JPS63210653A - 電気泳動用媒体膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は核酸（ＤＮＡ、　ＲＮＡ）塩基配列決定のため
に用いられるポリアクリルアミド系水性ゲルからなる電
気泳動用ゲル媒体に関するものであり、さらに詳しくは
、核酸塩基フラグメントの低分子量部分から高分子量部
分まで広い分子量範囲にわたって良好な分離性能を有す
るように予め定められ制御されたゲル媒体の膜厚勾配（
膜厚グラジェント）を有する電気泳動用媒体膜に関する
ものである。

［従来の技術］ 化学分解法、ジデオキシ法等による核酸（ＤＮＡ。

ＲＮＡ）の塩基配列決定法においてはポリアクリルアミ
ド系水性ゲル電気泳動用媒体膜（以下、ポリアクリルア
ミドゲル膜又は、単に、ゲル膜ということがある）を用
いたスラブ電気泳動が必須の操作になっている。近年で
は電気泳動分析が頻繁に利用されるようになっている。

そしてジデオキシ法の発達により、核酸フラグメントの
高分子量部分まで精度よく分離できるポリアクリルアミ
ドゲル膜の要請が高まってきた。

一方、核酸の塩基配列決定のために、核酸塩基フラグメ
ントをその分子量の違いにより電気泳動分離する場合９
通常の厚さ一定のポリアクリルアミドゲル膜では９分離
したフラグメントのバンドの間隔が低分子量部分では広
く、高分子量部分では狭くなる。このため核酸フラグメ
ントの高分子量部分の分離が悪くなる。そこで低分子量
部分から高分子量部分まで広い分子量範囲にわたって均
等に良好な分離性能を得るために、電気泳動方向にポリ
アクリルアミド濃度、緩衝液濃度に勾配をもたせたポリ
アクリルアミドゲル膜（グラジェントゲル膜）が使用さ
れている。例えば特開昭６Ｏ−２３５８１９（ＥＰ　０
１５９６９４Ａ）にはポリアクリルアミド濃度（ゲル濃
度又は孔径サイズ）勾配を有するポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動用媒体膜を、アクリルアミドと架橋剤を含む
水溶液の薄層を支持体の表面で電子ビーム等の電離放射
線を用いて架橋重合させて製造する方法及び装置が記載
されている。

この方法に用いられる装置及び濃度勾配をゲル膜中に発
現させるための電子ビーム等のコントロール法はきわめ
て複雑である。一般にグラジェントゲル膜は製造するの
に手数がかかり、１１度勾配の再現性が悪く、！！造に
失敗することが多く、均一なグラジェントを有する多数
のゲル膜を製造し難いという欠点があった。さらに、ポ
リアクリルアミドゲル濃度の違いによって膨潤率が異な
るので。

分離した核酸フラグメント像を有する電気泳動実施後の
ゲル膜を支持体から剥離する操作時にゲル膜が変形しや
すいという欠点もあった。

一方２通常ゲル膜を作製する場合、２枚の平面ガラスの
間にゲル膜を形成するため、望みの漸次的変化の勾配を
もたせることが難しかったので。

膜厚勾配ゲル膜は従来使用されていなかった。

［発明の目的］ 本発明の目的は核酸（ＤＮＡ、　ＲＮＡ）の塩基配列決
定のために用いられるポリアクリルアミド系水性ゲル電
気泳動用媒体（以下、ゲル媒体ということがある）にお
いて、核酸フラグメントの低分子量部分から高分子量部
分までほぼ同等な良好な高分離性能を持つように厚さグ
ラジェントを有するゲル媒体膜を提供することである。

本発明の他の目的は濃度グラジェントゲル膜に比べて膨
潤による変形の少ない厚さグラジェントを有するゲル媒
体膜を提供することである。

［発明の構成］ 本発明は、アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在
下に架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル及
び変性剤として少なくとも１個のカルバモイル基を含む
化合物を含む電気泳動用ゲル媒体からなる層を平面状支
持体と平面状カバーシートとの間に設けてなる電気泳動
用媒体膜において、前記ゲル媒体層が予め定められた漸
次的な厚さの変化（層厚勾配）を有する電気泳動用媒体
膜である。

［発明の構成の詳細な説明］ ゲル媒体に用いることができるアクリルアミド系化合物
（単量体）の例としては、アクリルアミド。

Ｎ−メチルアクリルアミド、　Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド。

ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホモログ
がある。これらの化合物は単独で、または２種以上を組
合せて用いることができる。これらの化合物のうちでは
アクリルアミドが好ましく。

またアクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物の１
種以上との併用も好ましい。

架橋剤としてはｒ　Ｅ　Ｉｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
Ｊ２（４）、２１３−２ｌ９（１９８１）、同誌２−（
４）、２２０−２２８（１９８１）等に記載の二官能性
架橋剤化合物、特開昭６１−２０５８等に記載の三官能
性以上の架橋剤化合物を用いることができる。二官能性
架橋剤の具体例として、　Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアク
リルアミド（Ｂ　Ｉ　Ｓ）　；　Ｎ、Ｎ’−プロピレン
ビスアクリルアミド（ＰＢＡ）；ジアクリルアミドジメ
チルエーテル（ＤＡＥ）；１，２−ジアクリルアミドエ
チレングリコール（Ｄ　Ｅ　Ｇ）　；エチレンウレアビ
スアクリルアミド（Ｅ　Ｕ　Ｂ）　；エチレンジアクリ
レート（ＥＤＡ）；Ｎ、Ｎ’−ジアリルタルタルジアミ
ド（Ｄ　Ａ　Ｔ　Ｄ　）；Ｎ、Ｎ’−ビスアクリリルシ
スタミン（ＢＡＣ）がある。三官能性架橋剤の具体例と
して、　１，３．５−　）リアクリロイルへキサヒドロ
−３−トリアジン（ＴＡＨＴ）；　）リアリルシアヌレ
ート（ＴＡＣ）；）リアリルイソシアヌレート（ＴＡ　
ＩＣ）等がある。これらの架橋剤のうちではＢＩＳとＴ
ＡＨＴが好ましい。架橋剤は２種以上を組合わせて用い
ることもできる。

架橋剤の量は、単量体と架橋剤の合計重量に対して約１
ｗ％から約３０ｗ％、好ましくは約２ｗ％から約ｌｏｗ
％の範囲で用いられる。

ゲル媒体にはアガロースを添加することができる。アガ
ロースとしては、特開昭５５−５７３０　、特開昭５５
−１１０９４６　、特表昭５７−５０２０９８　、特開
昭５９−１２６２３６等に記載の低電気浸透性アガロー
ス、中電気浸透性アガロース、高電気浸透性アガロース
のいずれも用いることができる。アガロースの添加量は
単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して約０．２
豐／Ｖ％から約２．０豐／Ｖ％、好ましくは約０．九／
Ｖ％から約１．２豐／Ｖ％の範囲である。

ゲル媒体には水溶性ポリマーを添加することができる。

水溶性ポリマーとしては、特開昭５９−１２６２３８、
特開昭６０−６０５４８等に記載の分子量約１万から約
１００万の範囲の付加重合型または縮重合型の水溶性の
非イオン性ポリマー、特開昭６１−１８８５２等に記載
のビニルスルホニル基等含有の架橋性アクリルアミド系
コポリマー、特願昭６１−２１４８７８に記載の水溶性
セルロース誘導体を用いることができる。付加重合型の
水溶性の非イオン性ポリマーの例としてポリアクリルア
ミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンが
ある。縮重合型の水溶性の非イオン性ポリマーの例とし
てポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール
。

ポリ−Ｎ−ビニルピロリドンがある。架橋性アクリルア
ミド系コポリマーの例として、Ｎ（［３−（ビニルスル
ホニル）プロパンアミドコメチルコアクリルアミド−ア
クリルアミドコポリマー；　Ｎ−［［３−（２−クロロ
エチルスルホニル）プロパンアミド］メチル］アクリル
アミド−アクリルアミド−Ｎ−（１，１−ジメチル−３
−オキソブチル）アクリルアミドコポリマーがある。水
溶性セルロース誘導体の例としてメチルセルロース、エ
チルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチ
ルセルロース等の水溶性セルロースエーテルがある。こ
れらの水溶性ポリマーのうちではポリアクリルアミド、
ポリエチレングリコール、　Ｎ−［［３−（ビニルスル
ホニル）プロパンアミドコメチルコアクリルアミド−ア
クリルアミドコポリマーが好ましい。水溶性ポリマーの
添加量は、付加重合型または縮重合型の水溶性の非イオ
ン性ポリマーの場合、単量体と架橋剤の合計重量に対し
て約２ｖ％から約１００ν％、好ましくは約５−％から
約５０讐％の範囲、架橋性アクリルアミド系コポリマー
の場合、アクリルアミド系化合物の重量に対して約１−
％から約５０誓％、好ましくは約５％から約４０ν％の
範囲である。

ゲル媒体には核酸フラグメントの高分子量部分の泳動像
バンド幅の広がりと分離像の歪の発生防止の目的でグリ
セロールをゲル媒体の容積に対して約０．１豐／Ｖ％〜
約１．０冒／Ｖ％の範囲で添加することができる。また
湿潤剤としてグリセロール、エチレングリコール等のポ
リオール化合物をゲル媒体の容積に対して約１．０豐／
Ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の範囲で添加することができる。

アガロース及び／又は水溶性ポリマー、あるいはグリセ
ロール、エチレングリコール等のポリオール化合物をゲ
ル媒体に添加する時期は通常単量体と架橋剤を水に溶解
する時からポリアクリルアミド系水性ゲルの形成時まで
の間が好ましい。

ゲル媒体にはノニオン性、アニオン性又は両性界面活性
剤を添加することができる。界面活性剤の例として。

Ｃ３Ｆ１７ＳＯ２Ｎ　　（ＣＨ２ＣＨ２０）＋４−ＨＥ
ｔ 等のノニオン性界面活性剤。

Ｎａ０３Ｓ−ＣＨＣＯＯＣＨ２ＣＨ（Ｅｔ）ＣａＨ９「 ＣＨ２Ｃ００ＣＨ２ＣＨ（Ｅｔ）Ｃ４Ｈ９等のアニオン
性界面活性剤。

ｅ Ｃ１、Ｈ２３ＣＯＮ　Ｈ−（ＣＨ２）３−Ｎ”　−ＣＨ
２ＣＯＯ〜ｅ 等の両性界面活性剤がある。界面活性剤の添加量は、単
量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して、ノニオン
性又はカチオン性界面活性剤の場合。

約Ｉ　Ｘ　１０−’から約５ＸＩＯ−１豐／Ｖ％、好ま
しくは約ｌＸｌ０’−３から約Ｉ　Ｘ　１０−２豐／Ｖ
％の範囲、アニオン性界面活性剤の場合、約ｌＸｌ０−
４から約５Ｘ１０−２冒ｌＶ％、好ましくは約ｌＸｌ０
−３から約５Ｘ１０−２豐／Ｖ％の範囲である。

変性剤としては少なくとも１個のカルバモイル基をもつ
化合物が用いられる。その具体例として尿素、ホルムア
ミド等がある。変性剤の添加量は単量体と架橋剤を含む
水性ゲルの容積に対して約４０％ｄｌｖ％から約６０ｗ
／ｖ％の範囲である。変性剤として尿素を用いる場合に
は、単量体と架橋剤を含む水性ゲル１０１００Ｏに対し
約６モル（約３６０８）から飽和溶解量（約４２０ｇ）
まで、好ましくは約７モルから飽和溶解量までの範囲で
用いられる。変性剤は添加量が多いので、その添加時期
は通常単量体と架橋剤を含む諸成分を水に溶解、する時
が好ましい。

ゲル媒体には公知のｐ）Ｉ緩衝剤を含有させて電気泳動
実施時のｐＨ値を８．０から９．０の範囲に調節するこ
とができる。用いうるｐＨ緩衝剤としては９日本化学会
膳「化学便覧基礎編」（東京、丸善■、　１９６６年発
行）　１３１２−１３２０頁ｒ　Ｒ、Ｍ、　Ｃ、Ｄａｗ
ｓｏｎ　ｅｔ　ａ１編ｒＤａｔａ　ｆｏｒ　Ｂ　ｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪ第５ｅａｒｃｈＪ
ｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎＰｒｅｓｓ、
１９６９年発行）４７６−５０８頁、ｒ　Ｂ　ｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙＪ５．４６？頁以降（１９６６年）、ｒ
　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
Ｊ旧１１，３００−３１０頁（１９８０年）等に記載の
ｐ）ｌ緩衝剤系がある。　ｐｔ＋緩衝剤の具体例として
、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ
）　；　Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシ
ン（Ｂｉｃｉｎｅ）；Ｎ−２−ヒドロキシピペラジン−
、Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸Ｎａ
塩又はに塩等；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’−３−スルホン酸Ｎａ塩又はに塩等；　Ｎ−［）リ
ス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパン
スルホン酸Ｎａ塩又はに塩等；及びこれらのいずれかと
必要により組合せられる酸、アルカリ又は塩がある。好
ましいｐＨ緩衝剤系の例としてＴｒｉｓ−硼酸−ＥＤＴ
Ａ・２Ｎａ塩（ｐｔ（８，２〜８．３用組成）がある。

ゲル媒体は予め定められた厚さの膜において実質的に無
色透明であることが泳動像の検出または読取りに一般的
に好ましい。

ゲル媒体は、実質的に電気不伝導性で水不浸透性の平滑
な表面のシート状（フィルム状、又は平板状）支持体又
はカバーシートの上に予め定められた。制御された漸次
的な厚さの変化を有する層又は膜として設けられる。実
質的に電気不伝導性で水不浸透性の平滑な表面のシート
状支持体又はカバーシートとして公知のガラス板、有機
ポリマーシート等を用いることができる。有機ポリマー
シートの具体例としてポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セル
ローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオ
ネート等）等のポリマーからなる厚さ約５ＯＬＩｍから
約２ｎｖ　、好ましくは約８０ｕｍから約５００ＩＪ１
１の範囲の透明な、すなわち波長的２００ｎ１１から約
９００ｎｍの範囲内の少なくとも一部の範囲の波長の電
磁輻射線を透過させる平滑な表面を有するシート状物又
は平板状物がある。有機ポリマー支持体又はカバーシー
トを用いる場合にはその表面を親水化しゲル膜との接着
を良好にするために、紫外線照射、グロー放電処理、コ
ロナ放電処理、火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチ
ング。

電解エツチング等の公知の表面処理方法を適用すること
ができる。有機ポリマー支持体又はカバーシートの表面
には必要に応じて特開昭５９〜１６４９５０゜特開昭５
９−２１２７５３．特開昭６０−１９４３４９．特開昭
６０−２３９６５８　、特開昭６０−２４４８５０．特
開昭６１−１４５５７等に記載の下塗層または接着層を
設けてその上に設けられるゲル媒体層と支持体又はカバ
ーシートとの接着を強固にすることができる。また、後
述するように、予め定められた漸次的な厚さ変化を有す
る平面状支持体又はカバーシートを用いることもできる
。

ゲル媒体は前述の諸成分とラジカル重合開始剤組成物を
含む水溶液（以下、ゲル形成液ということがある）を平
面状支持体又はカバーシートの上に層状又は膜状に流延
または塗布し２分子状酸素の不存在下で、必要により紫
外線又は可視光の照射及び／又は加熱して、単量体（ア
クリルアミド系化合物）と架橋剤とが架橋重合したポリ
アクリルアミド系水性ゲル媒体層又は膜として製造され
用いられる。

アクリルアミド系化合物（単量体）と架橋剤は。

水溶液または水分散液として水に溶解または分散させて
おき、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合した水性
ゲル媒体を形成させる。本明細書においては特にことわ
らないかぎり、（水に）溶解と（水に）分散の両者を含
めて単に（水に）溶解といい。

水溶液と水分散液の両者を含めて単に水溶液という。溶
媒または分散媒としては、水だけでなく。

所望により加えられる有機溶媒を含む水−有機溶媒混合
物をも包含する。

ラジカル重合開始剤組成物としてはｒ　Ｅ　Ｉｅｃｔｒ
ｏ−ｐｈＯｒｅＳｉＳＪ２（４）、２１３−２１９（１
９８１）、同誌Ｚ（４）、２２０−２２８（１９８１）
、特開昭５９−１２６２３６　、青水、永井編ｒ最新電
気泳動法Ｊ（１９７３年発行）等に記載の低温ラジカル
重合開始剤組成物のうちから適宜に選択して用いること
ができる。ラジカル重合開始剤組成物の例として、β−
（ジメチルアミノ）プロピオニトリル（ＤＭＤＰＮ）−
ペルオクソニ硫酸アンモニウム混合物；　Ｎ、Ｎ、Ｎ’
、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）
−ペルオクソニ硫酸アンモニウム混合物；ＴＥＭＥＤ−
リボフラビン混合物；ＴＥＭＥＤ−リボフラビン−過酸
化水素混合物：リボフラビンーベルオクソニ硫酸アンモ
ニウム混合物；リボフラビン−過酸化水素混合物（リボ
フラビン等の光増感剤併用の場合には紫外線又は可視光
の照射を併用する）等がある。ラジカル重合剤組成物の
添加量は単量体と架橋剤の合計重量に対して約０．３ν
％から約５．０ｗ％、好ましくは約０．５ν％から約３
．０−％の範囲である。

ゲル媒体はゲル濃度としてＳ　、　Ｈｊｅｒｔｅｎ　：
　ｒＡｒ−ｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉｃｓＪ　ｌ、（Ｓ
ｕｐｐｌ、）、！４７−１５１（１９６２）に記載の定
義に従って表示して、単量体、架橋剤および水からなる
ゲル媒体の容積に対して、単量体と架橋剤の合計量が約
３ｗ／ｖ％から約３０ｗ／ｖ％の範囲で用いられる。

ゲル形成液を平面状支持体（又はカバーシート）の表面
上で架橋重合させる際には、ゲル形成液の流延塗布とそ
の後の架橋重合を窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素の不
存在下で実施するか、あるいは流延塗布したゲル形成液
の表面上に直ちにカバー用フィルム、シートまたは板等
の被覆材料で覆い架橋重合させることが好ましい。この
目的に使用される被覆材料としては前述の平面状支持体
と同様な素材からなるものを用いることができる。

カバー用フィルムが有機ポリマーフィルムである場合、
その厚さは約３００Ｌｆｆｌ＋以下であり、実用的な範
囲としては約４Ｌ１１１１から約２０ＯＬＩｆｆ＋、好
ましくは約約４ｕｍから約１００ＬＪＩＩ＋である。被
覆材料がガラス板の場合。

その厚さは支持体として用いる平面状ガラス板と同様な
厚さのものを用いることができる。

一般的にゲル媒体膜の厚さ勾配は、電気泳動実施後に核
酸の高分子フラグメント側に厚く、低分子フラグメント
側に薄くなるような勾配を設けるのが原則であるが、目
的により他の勾配配置を採用することができることはい
うまでもない。本発明のゲル媒体膜の特徴をなすゲル膜
の厚さ勾配（曲線又は直線）は、サンプル注入端部から
の距離に対して、直線、ゆるく折れた直線、指数関数。

対数関数、懸垂線、追跡線、放物線、双曲線、楕円、３
次曲線等の関数で表される漸次的変化の曲線の一部分、
その他の任意の漸次的変化の曲線又は曲線と直線の組合
せ等で表される勾配をもたせることができるが、電気泳
動方向に沿って距離とともに漸次的に単調に増加させる
。途中から増加させる。あるいは一度減少させた後増加
させるように設けるのが好ましい。変化させる厚さの範
囲は約５０−から約５開、好ましくは約８０ｕｍから約
１００〇−の範囲である。なお、サンプル注入部分の形
状は、長方形状、正方形状、三角形状（シャークスティ
ース状）１円形状等公知の形状から選択して設けること
ができる。

ゲル媒体に膜厚勾配を設ける方法としては、平面状支持
体に予め定められた。制御された漸次的な厚さ変化（層
厚勾配又は膜厚勾配）にほぼ相当する厚さ変化を有する
スペーサ板を固定し、スペーサ板にそってカバー用被覆
材料（シート状物）で覆ったモールド内部にゲル形成液
を流し込み架橋重合させる方法、予め定められた漸次的
な厚さ変化に相当する厚さ変化を有する平面状支持体く
又はカバーシート）の表面に一定厚さのスペーサー板を
固定し、スペーサ板にそってカバー用被覆材料（支持体
ンで覆ったモールド内部にゲル形成液を流し込み架橋重
合させる方法、予め定められた漸次的な厚さ変化に相当
する厚さ変化を有する平面状支持体（又はカバーシート
）の表面にゲル形成液を流延し、窒素ガス雰囲気中等の
分子状酸素の不存在下で架橋重合させる方法、予め定め
られた漸次的な厚さ変化に対応するように、単位時間当
りの流量を制御（ゲル膜厚さの薄い領域では流量を少く
、厚さの厚い領域では流量を多くする）しながら、平面
状支持体（又はカバーシート）の表面にゲル形成液を流
延塗布し、窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素の不存在下
で架橋重合させる方法等を適用することができる。予め
定められた漸次的厚さ変化を有する平面状支持体は、モ
ールドカスティング法、ケミカルエツチング法、切削法
等の公知の技術により調製されたものを用いることがで
きる。流量を制御しながら支持体（又はカバーシート）
に流延塗布する場合には、スペーサー板の厚さ変化は必
ずしもゲル膜の予め定められた漸次的な厚さ変化に相当
していなくともよい。また、ゲル媒体の膜厚勾配をゲル
膜の幅全体に設けずに。

サンプルを電気泳動させるレーンの領域より僅かに広い
幅の領域にだけレーンの数に対応させて設け、残余の領
域は実質的に厚さ一定にすることもてきる。この態様は
漸次的厚さ変化を有する平面状支持体又はカバーシート
を用いる態様において有利に実施できる。

本発明のゲル媒体膜は公知のポリアクリルアミド系水性
ゲル媒体膜と同様にして調製することができる。また９
本発明のゲル媒体膜は前述の諸文献や特許明細書等に記
載の公知の方法に従って。

水平型および垂直型スラブｍ気泳動法等に用いることが
できる。

堕工至■ 実施例１及び比較例１ 表面を紫外線照射処理した厚さ１８０ｕｍ、サイズ２０
Ｃｍ　Ｘ　４０ｃｍの長方形の無色透明ポリエチレンテ
レフタレー）（ＰＥＴ）シート（支持体）の長辺に沿っ
た両縁辺部に第１〜３図の電気泳動方向に沿う断面模式
図に示す３種の漸次的な厚さ変化を有する幅１０關のス
ペーサー板（本発明）及び同じ幅で一定厚さ２００ｕｍ
のスペーサー板（比較例）をそれぞれ固定し、スペーサ
ー板に沿って厚さ１１００ｕのＰＥＴシート（カバーシ
ート）で覆い、さらにカバーシートの外側を２０ｃＩＩ
ＩＸ　４０ｃｍの長方形のアルミニウム板でスペーサー
の厚さ変化に応するように固定してポリアクリルアミド
水性ゲル電気泳動用媒体層調製用モールドを形成した。

各モールドの中に第１表に記載の組成のアクリルアミド
ゲル形成用水溶液を流し込み２周囲温度２５℃で各ゲル
形成液に１００Ｗ高圧水銀灯を１０ｃｍの距離から照射
しつつ１０分静置し２枚のＰＥＴシートの間で架橋重合
させて厚さグラジェントを有する本発明のポリアクリル
アミド水性ゲル電気泳動用媒体膜３種■■■と厚さ一定
の比較用ゲル膜■を形成した。

■第１図の超偏平Ｖ字形断面、厚さ最大（泳動方向始端
部と終端部）３００Ｌｆｆｒｌ、最小（泳動方向中央部
）５０ｕｍ ■第２図の超偏平楔形断面、厚さ最小（泳動方向始端部
）１５０ｕｍから直線状に増加して最大（泳動方向終端
部）３００ｕｍ ■第３図の超偏平楔形断面、厚さ最小（泳動方向始端部
）１５０ｕｍから指数関数状に増加して最大（泳動方向
終端部）３００ｕｍ ■一定の厚さ２００ｕｍ 得られた４種のゲル膜を用いてＤＮＡ塩基配列解析の実
験をＭ１３−ｍｐ８ＤＮＡに対してジデオキシ法により
調製されたＤＮＡフラグメントサンプルを用いて常法に
従い実施した。その結果９本発明の厚さグラジェントゲ
ル膜では読み取り可能な塩基フラグメントの範囲は次の
とおりであった。

ゲル膜０６０〜２４０番 ゲル膜０６０〜２１５番 ゲル膜０６０〜２４０番 かつ各レーンでの塩基フラグメントの泳動像の幅と間隔
は読み取れる範囲内で極端に狭まることはなかった。

それに対して従来技術である厚さ一定のゲル膜■ではそ
の読み取り可能範囲は６０〜２００番で、各レーンでの
塩基フラグメントの泳動像の幅と間隔は低分子量部分か
ら高分子量部分に至るにつれて次第に狭まっていた。

この結果から本発明の厚さグラジェントを有するポリア
クリルアミド水性ゲル電気泳動用媒体膜は核酸塩基フラ
グメントの低分子量部分から高分子量部分まで広い分子
量範囲にわたってほぼ一様にレーンでの間隔が維持され
ていて良好な分離が得られ、かつ読み取り可能な塩基フ
ラグメントの数が多く、精度の高いＤＮＡ塩基配列解析
を行うことができることが明らかになった。

旦工至亘 第　１　表　ゲル形成液の成分 且アガロース：低電気浸透度、ゲル化温度３６℃Ｔｒｉ
ｓ：　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン実施例
２及び比較例２ 表面を紫外線照射処理した厚さ１ＢＯＬＩＩＩ＋、サイ
ズ２０ＣＩＩ＋　Ｘ　４ＱＣ１ｌＩの長方形の無色透明
ＰＥＴシート（支持体）の長辺に沿った縁辺部に一定厚
さ３００ＬＩＴ＋で幅１０關×長さ４０ｃｍのスペーサ
ー板を接着固定した。この支持体の上に実施例１の第１
表に記載の組成のゲル形成液を、ゲル形成液膜の厚さが
１５０ＬＩＩＴｌから３００ｕｍになるような範囲で流
量を制御して支持体上のゲル形成液膜の厚さを変化させ
なから流延塗布し、各ゲル形成液膜に５００Ｗキセノン
放電灯を照射しつつ窒素ガス雰囲気中で架橋重合させ、
ついでゲル膜の上に厚さ６３１Ｊｍでサイズ２０Ｃｍ　
Ｘ　４０ｃｍの無色透明ＰＥＴシートをカバーシー１ト
として密着積層して、第１図ないし第３図に示したスペ
ーサー板の断面の厚さ変化にほぼ等しい厚さ変化（膜厚
勾配）を有するポリアクリルアミド水性ゲル膜３種（本
発明のゲル膜）を調製した。

一方、ゲル形成液の流量を、ゲル形成液膜の厚さが２０
０Ｉｊｆｆｌになるように一定にしたほかは上記と同様
にして一定の厚さ２００ｕｍのゲル膜（比較例２）を調
製した。

得られた４種のゲル膜を用いて実施例１と同様にしてＤ
ＮＡフラグメントの泳動像の読み取り実験を実施したと
ころ、実施例１及び比較例１と同様の結果が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は実施例１の本発明の厚さグラジェント
を有するゲル膜１〜３を形成するために用いたスペーサ
ー板の電気泳動方向に沿う漸次的な厚さ変化（膜厚勾配
）を示す断面模式図である。 第１図：超偏平Ｖ字形断面、厚さ最大（泳動方向始端部
と終端部）３００ｕｍ、最小（泳動方向中央部）１５０
−９長さ４０ｃｍのスペーサー板（ゲル膜■調製用）第
２図：超偏平楔形断面、厚さ最小（泳動方向始端部）１
５０ｕｍから直線状に増加して最大（泳動方向終端部）
３００ｕｍ、長さ４０ｃｎ＋のスペーサー板（ゲル膜■
調製用） 第３図：超偏平楔形断面、厚さ最小（泳動方向始端部）
１５０ｕｍから指数関数状に増加して最大（泳動方向終
端部）３００ｕｍ、長さ４０ｃ＋ｎのスペーサー板（ゲ
ル膜■調製用） 特許出願人　富士写真フィルム株式会社第１図 厚さ変化：超偏平Ｖ字形 第２図 厚さ変化：直線状に増加 第３図 厚さ変化二指数間数状に増大 長さ４０００ 手続補正書（自発）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下に
   架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル及び変
   性剤として少なくとも１個のカルバモイル基を含む化合
   物を含む電気泳動用ゲル媒体からなる層を平面状支持体
   と平面状カバーシートとの間に設けてなる電気泳動用媒
   体膜において、前記ゲル媒体層が予め定められた漸次的
   な厚さの変化（層厚勾配）を有することを特徴とする電
   気泳動用媒体膜。
2. （２）前記支持体と前記カバーシートがいずれも有機ポ
   リマーからなるシート状物である特許請求の範囲第１項
   に記載の電気泳動用媒体膜。
3. （３）前記支持体と前記カバーシートがいずれもポリエ
   チレンテレフタレートからなるシート状物である特許請
   求の範囲第２項に記載の電気泳動用媒体膜。
4. （４）前記少なくとも１個のカルバモイル基を含む化合
   物が尿素である特許請求の範囲第１項に記載の電気泳動
   用媒体膜。
5. （５）前記ゲル媒体にさらにアガロースが含まれる特許
   請求の範囲第１項に記載の電気泳動用媒体膜。
6. （６）前記ゲル媒体にさらに水溶性ポリマーが含まれる
   特許請求の範囲第５項に記載の電気泳動用媒体膜。