高分子
基材が好ましく、また、高密度培養を行なうには、チュ
ーブ、中空糸の形状が好適である。特に、物質代謝が容
易で、高密度培養を長期に亘り行なえる多孔質高分子基
材からなる中空糸が好ましい。この中空糸を用いるとき
、培養液を、中空糸の中空部または外側に潅流させ、必
要に応じて炭酸ガスや空気等を上記中空糸の中空部等に
送ることにより、細胞を中空糸上で育成し、増殖させる
ことができる。なお、前記中空糸としては、種々の大き
さのものが使用でき、例えば、内径５Ｏ−１０００ＩＩ
ＦＡ程度のものが用いられる また、この発明にかかる細胞培養用基材をマイクロキャ
リアー法のビーズ担体として使用する場合には、前記高
分子基材は１００〜３００μｍ程度の粒径のものが用い
られる。

上記高分子材料からなる基材の紫外線照射処理に使用さ
れる紫外線は、高分子基材の表面で化学反応を生じさせ
る波長のものが使用できる。紫外線のうち、２００ｎｍ
未満の遠紫外線は、光エネルギーが大きいため、より効
率的に処理することができる。

なお、上記紫外線を放射する光源としては、クセノンア
ーク、メタルハライドランプなども使用できるが、大面
積の処理が可能な水銀灯やコヒーレントで微細加工が可
能なレーザが好適に用いられる。上記水銀灯としては、
３６８ｎｍの波長が主である高圧水銀灯、２５３．７ｒ
＋ａ＋および１８４．９ｎｍの波長の光を同時に放射す
る低圧水銀灯が例示できる。

また、レーザとしては、Ａｒ、Ｈｅ−Ｃｄ５Ｎ２等のレ
ーザの他に、短波長と高出力の光を放射するエキシマレ
ーザが利用できる。エキシマレーザは、短時間に高いエ
ネルギーを基材に与え、基材を化学的および物理的に大
きく改質できるため、好適に用いられる。上記紫外線に
よる処理は、紫外線を種々の雰囲気中で所望の高分子基
材の表面に照射することで行なわれる。例えば、空気中
で紫外線を照射すると、前記高分子基材の表面にカルボ
ニル基が生成する他、ヒドロペルオキシド基や過酸基も
生じる。従って、ヨウ化カリウムなどの還元剤で還元す
ることにより、糖蛋白質等との親和性、接着性に優れた
官能基、例えば、水酸基、カルボキシ基等を高分子基材
に導入することができる。

上記紫外線照射は、高分子基材からなる基材の表面の全
面に行なって４よいが、紫外線照射を部分的に行ない、
微細加工することにより、糖蛋白質等を基材上に強固か
つ安定した形態で固定化でき、細胞との接着性に優れる
と共に細胞の伸展と増殖を増大させることができる。紫
外線を部分的に照射する場合、格子状、縞模様、水玉模
様等の微細模様に照射することにより、上記効果をさら
に増進できる有用な表面を形成することができる。

また、エキシマレーザは、短時間に高いエネルギーを基
材に与え、基材を化学的に大きく改質できる他、基材表
面を微細な凹凸状に微細加工する物理的改質もできるの
で、接着した細胞の物質代謝をも促進できるという利点
がある。

なお、上記微細模様は、適宜の手段により形成すること
ができ、例えば、フォトマスクを使用して前記紫外線を
照射したり、レーザを操作することにより、上記微細模
様状にミクロンオーダーの精度で所望の間隔を有する模
様状に描くことができる。

これらの紫外線照射処理を行なった後、基材表面上に糖
蛋白質等の担持が行われる。ここで用いる等、蛋白質等
は、細胞と親和性があり、基材と細胞の接着を促進する
ものであればいずれも用いることができ、例えば、ラク
トース、ガラクトース等のオリゴ糖、アルブミン等の蛋
白質、リン脂質等の脂質、グロボシド、ガングリオシド
等の糖と脂質との複合体である糖脂質、細胞質や血清中
に含まれる脂質と蛋白質との複合体であるリボ蛋白質、
糖と蛋白質との複合体である糖蛋白質等が挙げられ、゛
特にオリゴ糖、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチ
ン、ラミニン、コンドロネクチン、ビトロネクチン、フ
ィブリン等の糖蛋白質が好適に用いられる。これらは２
種またはそれ以上組み合せて使用することも有用である
。基材表面上に糖蛋白質等を担持する方法は、従来の技
術がいずれも応用できる。一般には、紫外嗅照射された
高分子基材を、上記の糖蛋白質等の１種類または２種類
以上を含有する溶液に浸漬したり、該溶液を塗布した後
、乾燥することにより行われる。特に、糖蛋白質等が変
性しない条件で乾燥するのが好ましい。糖蛋白質等の担
持は、単分子層であってもよく、また多分子層であって
もよい。

この発明の細胞培養用基材は、種々の細胞の培養に使用
することができ、細胞の種類は特に限定されず生体由来
細胞、ハイブリドーマ−等が挙げられ、例えば、チャイ
ニーズハムスター肺由来細胞ｖ−７９、ヒト子宮癌由来
細胞ＨｅＬａ、ヒト胎児肺由来細胞ＭＲＣ−５、ヒト肝
由来細胞Ｃｈａｎｇ　Ｌｉｖｅｒ　％ヒト肺由来正二倍
体線維芽細胞ＩＲＣ−９０、ヒトリンパ腫由来ナマルバ
細胞等が例示される。また、この発明の細胞培養用基材
を用いて動物細胞を培養する場合、培養する細胞の種類
に応じて種々の培養液が用いられ、細胞の増殖に適した
至適温度、ｐＨ等の条件で培養が行なわれる。

〈実施例〉 以下、実施例に基づいてこの発明をより詳細に説明する
。

実施例１ 円形の低密度ポリエチレンフィルム（４５Ｍφ）に低圧
水銀等を用いて６−の距離から１時間紫外線を照射した
。このフィルムを４５　ｍｍφのガラスジ等−レにセッ
トしエチレンオキサイドガス減菌後、無菌のコラーゲン
溶液（タイプ１、濃度０．３％）を塗布し、余分の液を
除いた後室温で乾燥させた。

これらの操作は全て無菌のクリーンベンチ内で行なった
。次に、このシャーレにチャイニーズハムスター肺由来
細胞（Ｖ−７９細胞）を培養液１′１１当たりＩ　Ｘ　
１０４個播種し、培養した。培養液は、１０重量％牛脂
児血清を含むイーグルＭＥＭ培地を用い、５％炭酸ガス
、９５％空気雰囲気、温度３７℃の環境下、７日間の培
養を行なった。培養後、細胞数は、培養液−１猷当たり
平均５．４×１０６個となり、良好な増殖が観察された
。

比較例１ 紫外線処理を行わない低密度ポリエチレンフィルムをエ
チレンオキサイドガス減菌後、実施例１と同様にコラー
ゲンの塗布と培養試験を行なった。

コラーゲン溶液はフィルム上ではじかれ、はとんど付着
しなかった。また、培養後の細胞数は、２．６×１０４
個にとどまった。

実゛施例２ 円形のポリエチレンテレフタレートフィルム（４５ｍｍ
φ）に、石英板上に描かれたクロムマスクの画像を通し
て２５０〜３００　ｎｍ波長の紫外線をＤｅｅｐＵＶ露
光装置により１時間照射し、１μ量角の格子状模様（処
理部幅１μｆｆ１）に処理されたフィルムを得た。この
処理フィルムを４５　ｍｍφ径のガラスシャーレにセッ
トし、高圧蒸気滅菌後、無菌のコラーゲン溶液（タイプ
１、濃度０．８％）を塗布、乾燥して、次いでラット血
漿から得られた無菌のフィブロネクチン溶液（濃度１０
μｇ　／　’Ｍｌ　）を塗布、乾燥してコラーゲン−フ
ィブロネクチン層を形成した。得られた試料で実施例１
と同様に培養試験を行なった結果、細胞数は培養液１１
１当たり平均６．４Ｘ１０６個となり、良好な増殖が観
察された。

〈発明の効果〉 以上のように、この発明の細胞培養用基材によれば、紫
外線照射処理により、糖蛋白質等との接着性に優れた親
水性基が形成された基材上に糖蛋白質等が担持されてい
るので、糖蛋白質等を基材上に強固に固定化することが
できる。また、糖蛋白質等は、細胞との親和性に優れ、
接着性を高めることができると共に細胞を伸展、増殖に
適した形態、配列で接着することができるので、高密度
かつ長期間の細胞培養が可能となる。特に、紫外線を部
分的に照射して形成された微細加工表面を存する基材に
あっては、糖蛋白質等の高次構造を維持したままで固定
化することができるので、細胞との接着性並びに細胞の
伸展性および増殖性に優れるという特有の効果を奏する
。従って、この発明の細胞培養用基材は、動物細胞の培
養によるホルモン等の有用物の生産システムに利用でき
る他、例えばインスリン産生細胞を基材表面に接着、培
養することにより人工膵臓が形成できるように人工臓器
の構築に利用できる。

特許出願人　　住友電気工業株式会社 代　　理　　人　　　弁理士　　亀　　井　　弘　　勝
（ほか３名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、紫外線で表面処理された高分子基材の 表面上に、糖、蛋白質、脂質およびそれら の複合化合物のいずれか１種類以上が担持 されていることを特徴とする細胞培養用基 材。 ２、高分子基材が多孔性であることを特徴 とする上記特許請求の範囲第１項記載の細 胞培養用基材。 ３、高分子基材が中空糸であることを特徴 とする上記特許請求の範囲第１項または第 ２項記載の細胞培養用基材。 ４、高分子基材が紫外線にて部分的に表面 処理されている上記特許請求の範囲第１項 ないし第３項のいずれかに記載の細胞培養 用基材。 ５、高分子基材が格子模様に紫外線処理さ れていることを特徴とする上記特許請求の 範囲第４項記載の細胞培養用基材。 ６、高分子基材が縞模様に紫外線処理され ていることを特徴とする上記特許請求の範 囲第４項記載の細胞培養用基材。 ７、高分子基材が水玉模様に紫外線処理さ れていることを特徴とする上記特許請求の 範囲第４項記載の細胞培養用基材。