JPS63201568A - 免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析方法Info
- Publication number
- JPS63201568A JPS63201568A JP3348487A JP3348487A JPS63201568A JP S63201568 A JPS63201568 A JP S63201568A JP 3348487 A JP3348487 A JP 3348487A JP 3348487 A JP3348487 A JP 3348487A JP S63201568 A JPS63201568 A JP S63201568A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microcapsules
- agglutinated
- antibody
- filter
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
本発明はマイクロカプセルの凝集反応を利用した免疫分
析方法に関する。
析方法に関する。
（ロ）従来の技術
従来の免疫分析法として、例えばラジオイムノアッセイ
法（ＲＩＡ法）、エンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ
法）がある。これら測定法はＲＩＡ法は定量的だが、放
射性同位元素を用いるので使用場所が制限され、また設
備が大がかりとなる。
法（ＲＩＡ法）、エンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ
法）がある。これら測定法はＲＩＡ法は定量的だが、放
射性同位元素を用いるので使用場所が制限され、また設
備が大がかりとなる。
ＥＩＡ法は操作が繁雑であり、またいずれの測定法とも
分析に数時間から数十時間という長時間を要する。その
他マイクロカプセル（主として赤血球）による凝集法も
あるが肉眼判定に頼ったり、放射性物質を用いたりと一
般的な方法ではなかった。
分析に数時間から数十時間という長時間を要する。その
他マイクロカプセル（主として赤血球）による凝集法も
あるが肉眼判定に頼ったり、放射性物質を用いたりと一
般的な方法ではなかった。
（ハ）発明が解決しようとする問題点
本発明の目的は免疫学的測定法において簡便な操作で５
〜１０分間という短時間のうちに処理出来、高感度でし
かも正確な量を定量出来る新規な分析方法を提供するこ
とにある。
〜１０分間という短時間のうちに処理出来、高感度でし
かも正確な量を定量出来る新規な分析方法を提供するこ
とにある。
（ニ）問題点を解決するための手段および作用本発明者
らは上記の実情に鑑み種々研究を重ねた結果、抗体また
は抗原を結合し内部あるいは構成膜中に定量可能なマー
カー物質を包含するマイクロカプセルを用い、これとフ
ィルターとを組み合わせることにより上記目的が達成さ
れることを見出した。
らは上記の実情に鑑み種々研究を重ねた結果、抗体また
は抗原を結合し内部あるいは構成膜中に定量可能なマー
カー物質を包含するマイクロカプセルを用い、これとフ
ィルターとを組み合わせることにより上記目的が達成さ
れることを見出した。
本発明で使用されるマイクロカプセルとしては赤血球、
リポソームも含め種々のものが適用出来るが、形が球状
で均一なものが望ましい。これと組み合せて用いるフィ
ルターのポアサイズとしては使用するマイクロカプセル
直径と同径から５倍位が適当である。大量の検体を一度
に処理するという点からは、例えば９６六マイクロプレ
ートの底部にフィルターの装着されたミリポア製ミリタ
イタープレートが好ましい。
リポソームも含め種々のものが適用出来るが、形が球状
で均一なものが望ましい。これと組み合せて用いるフィ
ルターのポアサイズとしては使用するマイクロカプセル
直径と同径から５倍位が適当である。大量の検体を一度
に処理するという点からは、例えば９６六マイクロプレ
ートの底部にフィルターの装着されたミリポア製ミリタ
イタープレートが好ましい。
マイクロカプセル内部あるいは構成膜中に包含される定
量可能なマーカー物質としては、本発明の目的に適い、
かつかかる機能を有するものであれば特に制限はなく、
赤血球の場合はヘモグロビンであり、リポソームや界面
重合法などによる化学合成マイクロカプセルの場合は種
々のものを利用出来るが、高域度という点からは螢光物
質が望ましい。
量可能なマーカー物質としては、本発明の目的に適い、
かつかかる機能を有するものであれば特に制限はなく、
赤血球の場合はヘモグロビンであり、リポソームや界面
重合法などによる化学合成マイクロカプセルの場合は種
々のものを利用出来るが、高域度という点からは螢光物
質が望ましい。
マイクロカプセルへ結合させる抗体または抗原は、被検
目的に応じて適宜選択される。例えば、後記に列挙した
抗原に対応する抗体が例示される。
目的に応じて適宜選択される。例えば、後記に列挙した
抗原に対応する抗体が例示される。
当該抗体は動物への免疫、モノクローナル抗体作製の通
常技術等によって製造される。
常技術等によって製造される。
抗体のマイクロカプセルへの結合は公知の方法によって
行われる。対象が赤血球の場合、抗体の結合は塩化クロ
ム法により行われる。またマイクロカプセル例えばリポ
ソームへの抗体の結合は、例えばＬｅｓｅｒｍａｎ等の
方法（Ｎａｔｕｒｅ、 ２８８．６０４−６０６゜１９
８０） 、Ｍａｒｔｉｎ等の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、 ２ｏ。
行われる。対象が赤血球の場合、抗体の結合は塩化クロ
ム法により行われる。またマイクロカプセル例えばリポ
ソームへの抗体の結合は、例えばＬｅｓｅｒｍａｎ等の
方法（Ｎａｔｕｒｅ、 ２８８．６０４−６０６゜１９
８０） 、Ｍａｒｔｉｎ等の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、 ２ｏ。
４２２９−４２３８．１９８１）により行われる。
本発明の分析方法は、次のようにして行われる（第１図
参照）。まず抗体結合マイクロカプセルと被検血清（た
とえばヒト血清）とを５〜１０分間反応させた後フィル
ターを用いてこの反応液をろ過し凝集マイクロカプセル
を捕捉する。次にこの凝集マイクロカプセルの螢光強度
あるいは吸光度などを直接測定するか、低張液や界面活
性剤、有機溶媒を加えて溶解させる。溶解後、上澄液中
のヘモグロビンまたはマーカー物質を、例えば螢光強度
あるいは吸光度等で測定し、被検血清中の抗原等を測定
する。即ち、被検血清中に測定を意図する抗原がなけれ
ば、マイクロカプセルは凝集せず、ひいてはフィルター
に捕捉されることもな（、螢光等も検出されないので陰
性となる。逆に測定を意図する抗原が存在すれば、抗原
を介在してマイクロカプセルは凝集し、凝集したマイク
ロカプセルはフィルターに捕捉される。しかる後そのま
ま、あるいは捕捉されたマイクロカプセルを溶解させ螢
光強度等を測定することにより定量が行われる。
参照）。まず抗体結合マイクロカプセルと被検血清（た
とえばヒト血清）とを５〜１０分間反応させた後フィル
ターを用いてこの反応液をろ過し凝集マイクロカプセル
を捕捉する。次にこの凝集マイクロカプセルの螢光強度
あるいは吸光度などを直接測定するか、低張液や界面活
性剤、有機溶媒を加えて溶解させる。溶解後、上澄液中
のヘモグロビンまたはマーカー物質を、例えば螢光強度
あるいは吸光度等で測定し、被検血清中の抗原等を測定
する。即ち、被検血清中に測定を意図する抗原がなけれ
ば、マイクロカプセルは凝集せず、ひいてはフィルター
に捕捉されることもな（、螢光等も検出されないので陰
性となる。逆に測定を意図する抗原が存在すれば、抗原
を介在してマイクロカプセルは凝集し、凝集したマイク
ロカプセルはフィルターに捕捉される。しかる後そのま
ま、あるいは捕捉されたマイクロカプセルを溶解させ螢
光強度等を測定することにより定量が行われる。
末法において被検血清中に目的とする抗原が大量に存在
していてもマイクロカプセルの凝集度が低い場合に゛は
、使用抗体がモノクローナル抗体）場合、認識エピトー
プの異なるもう１種類のモノクローナル抗体を組み合せ
る、マイクロカプセルに抗原を反応させた後更に２次抗
体を反応させることなどによって凝集度を高め、感度を
鋭敏にさせることが出来る。
していてもマイクロカプセルの凝集度が低い場合に゛は
、使用抗体がモノクローナル抗体）場合、認識エピトー
プの異なるもう１種類のモノクローナル抗体を組み合せ
る、マイクロカプセルに抗原を反応させた後更に２次抗
体を反応させることなどによって凝集度を高め、感度を
鋭敏にさせることが出来る。
抗原が存在しないのにマイクロカプセルが凝集する、い
わゆる縦隔性が生じる場合には、マイクロカプセルに結
合している抗体と同種の抗体または血清（但し抗原とは
反応しない）を含むバッファーと被検血清とを混合する
ことによりその程度を抑えることが出来る。
わゆる縦隔性が生じる場合には、マイクロカプセルに結
合している抗体と同種の抗体または血清（但し抗原とは
反応しない）を含むバッファーと被検血清とを混合する
ことによりその程度を抑えることが出来る。
分析の対象としてはＡＦＰ、ＣＥＡ、 β２−ミクロ
グロブリン、ＣＡ１９−９等の各種癌抗原、ＨＢｓＡｇ
、ＨＢｃＡｇ、Ａｎｔ １ＨＢｓ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴ
ＬＶ−ＩＩＩ等のウィルス関連の抗原・抗体、更には血
中の各種ホルモンやＩｇＧ等の血漿蛋白質が好適に例示
される。
グロブリン、ＣＡ１９−９等の各種癌抗原、ＨＢｓＡｇ
、ＨＢｃＡｇ、Ａｎｔ １ＨＢｓ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴ
ＬＶ−ＩＩＩ等のウィルス関連の抗原・抗体、更には血
中の各種ホルモンやＩｇＧ等の血漿蛋白質が好適に例示
される。
（ホ）発明の効果
本免疫分析法によれば簡便な操作で短時間のうちに処理
出来、高域度でしかも正確な量を定量出来る。
出来、高域度でしかも正確な量を定量出来る。
目的とする抗原によって抗体感作マイクロカプセルを凝
集させ、長時間かけて沈降像を形成させることな（、フ
ィルターによって捕捉するため短時間処理が可能となっ
た。またマイクロカプセルに包含されるマーカーとして
放射性物質のかわりに非放射性の、例えば螢光物質を用
いるため、測定機器が安価となりまた場所を選ばなくな
った。
集させ、長時間かけて沈降像を形成させることな（、フ
ィルターによって捕捉するため短時間処理が可能となっ
た。またマイクロカプセルに包含されるマーカーとして
放射性物質のかわりに非放射性の、例えば螢光物質を用
いるため、測定機器が安価となりまた場所を選ばなくな
った。
（へ）実施例
本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、
本発明はこれらにより同等限定されるものではない。
本発明はこれらにより同等限定されるものではない。
実施例１
ガンマ−カーＡＦＰの検出を試みた。
マイクロカプセルとして、認識エピトープの異なる２種
のモノクローナル抗体を結合させ、内部に螢光物質（カ
ルボキシフルオレセイン）を含有するリポソーム（その
内のリバースフェーズエバポレーシ目ンベシクル）を、
あらかじめ０．２μｍのポアサイズのフィルターを通し
た後使用した。
のモノクローナル抗体を結合させ、内部に螢光物質（カ
ルボキシフルオレセイン）を含有するリポソーム（その
内のリバースフェーズエバポレーシ目ンベシクル）を、
あらかじめ０．２μｍのポアサイズのフィルターを通し
た後使用した。
反応容器としてミリポア製９６穴ミリタイタープレート
（０，４５μｍＨＡフィルター装着）を使用した。
（０，４５μｍＨＡフィルター装着）を使用した。
種々の濃度のヒ）ＡＦＰを含むヒト正常人血清５０μｌ
に上記リポソーム浮遊液５０μｌを添加し室温、１０分
間反応させた。次に反応液を吸引除去後、ヘペス緩衝液
にて３回洗浄を行いフリーのリポソームを除去した。次
に各ウェルに水を２００μｉ加えフィルターに捕捉され
たリポソームを溶解させ螢光強度を測定した。その結果
は第２図に示す通りであり、ヒトＡＦＰ濃度と螢光強度
との直線関係によってヒトＡＦＰを定量することが出来
る。
に上記リポソーム浮遊液５０μｌを添加し室温、１０分
間反応させた。次に反応液を吸引除去後、ヘペス緩衝液
にて３回洗浄を行いフリーのリポソームを除去した。次
に各ウェルに水を２００μｉ加えフィルターに捕捉され
たリポソームを溶解させ螢光強度を測定した。その結果
は第２図に示す通りであり、ヒトＡＦＰ濃度と螢光強度
との直線関係によってヒトＡＦＰを定量することが出来
る。
実施例２
ガンマ−カーＣＥＡの検出を試みた。
実施例１と同様に調製したリポソーム（抗ＣＥＡモノク
ローナル抗体１種を結合し、マーカーとしてローダミン
Ｂ包含）を使用した。
ローナル抗体１種を結合し、マーカーとしてローダミン
Ｂ包含）を使用した。
反応容器としてミリボア製９６六ミリタイタープレー！
−（０，４５μｍＨＡフィルター装着）を使用した。
−（０，４５μｍＨＡフィルター装着）を使用した。
種々の濃度のヒトＣＥＡを含むヒト正常人血清５０μｌ
に上記リポソーム浮遊液２５μ２を添加し３７℃、５分
間反応させ、更に抗ＣＥＡウサギポリクローナル抗体を
添加し３７°Ｃ，５分間反応させた。
に上記リポソーム浮遊液２５μ２を添加し３７℃、５分
間反応させ、更に抗ＣＥＡウサギポリクローナル抗体を
添加し３７°Ｃ，５分間反応させた。
次に反応液を吸引除去後、ヘペス緩衝液にて３回洗浄を
行いフリーのリポソームを除去した。そしてこのまま螢
光強度を測定した。その結果は第３図に示す通りであり
、ヒ）ＣＥＡ濃度と螢光強度との直線関係によってヒト
ＣＥＡを定量することが出来る。
行いフリーのリポソームを除去した。そしてこのまま螢
光強度を測定した。その結果は第３図に示す通りであり
、ヒ）ＣＥＡ濃度と螢光強度との直線関係によってヒト
ＣＥＡを定量することが出来る。
第１図
本発明の免疫分析法の概念説明図。
第２図
本発明の免疫分析法においてヒトＡＦＰの濃度と螢光強
度との関係説明図。 第３図 本発明の免疫分析法においてヒ）ＣＥＡの濃度（ばか３
名） 第１図
度との関係説明図。 第３図 本発明の免疫分析法においてヒ）ＣＥＡの濃度（ばか３
名） 第１図
Claims (1)
- 抗原または抗体を結合し、内部あるいは構成膜中に定量
可能なマーカー物質を含有するマイクロカプセルを用い
、免疫反応によりマイクロカプセルを凝集させ、対応す
る抗原または抗体を定量する免疫分析方法において、フ
ィルターにより、凝集マイクロカプセルと非凝集マイク
ロカプセルとを分別することを利用して定量することを
特徴とする免疫分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3348487A JPS63201568A (ja) | 1987-02-18 | 1987-02-18 | 免疫分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3348487A JPS63201568A (ja) | 1987-02-18 | 1987-02-18 | 免疫分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63201568A true JPS63201568A (ja) | 1988-08-19 |
Family
ID=12387829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3348487A Pending JPS63201568A (ja) | 1987-02-18 | 1987-02-18 | 免疫分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63201568A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4113255A1 (de) * | 1990-04-24 | 1991-10-31 | Olympus Optical Co | Verfahren zum messen von antigenen und/oder antikoerpern mittels einer immunologischen reaktion |
| US5756363A (en) * | 1993-02-03 | 1998-05-26 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | Liposome reagent for immunoagglutination and immunoanalytical method |
-
1987
- 1987-02-18 JP JP3348487A patent/JPS63201568A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4113255A1 (de) * | 1990-04-24 | 1991-10-31 | Olympus Optical Co | Verfahren zum messen von antigenen und/oder antikoerpern mittels einer immunologischen reaktion |
| US5756363A (en) * | 1993-02-03 | 1998-05-26 | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. | Liposome reagent for immunoagglutination and immunoanalytical method |
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