JPS6291850A - 電気泳動用媒体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動用媒体
の製造方法に関するものであり、さらに詳しくは高分子
、特に蛋白質等の生体高分子成分の分離または分析、核
酸（ＤＮＡ、　ＲＮＡ）フラグメントの分離または分取
のために用いるのに適したポリアクリルアミド系水性ゲ
ル電気泳動用媒体の製造方法に関するものである。

［従来技術］ 近年、電気泳動法は生体成分の分析に多用されており、
特に蛋白等の高分子成分の分離または分析は生化学研究
、生物化学工学、病気診断のための生化学検査等におい
て頻繁に用いられている。

電気泳動法はまた遺伝子研究および遺伝子工学の分野に
おいても核酸（ＤＮＡ、　ＲＮＡ）フラグメントの分離
または分取のために頻繁に用いられている。これらの目
的には性能上の面から最近はアガロース水性ゲル膜やポ
リアクリルアミド水性ゲル膜（以下、ゲル膜ということ
がある）が用いられるようになり、特に分子篩効果を有
するポリアクリルアミド水性ゲル膜は現在量も多く利用
されている。

ポリアクリルアミド水性ゲル膜は２通常アクリルアミド
のような単量体とＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミ
ドのような二官能性または多官能性架橋剤の混合物と重
合開始剤を含む約３ｗｔ％〜約４０ｗｔ％水溶液中で（
変性剤を共存させることがある）単量体と架橋剤を架橋
重合させることにより形成している。一般に分解能の向
上のためにゲル膜厚を薄くすることが行われており、一
方核酸フラグメントの分取のためにはゲル膜厚を厚くす
ることも行われている。このように種々の目的に共通に
適用できるポリアクリルアミド水性ゲル膜およびその製
造方法が熱望されている。

従来重合開始手段として、過酸化物−還元剤の組合せ、
あるいは過酸化物−還元剤一光増感剤一励起光の組合せ
が採用されており、還元剤は必須と考えられていた。従
来採用されてきた重合開始手段の具体例として、β−ジ
メチルアミノプロピオニトリル（ＤＭＡＰＮ）−ペルオ
クソニ硫酸アンモニウムの組合せ、　Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ
’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）−ペ
ルオクソニ硫酸アンモニウムの組合せ、ＴＥＭＥＤ−過
酸化水素−リボフラビンに紫外線照射の絹合せ等があり
、　ＤＭＡＰＮやＴＥＭＥＤは還元剤である。

しかしながら、アクリルアミド系化合物と架橋剤の混合
物水溶液に上記のような重合開始剤を加えると、すぐに
アクリルアミド系化合物と架橋剤の重合が始まり、水溶
液の粘度が増し始め、数分から数時間、多くの場合１５
〜２０分経過するとゲル化してしまう。すなわち、モノ
マー（アクリルアミド系化合物と架橋剤の混合物）に重
合開始剤を加えた水溶液（以下、ゲル形成液ということ
がある）は経時安定性が極めて低く、ゲル膜作成操作に
は、迅速さと熟練とを必要としていた。また。

特開昭５９−１３６６４８．特願昭５９−１２２６６１
明綱書等に記載のモノマー（アクリルアミド系化合物）
と架橋剤の混合物（必要に応じてさらにアガロースおよ
び／またはボリアクルアミド等の非イオン性水溶性ポリ
マーを加える）に重合開始剤を加えた水溶液（以下、こ
れらの水溶液もゲル形成液ということがある）を長尺ポ
リマー支持体に連続塗布してゲル膜を形成する場合には
、ゲル形成液が時間の経過につれて粘度が高まるので、
ゲル膜厚の不均一、電気泳動による分離成分の泳動像の
歪２分離能の低下等の諸種の欠陥が生じ、ゲル膜の連綺
大量生産において大きな問題点であった。

［発明の目的］ 本発明の目的は、支持体への塗布面に生ずるゲル形成液
の粘度増大とゲル化を防止して、高分解能ポリアクリル
アミド系水性ゲル膜を容易に大堡に製造する方法を提供
することにある。

本発明の他の目的は、７ｉＩｉい膜厚のゲル膜にも厚い
膜厚のゲル膜にも等しく適用できるポリアクリルアミド
系水性ゲル膜の製造方法を提供することにある。

［発明の構成コ 本発明は、アクリルアミド系単量体、架橋剤、水。

および重合開始手段の存在下に架橋重合させて。

電気泳動による高分子成分の分離または分析に使用する
ポリアクリルアミド系水性ゲルを製造する方法において
、前記重合開始手段が過酸化物、光増感剤および励起光
の組合せからなり還元剤を含まない方法である。

［発明の構成の詳細な説明コ 本発明においてアクリルアミド系化合物（単量体）と架
橋剤は、水溶液または水分散液として水に溶解または分
散させておき、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合
した水性ゲル媒体を形成させる。本明、ＷＳにおいては
特にことわらないかぎリ、（水に）溶解とく水に）分散
の両者を含めて単に（水に）溶解といい、水溶液と水分
散液の両者を含めて単に水溶液という。溶媒または分散
媒としては、水だけでなく、所望により加えられる有機
溶媒を含む水−有機溶媒混合物をも包含する。

本発明に用いることができるアクリルアミド系化合物（
単量体）の例としては、アクリルアミド。

Ｎ−メチルアクリルアミド、　Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド。

ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホモコグ
；メタクリルアミドがある。これらの化合物は単独で、
または２種以上を組合せて用いることができる。これら
の化合物のうちではアクリルアミドが好ましく、またア
クリルアミドと他のアクリルアミド系化合物の１種以上
との併用も好ましい。

架橋剤としてはｒ　Ｅ　１ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
Ｊ２（４）、２１３−２１９（＋９８１）、同誌２（４
）、２２０−２２８（１９８１）等に記載の二官能性架
橋剤化合物、特願昭５９−１２２６Ｇ２等に記載の三官
能性以上の架橋剤化合物を用いることができる。三官能
性架橋剤の具体例として、　Ｎ、Ｎ’−メチレンビスア
クリルアミド（Ｂ　Ｉ　Ｓ）　；　Ｎ、Ｎ’−プロピレ
ンビスアクリルアミド（ＰＢＡ）；ジアクリルアミドジ
メチルエーテル（ＤＡＥ）；１，２−ジアクリルアミド
エチレングリコール（Ｄ　Ｅ　Ｇ）　；エチレンウレア
ビスアクリルアミド（Ｅ　Ｕ　Ｂ）　；エチレンジアク
リレート（Ｅ　Ｄ　Ａ）　；　Ｎ、Ｎ”−ジアリルタル
タルジアミド（Ｄ　Ａ　Ｔ　Ｄ　）；Ｎ、Ｎ’−ビスア
クリリルシスタミン（ＢＡＣ）がある。三官能性架橋剤
の具体例として、１，３．５−　）リアクリロイルへキ
サヒドロ−８−トリアジン（ＴＡＨＴ）；）リアリルシ
アヌレート（ＴＡＣ）；トリアリルイソシアヌレート（
ＴＡ　ＩＣ）等がある。これらの架橋剤のうちではＢＩ
ＳとＴＡＨＴが好ましい、架橋剤は２種以上を組合わせ
て用いることもできる。

架橋剤の量は、単量体の重量に対して約１ｗ％から約３
０ｗ％、好ましくは約２Ｗ％から約２５ｗ％の範囲で用
いられる。

本発明の方法で製造する電気泳動媒体にはアガロースを
添加することができる。アガロースとしては特開昭５５
−５７３０　、特開昭５５−１１０９４６　、特表昭５
７−５０２０９８　、特開昭５９−１２６２３６等に記
載の低電気浸透性アガロース、中電気浸透性アガロース
、高電気浸透性アガロースのいずれも用いることができ
る。アガロースの添加量は単量体と架橋剤を含む水性ゲ
ルの容積に対して約帆２ｗ／ｖ％から約２．Ｏｗ／ｖ％
、好ましくは約０．九／Ｖ％から約１．２ｖ／ｖ％の範
囲である。

本発明の方法で製造される電気泳動媒体には水溶性ポリ
マーを添加することができる。水溶性ポリマーとしては
特開昭５９−１２６２３６　、特開昭６０−６０５４８
等に記載の分子量約１万から約ｌＯＯ万の範囲の付加重
合型または縮重合型の水溶性の非イオン性ポリマーを用
いることができる。付加重合型の水溶性の非イオン性ポ
リマーの例としてポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドンがある。縮重合型の水溶
性の非イオン性ポリマーの例としてポリエチレングリコ
ール、ポリプロピレングリコールがある。これらの水溶
性ポリマーのうちではポリアクリルアミドとポリエチレ
ングリコールが好ましい。水溶性ポリマーの添加量は単
量体と架橋剤の合計重量に対して約２−％から約１００
豐％、好ましくは約５Ｗ％から約５０−％の範囲である
。アガロースおよび／または水溶性ポリマーをゲル媒体
に添加する場合には、その添加時期は通常単量体と架橋
剤を水に溶解する時からポリアクリルアミド系水性ゲル
の形成時までの間が好ましい。

本発明の方法で製造される電気泳動媒体を蛋白質または
複合蛋白質（例えば、リボプロティン。

グリコプロティン等）の分離または分析に用いる場合に
は、変性剤として陰イオン性界面活性剤を含有させるこ
とが好ましいか、または必須であることが多い。陰イオ
ン性界面活性剤を電気泳動媒体に含有させることにより
蛋白質または複合蛋白質の効率的な分離とそれらの分子
量測定が可能になる。電気泳動媒体を核酸フラグメント
の分離または分取の目的に用いる場合には陰イオン性界
面活性剤の添加は不要である。

陰イオン性界面活性剤の例としてはアルキル硫酸塩をあ
げることができ、殊に炭素原子数１０以上の長鎖アルキ
ル基を有するアルキル硫酸塩が好ましく用いられる。塩
を形成する陽イオンとしては。

ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン等
のアルカリ金属イオンが一般的であり、これらのうちで
はナトリウムイオンが用いやすい。

アルキル硫酸塩のうちではドデシル硫酸塩（ナトリウム
塩、カリウム塩、リチウム塩等）が好ましく、なかでも
ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）が最も好ましい
。

変性剤としての陰イオン性界面活性剤の添加量は単量体
と架橋剤を含む水性ゲルの容積に刻して約２．Ｏｖ／ｖ
％以下、好ましくは約０．１ｗ／ｖ％から約１．５Ｗ／
Ｖ％の範囲である。陰イオン界面活性剤の添加時期は通
常単量体と架橋剤を含む諸成分を水に溶解する時から水
性ゲルの形成時までの間が好ましい。

本発明の方法で製造されるポリアクリルアミド系水性ゲ
ル電気泳動媒体には湿潤剤としてグリセロール、エチレ
ングリコール等のポリオール化合物を添加することがで
きる。その４Ｂ加量は水性ゲル媒体の容積に対して約１
ｗ％から約４０−％の範囲である。

本発明の方法で製造されるポリアクリルアミド系水性ゲ
ル電気泳動媒体を核酸フラグメントの分離または分取に
用いる場合には核酸の高分子量フラグメント部分での泳
動像バンド幅の広がりと個々の泳動像（フラグメント像
）の歪曲を防止または減少させる目的でグリセロールを
添加することができる。この目的でのグリセロールの添
加量は単量体と架橋剤を含む水性ゲル媒体の容積に対し
て約０．１ｗ／ｖ％から約１　、Ｏｗ／ｖ％、好ましく
は約Ｑ、３ｗ／ｖ％から約０．８讐／Ｖ％までの範囲で
ある。グリセロールの添加時期は通常単量体、架橋剤を
水に溶解する時から水性ゲルの形成時までの間が好まし
い。

本発明の方法で製造される電気泳動用ゲル媒体には電気
泳動される試料に応じて電気泳動実施時のｐＨ値を２．
５から１０．０の範囲内の所望の値に緩衝できる公知の
緩衝剤から適宜選択して含有させることができる。電気
泳動ゲル媒体を核酸フラグメントの分離または分取に用
いる場合には８．０から１０．０．好ましくは８．０か
ら９．０の範囲内の所望の値に緩衝できる公知の緩衝剤
から適宜選択して含有させることができる。

用いうる緩衝剤としては９日本化学会編「化学便覧　基
礎編」（東京、丸善■、　１９６６年発行）　＋３１２
−１３２０頁、　Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａ
１編ｒＤａｔａｆｏｒＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈＪ第２版（０ｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅＣ
ｌ１ｒｅｎｄｏｎＰ　ｒｅｓｓ、１９６９年発行）　４
７６−５０８頁。

ｒＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　５．４６７頁以降（
１９６６年）、ｒＡｎａ−ｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂ　１ｏ
ｃｈｅ＋ｇｉｓｔｒｙＪ　■ｌ、　３００−３１０頁（
１９８０年）等に記載のｐＨ緩衝剤系がある。

ｐＨ２，５〜１０．０の範囲のｐｌ＋緩衝剤の具体例と
して。

バルビツールを含む緩衝剤；トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）を含む緩衝剤；燐酸塩を含
む緩衝剤硼酸塩を含む緩衝剤；酢酸または酢酸塩を含む
！！衝剤；拘備酸または杓ｍ酸塩を含む緩衝剤：乳酸ま
たは乳酸塩を含むｗｋ衝剤；グリシンを含む緩衝剤；　
Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉ
ｃｉｎｅ）　；　Ｎ−２−ヒドロキシピペラジン−Ｎ’
−２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸Ｎａ塩また
はに塩等；Ｎ−２−ヒトロキシエチルビベラジンーＮ’
−３−スルホン酸Ｎａ塩またはに塩等；　Ｎ−［トリス
（ヒドロキシメチル）メチル］・３−アミノプロパンス
ルホン酸Ｎａ塩またはに塩等；およびこれらのいずれか
と必要により糾合せられる酸、アルカリまたは塩がある
。好ましいＷ！衝剤の具体例として、燐酸二水素カリウ
ム−燐酸水素二ナトリウム；Ｔｒｉｓ−硼Ｍナトリウム
；７ｒｉｓ−硼酸ナトリウム−ＥＤＴＡ・２Ｎａ塩；Ｔ
ｒｉｓ−杓ｍｉ’ａ；パルビタールナトリウム−酢酸ナ
トリウム：パルビタールナトリウム−塩酸；パルビター
ルーバルビタールナトリウム；酢酸−酢酸ナトリウム；
乳酸−乳酸ナトリウム；杓甫酸−燐酸二水素ナトリウム
；　Ｂｉｃｉｎｅ　；　ＩＩＥＰＰｓＯ；１１ＥＰＰｓ
Ｏナトリウム塩；　ＥＰＰＳ　；　ＥＰＰＳナトリウム
塩；ＴＡＰＰＳ　；　ＴＡＰＰＳナトリウム塩等がある
。

ｐＨ８，０〜１０．０の範囲のｐＨ緩衝剤の具体例とし
て。

Ｔｒｉｓ　；　Ｂｉｃｉｎｅ　；　Ｎ−２−ヒドロキシ
ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−スル
ホン酸Ｎａ塩またはＩ（塩等；Ｎ−２−ヒドロキシエチ
ルピペラジン−Ｎ′−３−スルホン酸Ｎａ塩またはに塩
等；　Ｎ−［）リス（ヒドロキシメチル）メチル］−３
−アミノプロパンスルホン酸Ｎａ塩またはｌ（塩等；お
よびこれらのいずれかと必要により組合せられる酸、ア
ルカリまたは塩がある。好ましいｐＨ緩衝剤系の例とし
てＴｒｉｓ−ｆｉｇ酸−ＥＤＴＡ・２Ｎａ塩（ｐＨ８，
２〜８．３用絹成）がある。

本発明の方法で製造される電気泳動用媒体は実質的に無
色透明であることが泳動像の検出または読取りに一般的
に好ましい。

本発明の方法で製造されろ電気泳動用媒体を電気泳動媒
体膜として用いる場合には、実質的に電気不伝導性で水
不浸透性の平滑な表面のシート状（フィルム状、または
平板状）支持体の上に設けるのが好ましい。実質的に電
気不伝導性て水不浸透性の平滑な表面のシート状支持体
としては公知のガラス板、有機ポリマーシート等を用い
ろことができる。有機ポリマーシートの具体例としてポ
リエチレンテレフタレート、ビスフェノールへのポリカ
ルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、
セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、
セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマー
からなる厚さ約５０ｕｍから約１１．好ましくは約８０
ｕｍから約５００ｐｍの範囲の透明な、すなわち波長約
２００ｎｍから約９００ｎｍの範囲内の少なくとも一部
の範囲の波長の電磁輻射線を透過させる平滑な表面を有
するシート状または平板状の支持体がある。有機ポリマ
ー支持体を用いる場合にはその表面を親水化してゲル媒
体膜との接着を良好にするために、紫外線照射、グロー
放電処理、コロナ放電処理、火焔処理、電子線照射。

ケミカルエツチング、電解エツチング等の公知の表面処
理方法を適用することができろ。有機ポリマー支持体の
表面には必要に応じて特開昭５９−１６６８５０　、特
開昭５９−２１２７５３　、特願昭５９−５０２９３．
特願昭５９−９６１５３．特願昭５９−１３６２４８．
特願昭５９−１０３３０８等に記載の下塗層または接着
層を設けて支持体の上に設けられる水性ゲル媒体膜と支
持体との接着を強固にすることができる。

本発明の電気泳動用媒体の製造方法においては前述の諸
成分とラジカル重合開始剤組成物を含む水溶液（以下、
ゲル形成液ということがある）を調製し９次いで平面状
支持体の上に層状に流延または塗布し２分子状酸素の不
存在下で紫外線照射して、単量体くアクリルアミド系化
合物）と架橋剤とを架橋重合させてポリアクリルアミド
系ゲル媒体膜を製造する。

本発明の電気泳動用媒体の製造方法に適用されるラジカ
ル重合開始手段は、　ｒ　Ｅ　Ｉｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓＪ２（４＞、２＋３−２１９（＋９８１）、同誌
２Ｌ（４）、２２０−２２８（＋９８１）。

特開昭５９−１２６２３６　、青水、永井編「最新電気
泳動法」（１９７３年発行）等に記載の低温ラジカル重
合開始剤組成物に用いられる過酸化物と光増感剤の絹合
せにさらに励起光を組合せからなる。過酸化物の具体例
として、ベルオクソニ硫酸アンモニウム、ベルオクソニ
＠酸アルカリ金属塩（アルカリ金属の例、ナトリウム、
カリウム等）、過酸化水素等がある。光増感剤の具体例
として、リボフラビン等がある。ラジカル重合開始剤組
成物の例としてリボフラビンーベルオクソニ硫酸アンモ
ニウム混合物、リボフラビン−過酸化水素混合物等があ
る。

ラジカル重合剤組成物の添加量は、単量体と架橋剤の合
計重量に対して約Ｏ０九％から約５．０ν％、好ましく
は約０．５ν％から約３．０−％の範囲である。

励起光としては光増感剤の励起に有効な波長約２００ｎ
ｍ〜約９００ｎｍの範囲（近紫外線から可視光の範１１
１Ｎ）を含む光であれば制限なく用いることができる。

励起光の強さと照射時間はゲル形成液の層の厚さ方向に
実質的に均一にゲル化するように適宜に選択すればよい
。励起光の光源の１体例としては、高圧水銀灯、超高圧
水銀灯、低圧水銀灯、ハロゲンランプ、メタルハライド
ランプ、タングステンランプ、重水素ランプ、キセノン
放電灯等がある。

本発明の方法で製造される電気泳動媒体はゲル１度とし
て、　Ｓ　、　　Ｈｊｅｒｔｅｎ：ｒへｒｃｈｉｖｅｓ
　ｏｆ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃｓ」Ｉ、（Ｓｕｐｐｌ、）、１４７−１５
１（＋９６２）に記載の定義に従って表示して、単重体
、架橋剤および水からなるゲル媒体の容積に対して、単
量体と架橋剤の合５１屋が約３讐／Ｖ％から約４０ｗ／
ｖ％の範囲で用いられる。

本発明の方法で製造される電気泳動媒体ゲル膜の厚さは
約５０ＬＩｍから約５ｍｍ、好ましくは約８０ｕｍから
約３ｍｍの範囲である。

ゲル形成液を平面状の支持体の表面上で架Ｖ１重合させ
る場合には、ゲル形成液の流延塗布とその後の架橋重合
を窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素の不存在下で実施す
るか、あるいは流延塗布したゲル形成液の表面上に直ち
にカバー用フィルム。

シートまたは板等の被覆材わ［て覆い架橋重合させるこ
とが好ましい。この目的に使用される被Ｉｔオ科として
は前述の平面状支持体と同様な素相からなるものを用い
ることができる。カバーフィルムが有機ポリマーフィル
ムである場合、その厚さは約３００μｍ以下であり、実
用的な範囲としては約４１＋ｍから約２００ｕｍ、好ま
しくは約約４ｐｍから約１１００ｐである。被覆材料が
ガラス板の場合、その厚さは平面状ガラス板と同様な厚
さであればよい。

本発明の方法で製造される電気泳動用媒体ゲル膜は前述
の諸文献や特許明細書等に記載の公知の方法に従って、
水平型および垂直型スラブ電気泳動法等に用いろことが
できる。

（以下余白） 実施例１および比較例１ 第１表に記載の組成の本発明のゲル形成液試料Ａおよび
従来技術による比較用ゲル形成液試料Ｂを調製した。２
種のゲル形成液を窒素雰囲気下２５°Ｃ暗所に５時間数
！シ、第２表に記載の各時間経過時点てゲル膜塗布のた
めにゲル形成ｉαを取り出し、その一部の液でゲル形成
液の粘度を測定して第２表に記載の結果を得た。

試料へでは調製後３００分経過までゲル形成液調製時と
同じ粘度値で粘度上昇が全く生しなかったのに対し、試
料Ｂでは調製後の時間経過とともに顕著な粘度の上昇が
生じ、２０分以上の放置ではゲル化した。

他方で、平滑表面の厚さ２ｍｍ、サイズ２０ｃｍ　Ｘ　
２０ｃｍの長方の平面状カラス板２枚を、縁辺部に厚さ
５００ｕｍ、輻ｌ１０ｌＴ１のスペーサー板を固定して
対向させてガラスモールドを形成し、ガラスモールドの
中に第２表の各時間経過した２に１の形成液を流し込ん
だ。周囲温度２５℃で各ゲル形成液に１００Ｗ高圧水銀
灯をｌｏｃｍの距離から照ｑ＝＋　ｔ、、っつ１０分静
置し２枚のガラス板の間で架橋重合させて厚ざ５００ｕ
ｍのポリアクリルアミド水性ゲル膜を形成した。

ガラスモールドの中にゲル形成液を流し込む際に試料Ａ
ではいずれの時間経過のゲル形成液でも全く気泡が混入
せず均一なゲル膜が形成したが。

試料Ｂでは放置時間の長いゲル形成）αはと気泡の混入
が多くて不均一なゲル膜が形成した。

上記のようにして得られた２種のゲル膜を用いて標準蛋
白質を常法に従い電気泳動させ９次いて電気泳動後のゲ
ル膜のカバーフィルムを静かに剥して除去し、ゲル膜全
体を帆１％コーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ　Ｂｌ
ｕｅ）Ｒ−２５０（Ｃｏｌｏｒ　Ｉｎｄｅｘ　Ｃｏｎ５
ｔｉｔｕ−ｔｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　４２６６０）水溶
液に浸漬して青色に染色して染色された泳動像を観察し
た。その結果２本発明の方法で調製したゲル膜Ａでは、
ゲル形成液のＵｆｉ製後の経過時間に関係なく各泳動像
バントは正常て１個々の泳動像の歪は実費的になく、各
ハンド間の分離度も良好もこ保たれていた。従来技術の
方法で調製したゲル膜Ｂては、ゲル形成）αの調製後の
経過時間が長くなるにつれて各泳動像バンドと個々の泳
動像の歪が大きくな番〕、各ハント間の分離度も低下し
た。

（以下余白） 第１表 第２表 実施例２および比較例２ 第３表に記載の組成の本発明のゲル形成？α試料Ｃおよ
び従来技術による比較用ゲル形成γα試料りを調製し、
それぞれをすぐに特願昭５９−６１６６７明細書記載の
連続塗布装置と同様な装置に接続されている２５℃の恒
温貯蔵タンクにいれ、すぐに連続塗布を始めた。塗布方
法は、上記明細書に記載の方法に従い、紫外線照射処理
で表面な親水性にした厚さ１８０ｕｍの平滑表面の鴬色
透明ポリエチレンテレフタレー）　（ＰＥＴ）フィルム
の上に２種のゲル形成液それぞれをゲル膜の厚さが５０
０ｕｍになるようにして長尺連続塗布し、　５００　Ｗ
キセノン放電灯照射下窒素雰囲気中でポリアクリルアミ
ド水性ゲル膜を形成した。

一方第４表に記載の経過時間にタンク内からゲル形成液
を少量抜き取りすくにその粘度を測定して第１１表に記
載の結果を得た。

試料Ｃでは調製後３００分経過までゲル形成液調製時と
同じ粘度値で粘度上昇が全く生じなかったのに対し、試
料りでは調製後時間の経過とともに顕著な粘度の上昇が
生じ、１５分以上の放１ではゲル化して粘度の測定は不
可能であった。

ゲル膜の塗布形成の際に試料Ｃてはいずれの時間経過の
ゲル形成ταでも５時間余にわたる連続塗布でいずれも
膜厚の局所的な不均一は発生せず。

均一な膜厚の長尺のゲル膜が得られた。

試料りでは塗イ１１開始後約５分（ゲル形成液調製ｆ＆
５分）経過以後はゲル膜に乱れが発生し、膜厚の局所的
な不均一が多数個所で発生した。その上。

塗布開始後約１５分経過時点てゲル形成液がタンク内で
ゲル化してしまい、２布不可能になった。

得られた２種のゲル膜それぞれについて第４表に記載の
経過時間の部分を２０ｃｍ　Ｘ　２０ｃｍのサイズζこ
裁断し、厚さ＋　００　ｕｍの無色透明ＰＥＴフィルム
をゲル膜の表面に重ねて軽く圧力を全面に均一にかけて
カバーフィルムを設けた。

上記のようにして得られた２種のゲル膜を用いて標準蛋
白質を常法に従い電気泳動させ１次いで電気泳動後のゲ
ル膜のカバーフィルムを静かに剥して除去し、ゲル膜全
体を０．１％コーマシープルー水溶液に浸漬して青色に
染色して染色された泳動像を観察した。その結果１本発
明の方法で調製したゲル膜Ｃては、ゲル形成液の調製後
の経過時間に関係なく５時間系にわたり連続７ｊ！布し
て得られたゲル膜全てについて各泳動像バンドは正常で
。

個々の泳動像の歪は実質的になく、各バンド間の分離度
も良好に（＾たれていた。従来技術の方法で調製したゲ
ルｌｌＩＤでは、塗布開始後５分以降（ゲル形成液の：
ＪＥＩ製後の経過時間５分以降）のゲル膜について各泳
動像バンドと個／ンの泳動像の歪が大きくなり、各バン
ト間の分離度も低下した。

このように９本発明の方法により調製後の経時によるゲ
ル形成液の粘度変化は全く認められず。

高分解能を有するポリアクリルアミド水性ゲル膜を長時
間にねる連続塗布で大量の製造が可能なことが明らかで
ある。一方従来技術の方法では調製後の経時によるゲル
形成液の粘度変化（粘度増大）が著しく、ゲル形成液の
短時間でのゲル化によりポリアクリルアミド水性ゲル膜
を長時間にねる連続塗布で大量の製造は不可能なことが
明らかである。また、粘度の増大したゲル形成液から形
成したゲル膜ては泳動像バンドの歪と各バンド間の分離
度の低下が明らかである。

（以下余白） 第３表 第４表 木ニゲル１じしたため粘度測定不可能 実施例３および比較例３ 第５表に記載の組成の本発明のゲル形成７α試料Ｅおよ
び従来技術による比較用ゲル形成液試料Ｆ、を調製し、
ゲル膜の厚さが２１ＩＩＩ＋になるようにした他はそれ
ぞれ実施例２および比較例２と同様にしてポリアクリル
アミド水性ゲル膜を形成し、またゲル形成液の粘度を測
定して第６表に記載の結果を得た。

試料Ｅては調製後３００分経過までゲル形成液調製時と
同し粘度値で粘度上昇が全く生じなかったのに対し、試
料Ｆでは調製後時間の経過とともに顕著な粘度の上昇が
生し、１５分以上の放置ではケル化して粘度の測定は不
可能であった。

ゲル膜の塗布形成の際に試料Ｅてはいずれの時間経過の
ゲル形成液でも５時間系にわたる連続・、ｆ！布でいず
れも膜厚の局所的な不均一は発生せず。

均一な膜厚の長尺のゲル膜が得られた。

試料Ｆては塗布開始後約５分（ゲル形成液調製後５分）
経過以後はゲル膜に乱れが発生し、膜厚の局所的な不均
一が多数個所で発生した。また。

塗布開始後約１５分経過時点てゲル形成液がタンク内で
ゲル化してしまい、塗布不可能になった。

得られた２種のゲル膜それぞれについて第６表に記載の
経過時間の部分を２０ｃｍ　Ｘ　４０ｃｍのサイズに裁
断し、厚さＩｏｏｐｍの無色透明ＰＥＴフィルムをゲル
膜の表面に重ねて軽く圧力を全面に均一にかけてカバー
フィルムを設けた。

大腸菌のブラスミＦｐＢＲ−３２２を制限酵素Ａｓｕ　
Ｉで処理したＤＮＡフラグメント試料を上記の２種のゲ
ル膜を用いてを常法に従い電気泳動させ９次いＣ電気泳
動後のゲル膜のカバーフィルムを静かに剥して除去し、
エチジウムプロミド染色してＯＮへの分解パターンの泳
動像を観察した。その結果２本発明の方法で：ＪｆＩ製
したゲル膜Ｅでは、ゲル形成液の調製後の経過時間に関
係なく５時間余にわたり連続塗布して得られたゲル膜全
てについて正常な染色パターンを示した。従来技術の方
法で調製したゲル膜Ｆでは、塗布開始後５分以降（ゲル
形成イαの調製後の経過時間５分以降）のゲル膜につい
て染色パターンに大きな歪が生じた。

また、ＤＮＡフラグメントをゲル膜から切り出す操作に
関しても、ゲル膜Ｅては、ゲル形成液の調製後の経過時
間に関係なく５時間余にわたり連続塗布して得られたゲ
ル膜全てについて容易であった。一方、ゲル膜Ｆては、
塗布開始後５分以降（ゲル形成液の調製後の経過時間５
分以降）のゲル膜については同し操作が極めて困難であ
った。

このように１本発明の方法により：Ａｔ１８１後の経時
によるゲル形成液の粘度変化は全く認められず。

高分解能を有するポリアクリルアミド水性ゲル膜を長時
間にねる連続塗布で大量の製造が可能なことが明らかで
ある。一方従来技術の方法では調製後の経時によるゲル
形成液の粘度変化（粘度増大）が著しく、ゲル形成液の
短時間でのゲル化によりポリアクリルアミド水性ゲル膜
を長時間にわろ連続塗布で大量の製造は不可能なことが
明らかである。また、粘度の増大したゲル形成液から形
成したり”ル膜ではＤＮＡ分解パターンの歪とＤＮＡフ
ラグメントの切り出し操作が困難なことが明らかである
。

第５表 ←：試料Ｅと同し添加漬 第６表 ＊：ケル化したため粘度測定不可能 ［発明の効果］ 本発明のポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動媒体の
製造方法は、励起光の不存在下ではゲル形成液の調製後
の時間経過によるゲル形成液の粘度変化（粘度増大）と
ゲル化が防止されており、高分子成分、特に蛋白質の分
離または分析用の高分解能ポリアクリルアミド系水性ゲ
ル電気泳動媒体膜、あるいは核酸フラグメン］・分離ま
たは分取用の高分離能ポリアクリルアミド系水性ゲル電
気泳動媒体膜を容易に長時間にわたる連続塗布で太贋に
製造することができろ。また本発明の製造方法により一
時に多量のゲル形成液を調製し、励起光の不存在下に保
存しておき、必要の都度少量ずつゲル形成液を取出して
ポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動媒体股を製造す
ることも可（＋ヒである。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）アクリルアミド系単量体、架橋剤、水、および重
   合開始手段の存在下に架橋重合させて、電気泳動による
   高分子成分の分離または分析に使用するポリアクリルア
   ミド系水性ゲルを製造する方法において、前記重合開始
   手段が過酸化物、光増感剤および励起光の組合せからな
   り還元剤を含まないことを特徴とする方法。
2. （２）前記ポリアクリルアミド系水性ゲルがさらに変性
   剤として陰イオン界面活性剤を含む特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。
3. （３）上記陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩である
   特許請求の範囲第２項に記載の方法。
4. （４）上記アルキル硫酸塩がドデシル硫酸のアルカリ金
   属塩またはアンモニウム塩である特許請求の範囲第３項
   に記載の方法。
5. （５）上記アルキル硫酸塩がドデシル硫酸のナトリウム
   塩またはカリウム塩である特許請求の範囲第３項に記載
   の方法。
6. （６）有機ポリマー支持体の上で架橋重合を行わせる特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。
7. （７）有機ポリマー支持体がポリエチレンテレフタレー
   トシートである特許請求の範囲第６項に記載の方法。
8. （８）光増感剤がリボフラビンである特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。
9. （９）過酸化物がペルオクソ二硫酸塩である特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。