JPS63219392A - 抗ウシコラゲナーゼインヒビター抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はたん白質に対する抗体に関するものであり、さ
らに詳しく言えば、ハイプリドーマを用いてのウシコラ
ｒナーゼイ／ヒビターに対するモノクローナル抗体の製
造ならびにそれにより得られたモノクローナル抗体、及
びそれらモノクローナル抗体を用いてのウシコラダナ−
４ｔ”インヒビター及びヒトコラゲナーゼインヒビター
の精製に関するものである。

コラゲナーゼインヒビター（ティシュ・インヒビター・
オツ・メタロプロテアーゼ：　ＴＩＭＰ）はヒト及びそ
の他の動物の骨、皮膚、歯髄、羊水、血清、血小板、慢
性リウマチ関節液中及び関節軟骨細胞、滑液細胞、各種
組織由来線維芽細胞、線維肉腫細胞培養外液中にその存
在が認められておシ、分子量約３０　ＫＤ　（キロダル
ト／）の糖九ん白質といわれている。（Ｍｕｒｐｈｙら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、　１９５．１６７〜１７０　、　１９８１　；Ｗｅ
ｌｇｕｓら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｂｅｍ、　２５８　、１２２５９〜１２２６４　、１
９８３　；　Ｋ１５ｈｉら、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
９６　、３９５〜４０４　、１９８４ら参照）。一方、
角膜潰瘍、歯周疾患、３度熱傷肉芽、先天性表皮水痘症
、慢性関節リウマチ、難治性皮膚潰瘍らでコラゲナーゼ
活性の上昇が認められておＦ）　（Ｋｉｓｈｉら、Ｂｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓ、　５　、１４９〜１５６　
。

１９８４参照）、それら疾患の治癒を遅延させているこ
とが知られている。ところで、本発明者らは、ウシ未萌
出知歯根部歯髄をイーグルＭＥＭ培地中で培養すると大
量のコラゲナーゼインヒビターを産生ずることを見い出
し、これらコラゲナーゼインヒビターを高コラｒナーゼ
活性を示す上記疾患の治療に適用できないかと考えたが
、従来のカラムクロマトグラフィーを用いる方法ではそ
の精製は容易ではない。

酵素あるいはたん白質を簡便、高収率に精製する場合に
、抗体を用いて行うアフィニティ精製法が報告されてい
るが、特異性の点からして、モノクローナル抗体を用い
ることがより有利である。このような理由によシ抗体産
生Ｂ細胞またはその前駆細胞と連続的分裂増殖可能な骨
髄細胞（ミエローマ細胞）を融合させ、これら両方の細
胞の特性を有している均質な融合細胞（ハイプリドーマ
）を得ようとする試みがなされ、そのクローンが得られ
ることが明らかＫされている（　Ｋ２；ｈｌｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ　、　２５６．４９５〜４９７　＋１９７５
）。ところが、ウシコラゲナーゼインヒビターに対する
均一で特異性の高いモノクローナル抗体を連続的にかつ
大量に製造する方法、及びそれら抗体を用いてのコラゲ
ナーゼインヒビターのアフイニティ精製法は従来報告さ
れていない。

本発明は、ハイプリドーマによるＩｇＧクラス抗ウシつ
ラｒナーゼインヒビター抗体の製造方法及びそれらモノ
クローナル抗体を用いてのウシ及びヒトコラゲナーゼイ
ンヒビターの精製法を提供するものである。すなわち、
本発明は動物を、ウシコラゲナーゼインヒビターで免疫
シ、該動物からの抗つシコラｒナーゼインヒビター産生
細胞とミエローマ細胞によシハイブリドーマを形成させ
、該ハイブリドーマをクローン化する。次いで抗つシコ
ラｒナーゼインヒビター抗体を産生ずるクローンを選択
し培養することからなるＩｇＣ）クラス抗体の製造法及
びこのようにして得られた抗体、すなわち、ウシコラゲ
ナーゼインヒビターに存在する抗原決定基のうちのいず
れか一つの抗原決定基のみに免疫交差反応性を有する各
モノクローナル抗体、及びそれらモノクローナル抗体を
用いてのウシコラｒす一ゼインヒビター及びヒトコラゲ
ナーゼインヒビターの精製法を提供するものである。

以下、実施例及び参考例により本発明を具体的に説明す
る。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない
。

実施例　１ 抗つシコラｒナーゼインヒビターモノクローチル抗体の
作製 （ａ）　　抗原−ウシコラゲナーゼインヒビターの調製 Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、９６　、３９５〜４０４　（１
９８４）に記載の本発明者らの方法に従いウシ未萌出知
歯の根部歯髄をイーグルＭＥＭ培地（日永製薬製）で培
養した培養外液からＣｏｎ　Ａ−セファロース、ウルト
ロｒルＡｃＡ　４４およびＤＥ−５２セルロースの各カ
ラムを用いてコラゲナーゼインヒビターを精製した。精
製インヒビターはＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　８０　、５
７９〜５９９　（１９７３）に記載のＬａｅｍｍｌｉ　
らの方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミド電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）で調べたところ分
子量約３２，０００ダルトン（Ｄ）の単一パンＰを示し
た。

（ｂ）　　抗体産生細胞の調製 ６週令のＢａ１　ｂ／ｃ雌マウマウス２匹ずフロインＰ
完全アジュバント中で、前記（ａ）で記述した精製ウシ
コラゲナーゼインヒビターで初回免疫する。マウスにそ
れぞれ４８μｇのウシコラゲナーゼインヒビターを０．
４−の溶液として腹腔内投与する。さらに５０日目に生
理食塩水に溶解した８４μｇのウシコラゲナーゼインヒ
ビターを追加免疫する。最終免疫として５８日目に腹腔
内投与（９５μｇ１５００μ！生理食塩水）により補助
免疫し、６日後にマウス肺臓を取シ出し、肺細胞を調製
する。

（ｃ）　　細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いる。

ＲＰＭＩ　１６４０培地：　ＲＰＭＩ　Ａ　１６４０　
（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ　）に重炭
酸ナトリウム（１２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１
ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）　、ペニシリンＧカ
リウム（５０Ｕ〜）、（ｉｉｌＥ酸ストレプトマイシン
（５０μ７７７ｍ１）、および硫酸アミカシン（１００
μＩ／／ｒｎｌ）を加え、ｒライアイスで−を７．２Ｋ
Ｌ、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌濾過す
る。

Ｎ５−ｊ培地：上記ＲＰＭＩ　１６４０培地に除菌濾過
した子牛胎児血清（Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ　ｔ
ｓ　）を１５％（ｖ／／ｖ）の濃度に加える。

ＰＥＧ４，０００溶液：　ＲＰＭＩ　１６４０培地のポ
リエチレングリコール４，０００　（ＰＥＧ　４，００
０、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ、。

Ｉｎｃ、）５０チ（ｗ／ｗ）無血清溶液を調製する。

８−アザグアニン耐性ミエローマ側ＭＮＳ−１（Ｐ３−
ＮＳ１−１）との融合は５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏ
ｄ　ｉｎ　ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（
ｅｄ、Ｂ、Ｂ、　Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓ、Ｍ、　
Ｓｈｉｉｇｉ　）、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　
Ｃｏｍｐａｎｙ　（１９８０）、３５１〜３７２に記載
の０１らの方法を若干改変して行った。

（２）前記（ｂ）で調製した有核膵臓細胞（生細胞率１
００％）とミエローマ細胞（生細胞率１００チ）とを５
：１の割合で融合する。膵臓細胞とミエローマ細胞とを
別に前記のＲＰＭＩ　１６４０培地で洗滌する。次に同
じ培地にけん濁し、融合させるため上記の割合で混合す
る。容量５０ｄの円錐形スチロール樹脂製試験管（Ｉｗ
ａｋｉ　Ｇｌａｓｓ　）を用い、４０１７（７）　ＲＰ
ＭＩ　１６４０培地中４００：）１，１０分間遠心し、
上清を完全に吸出する。沈殿細胞に６７℃加温ＰＥＧ　
４，０００溶液１．３−を穏やかに攪拌しながら１分間
で滴下し、さらに１分間攪拌し細胞を再けん濁、分散さ
せる。次に３７℃加温ＲＰＭ１１６４０培地１，３−を
１分間で滴下する。この操作をさらに１回繰返した後、
同培地９ｄを２〜３分間で常に攪拌しながら滴下し細胞
を分散させる。

これを４００１７，１０分間遠心分離し、上清を完全に
吸引除去する。次にこの沈殿細ＭＫ３７℃加温ＮＳ−ｊ
培地１２．９１をすみやかに加え、細胞の大きい塊りを
１０ａ＋？のピペットを用いて注意深くピペッティング
して分散する。さらに同項ｍ２６１１７を加えて希釈し
、ポリスチレン製９６穴マイクロウェル（Ｉｖｒａｋｉ
　Ｇｌａｓｓ　）にウェル当シロ、０Ｘ１０個１０．１
１１７の細胞を加える。なお、この時使用する９６穴マ
イクロウエルは前処理として０．２１４のＭＳ−１培地
を加え、炭酸ガス培養器中（６７℃）で−晩保温し、使
用時に培地を吸引除去しておく。細胞を加えた上記のマ
イクロウェルを７％炭酸ガス／９３チ空気中で温度３７
℃、湿度１００％下に培養に付する。

（ｄ）　　選択培地によるバイブＩＪ　ｒ−マの選択的
増殖 （１）使用する培地は以下のとおシである。

ＨＡＴ培地：前記（ｃ）で述べたＮ５−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノゾテリン（０，
４μＭ）、およびチミジン（１６μＭ）を加える。

ＨＴ培地ニアミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。

（２）前記（Ｃ）の培養開始後翌日（１８目）、細胞Ｋ
　Ａ？スツールピペットでＨＡＴ培地２　滴（約ｏ、　
ｉｄ）を加える。２．３．５．８．１１日目に培地の半
分（０，１ｄ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１４日
目に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換える。

以降３〜４日毎に培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換
える。通常２〜５週間で充分なハイプリＰ−マの生育が
観察される。ハイツリドーマ生育全ウェルについて次項
（ｅ）記載の固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）に
より陽性ウェルをチェックする。次にフィーダーとして
１０７個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１−をポリス
チレン製２４穴セルウエル（Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ　
）に加えたものを用い、上記で検出された各陽性ハイプ
リｐ−マの全内容物を移す。これを前記（ｃ）における
と同様に７チ炭酸ガス存在下、３７℃で約１週間培養に
付する。その間１〜２回各ウェルの上清０．５ａｔを新
しいＥ（’ｒ培地０．５ｄと交換する。ハイシリＰ−マ
の充分生育した時点で１ＩｓＡ法にょシ陽性を再確認し
、それぞれについて次項（ｆ′）記載の限界希釈法によ
るクローニングを行う。なお、クロー二／グに使用後の
残液をポリスチレン製２５ｃｙｙ７組織培養フラスコ（
Ｉｗａｋｉ　Ｇｌａｓｓ　）に移し、凍結保存用試料を
調製する。

（８）　　固相−抗体結合テスト（ＥＬＩＳＡ）による
抗つシコラｒナーゼインヒビター抗体産生ハイツリドー
マの検索 Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０４．２０５〜２１
４　（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若
干改変した方法を用いる。

この方法は、ハイグリドーマ抗体の検出に適している。

９６穴ミクロタイトレージヨンプレート（Ｆｌｏｗ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）を０．５〜１
．０μｇのウシコラゲナーゼインヒビターでコートし、
次ニ、未コート部分を１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
でブロックする。これに前記（ａ）で得られたハイプリ
ドーマ生育ウェルの上清の一部を加えて室温で約１時間
インキュベートする。２次抗体として西洋わさびペルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン（ｃａｐ
ｐｅｌ　Ｌａｂ、）を加え、さらに室温で約１時間イン
キュベートする。次に過酸化水素と基質である０−フ二
二レンジアミンを加え生成した褐色の程度を肉眼で定性
的に判定するか、あるいはコロナ２波長マイクロプレー
ト光度計（Ｍ’ｒＰ−２２、コロナ電気社）を用いて５
００　ｎｍの吸光度を測定する。

（ｆ）　　クローニング 前記（ｄ）の操作後、各ウェル中には２種以上のハイグ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクロー二／グを行い、モノクローナル抗体産生ハ
イブリｒ−マを取得する。〜５−１培地ｔｎｌ当りフィ
ーダーとして１０７個のマウス胸腺細胞を含むクローニ
ング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエル
、３６ウエルおよび２４ウエルにウェル当り５個、１個
および０．５個のハイブリＰ−マを加える。５日目、１
２日目に全ウェルに各約０．１罰のＭＳ−１培地を追加
する。クローニング開始後１４〜１５日で充分なハイツ
リドーマの生育が認められ、コロニー形成陰性ウェルが
５０慢以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行う。テス
トした全ウェルが陽性でない場合、抗体陽性ウェル中の
コロニー数を確認し、ウェル中に１コロニーが確認され
たウェルを４〜６個選び再クローニングする。

最終的にウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ１７株が得られた。

（ω　モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、モ
ノクローナル抗体は、得られた各７・イプリＰ−マを〜
８−を培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）シ
、その培養上清から得ることができる（モノクローナル
抗体たん白濃度は１０〜１００μｉ／Ｉｌｌである）。

一方、大量に抗体を得るためには牌細胞とミエローマ細
胞の由来動物と同系の動物（Ｂａ１ｂ／ｃ、マウス）に
腫瘍形成促進剤プリスタン（２，６，１０，１４−テト
ラメチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａ１社）をマウス−匹当シ０、５　ＷＬｌ！腹腔内投与
し、１〜３週間後に、各ハイプリドーマ１Ｘ１０個を同
じく腹腔内投与することにより生体内で、さらに、１〜
２週間後、モノクローナル抗体たん白質濃度４〜７〜／
ｄの腹水を得ることができる。

（ｈ）　　モノクローナル抗体の重鎮、軽鎖及びアイソ
タイプ 前記（齢で得られた各々の腹水を先ずウシコラゲナーゼ
インヒビターをコートしたミクロタイトレージョンプレ
ートに前述したＥＬＩＳＡ法に従って結合させる。ＰＢ
Ｓによる洗滌後次に、アイソタイゾ特異性つサギ抗マウ
スＩｇ抗体（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
加える。ＰＢＳによる洗滌後、西洋わさび４ルオキシダ
一ゼ標職ヤギ抗ウサギｘｇａ　（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、
基質として２，２′−アジノージ（５−エチルベンゾチ
アゾリン硫酸−６）および過酸化水素を用いて検出した
。その結果をまとめて後掲の第１表に示した。得られた
ウシコラゲナーゼインヒビターに対するモノクローナル
抗体の内１５個が免疫グロブリン鎖Ｎ／にを、１個がｒ
２ａ／にを、そして、１個がγ２ｂ／にを有していた。

（１）モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（４０チ飽和）
後、塩化す）　ＩＪウム０．０６Ｍを含む４０ｍＭリン
酸緩衝液、ＰＨ８，０で平衡化したＤＥＡＥ−８ｅｐｈ
ａｃｅｌ（ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の非吸着画分を分取
し、このＩｇＧ画分を更に０．４２　Ｍ塩化ナトリウム
を含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，４で平衡化した
５ｅｐｈａｃｒｙｌＳ　−３００５ｕｐｅｒｆｉｎｅ　
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）カラムでｒルｐ過し、培地中
のＦｅ２およびマウス由来のたん白質を分離、除去した
。

（ｊ）　　ヒトコラゲナーゼインヒビターとの交差反応
性 （１）　　ヒトコラゲナーゼインヒビターの調製ヒトコ
ラゲナーゼインヒビターはヒト歯肉繊維芽細胞、Ｇｌｎ
−１（ＡＴＣＣ’Ｊ’ｉ　）を１０％ウシ胎児血清（Ｆ
ｅ２）含有ダルベツコ変法イーグル培地（白水製薬製）
中でコンフルエントまで培養した後、Ｆｅ２を含まない
同培養液で培養した培養外液からウシ）　ｒｆｆｌ”　
ｋ　ＡｃＡ　５４カラムを用いて部分精製した。

（２）交差反応性のテスト 前記（ｉ）項で得られた１７株の精製各モノクローナル
抗体と上記（１）で得られたヒトコラゲナーゼインヒビ
ターとの交差反応性を調べた。その結果を後掲の第２表
に示す。第２表で明らかな如くクローン７−６ＣＩ　、
　７−１９Ｆ６及び７−２１Ｂ１２がヒトコラゲナーゼ
インヒビターと交差した。

これらの結果よシウシヒトコラｒナーゼイ／ヒビターと
ヒトコラゲナーゼインヒビターの抗原認識部位の一部類
似性の可能性が推察される・実施例　２ ウシコラビナ−ゼインヒビターの免疫組織化学染色 ウシ歯髄及びウシ大動脈平滑筋細胞をエタノール、Ｐラ
イアイスで凍結しクリオスタットを用いて５μの切片を
作成した。次に冷アセトン固定を５分間行い実施例１（
ｉ）で得られた精製モノクローナル抗体（クローン７−
１５に８　）を加え、更にフナコシＡＢＣキット（Ｖｅ
ｃｔｏｒ　Ｌａｂ、製）１−用いて染色した。ウシ歯髄
（参考資料１人参照）及び大動脈平滑筋細胞（参考資料
１Ｂ参照）共に明らかな陽性所見を示した。

実施例　６ ウシコラブナ−ゼインヒビターのアフイニテイ精製 （ａ）　　アフイニテイカラムの調製 Ｎａｔｕｒｅ　２１４　、１３０２〜１３０４（１９６
７）に記載のＡｘｄｎら及びＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　６１　、６５６〜６４
３（１９６８）に記載のＣｕａ　ｔｒｅｃａｓａｓらの
方法に従って臭化シアンを介して担体のセファロース４
Ｂにリガンドとして実施例１（１）で得られた精製モノ
クロ−サル抗体を固定化した。次に抗体結合セファロー
ス４ＢｆｆルＱ、３ｍｌをガラス管に充填し、０６１Ｍ
塩化ナトリウム及び５　ｍＭ塩化カルシウム含有３０ｍ
Ｍ　トＩＪスー塩酸緩衝液で平衡化し使用した。

（ｂ）　　コラゲナーゼ活性測定法 炎症土、１２３〜１３０　（１９８４）に記載の水弁ら
の方法を改変して行った。すなわち、１．　ＯＷ／ｒｌ
ｌの濃度のイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ
）−コラーケ０ン（コラ−ダン技術研修会製）０．０５
ｔｎｌ　ｉｃ　１　ｍＭ　ｐ−アミノフェニル酢酸第二
水銀（ＡＰＭＡ）で活性化処理した０、１Ｍ塩化す）　
ＩＪウム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有５０ｍＭ）ＩＪ
スス−酸緩衝液（−７、５）溶解コラゲナーゼ溶液０．
１５ｄを加え３５℃で一定時間反応した。次に８０ｍＭ
ｏ−７エナ／ドロリン又は２００ｍＭエチレンジアミン
四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）　０．０１　ｄを加え反
応を停止させ、更に０．４ｄの７０％エタノール、３０
ｍＭ塩化ナトリウム含有１０　ｍＭ　）リス−塩酸緩衝
液（ＰＨ７，５）を加え攪拌した。その後、３．００　
Ｏｒ、ｐ、ｍ、　１０分間遠心分離し、分解コラ−ｒン
断片を抽出した。コラーｒン分解量（コラ−ダン断片生
成量）は上記コラゲナーゼ含有溶液の代わりに上記緩衝
液のみを加えた場合の抽出液の螢光強度をＯｅｓとし、
一方、反応混液を８０℃、１０分間加熱処理してＦＩ’
ｌ’Ｃ−コラーゲンを変性させ、全ＦＩＴＣ−コラーｒ
ンを抽出した場合の螢光強度を１００％とした時の螢光
強度から求めた。すなわち、なお、コラゲナーゼ活性１
ユニツト（Ｕ）はコラーゲン１μ９ｔ３５℃、１分間で
分解するのに要する酵素量として表示した。

（Ｃ）　　コラゲナーゼインヒビター活性測定法１　ｍ
Ｍ　ＡＰＭＡ活性化コラｒナーゼ溶液にコラゲナーゼイ
ンヒビター含有試料を加え３５℃、１０分間ブレインキ
ュベーション後、上記（ｂ）項の方法により、コラゲナ
ーゼ活性を測定し、コラゲナーゼインヒビター非存在下
のコラゲナーゼ活性を対照とすることにより求めた。す
なわち、コラゲナーゼインヒビター活性１Ｕはコラゲナ
ーゼ活性１Ｕを阻害するのに要する酵素量として表示し
た。

（ｄ）　　最適モノクロ−プル抗体結合アフイニテイカ
ラムの選択 前項（Ａ、）で調製した各種抗体結合カラムにウシ歯髄
培養外液（たん日量１．４１１９）を通し、０．１Ｍ塩
化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有６０鮨トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐｉ（８，０）　２．５ｒｒｔｌで洗
浄し、上記培養外液と洗浄液を合わせて非吸着画分とし
た。次に８Ｍ尿素含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５
）テ溶出（溶出画分）し、０．１Ｍ塩化ナトリウム及び
５ｍＭ塩化カルシウム含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）に対し透析した。後掲の第６表に示した如く両両
分のコラゲナーゼ活性はいずれのカラムにおいても非吸
着画分に認められた。

一方、コラゲナーゼインヒビター活性はクローン７−３
Ｆ１．７−４Ｆ２．７−２０Ｃ２及び７−２１８１２か
らの抗体結合力ジムにおいては溶出画分に認められた（
回収率６０〜７０チ）。又、それらの非吸着画分のコラ
ゲナーゼ活性は培養外液中のそれに比べて約１０倍に増
加するのに対し、コラゲナーゼインヒビター活性は消失
した。クローン７−６ＣＩ及び７−１５Ｅ８からの抗体
結合カラムの場合、非吸着画分のコラゲナーゼ活性及び
コラゲナーゼインヒビター活性の割合は、培養外液中の
それらの活性の割合とほぼ同じであ）、これらのカラム
にコラゲナーゼインヒビターは吸着されないことが明ら
かとなった。

（ｅ）　　コラゲナーゼインヒビターの安定性抗体結合
アフイニテイカラムからコラゲナーゼインヒビターを溶
出する場合の種々の溶出剤中でのコラゲナーゼインヒビ
ターの安定性を検討した。すなわち、ウシ歯髄培養液を
（Ａ）０〜８Ｍ尿素含有３０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（
Ｓ７．５）、（匂０〜４Ｍロダ／カリ含有３０　ｍＭ　
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、（Ｃ）０〜６Ｍ塩
酸グアニジン含有トリス−塩酸緩衝液（４７，５）及び
０〜６Ｍ塩酸グアニジン含有０．２Ｍグリシン−塩酸緩
衝液（ｐＨ２，０）中でそれぞれ３５℃、３０分間イン
キュベーションした後、０．１Ｍ塩化ナトリウム及び５
ｍＭ塩化カルシウム含有３０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（
ｐｉ−１８，０）に対して透析し、残存コラゲナーゼイ
ンヒビター活性を調べた。添付図面、第１図で明らかな
如くコラゲナーゼインヒビター活性は囚〜（Ｄ）のいず
れの条件下でも全く失活は認められなかった。

（ｆ）　　コラゲナーゼインヒビターの溶出条件の検討 ウシ歯髄培養外液を前記（ａ）項で回収率の高がつたク
ローン７−２０Ｃ２及び７−２１Ｂ１２からの抗体結合
アフイニテイカラムに供し、種々の溶出剤を用いてコラ
ｒナーゼインヒピターｔ−ｉ出した。第４表で明らかな
如くコラゲナーゼインヒビター活性の回収率はクロー７
７−２０Ｃ２ｈるいは７−２１８１２のどちらかのカラ
ムを用いた場合も６０〜７０チであシ、また溶出剤の種
類の影響も受けなかった。また、各徨溶出剤で溶出した
画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥパターンをみると、主成分は分
子１３２ｘＤのコラゲナーゼインヒビターに−ｉするバ
ンドと、分子量２０　ＫＤ及び６０〜７０ＫＤのバンド
が認められた（添付図面第２図参照）。

第２図中（５）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）は、それぞれ
以下の意味を有する。

（Ａ）：８Ｍ尿素含有３０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５） （Ｂ）　：　３　Ｍロダンカリ含有５０　ｍＭ　）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ１５） （ｃ）　：　Ｉ　Ｍ塩酸グアニジン含有３０ｍＭ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） （ＩＪ：０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，０）
（ｇ）　　抗体結合アフイニテイカラム再使用の検討ウ
シ歯髄培養外液をクローン７−２００２及び７−２１Ｂ
１２からの抗体結合アフイニテイカラムに供し、０．２
Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，０）でコラゲナーゼ
インヒビターを溶出させた後、それぞれのカラムを０．
１Ｍ塩化ナトリウム及び５ｍＭ塩化カルシウム含有３０
ｍＭＩＪスー塩酸緩衝液（Ｐ）（８，０）で充分洗浄し
た。これらのカラムに再度ウシ歯髄培養外液を添加し、
初めの操作と同様にコラゲナーゼインヒビターを溶出さ
せた。後掲の第５表に示した如くクローン７−２００２
のカラムの場合、非吸着画分に培養外液中のコラゲナー
ゼインヒビター活性の１９％が認められた。

一方、クローン７−２１　Ｂ１２０カラムの場合、非吸
着画分中には活性は認められず、溶出画分に６１チの活
性が回収され、−回目の回収率５８％（後掲第４宍参照
）とほぼ同結果が得られた。したがって、本発明におい
てはクローン７−２１１３１２からの抗体がアフイニテ
イカラムのりガンＰとして最適であることが明らかとな
った。

（扮　抗体結合アフイニテイカラムの洗浄効果コラゲナ
ーゼインヒビターの精製度を上昇させる目的でウシ歯髄
培養外液をクローン７−２１Ｂ１２からの抗体結合カラ
ムに供し、種々の溶液で洗浄した後、コラゲナーゼイン
ヒビターヲ溶出させた。後掲の第６表に示した如く■２
Ｍ塩化ナトリウム含有３０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）及び■０．５Ｍ塩化ナトリウム含有０．２Ｍ
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１，０）に
よる洗浄画分はコラゲナーゼインヒビターを含まず、不
純たん白質をある程度含んでおり、洗浄効果が認められ
た。一方、００．５％トリトンＸ−１００及び０．１Ｍ
塩化ナトリウム含有３ＱｍＭ　）　ＩＪスス−酸緩衝液
（ｐ）１７．５）による洗浄ではコラゲナーゼインヒビ
ターは溶出されなかったが、不純たん白質も溶出されず
、その効果は認められなかった。

なお、００．５Ｍ塩化ナトリウム含有酢酸緩衝液（ｐＨ
４，０）及び（５）ｊ　Ｍ塩酸グアニジン含有３０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（−７，５）で洗浄した場合はコラ
ゲナーゼインヒビターが各々２９１２１％溶出され洗浄
剤としては不適であることが明らかとなった。

（ｉ）　　ＤＥ−５２カラムクロマトグラフイーによる
精製 前記（ｆ）項でクローン７−２１　Ｂ　１２からの抗体
結合アフイニテイカラムから得られたコラゲナーゼイン
ヒビターは分子量２０　ＫＤ及び６０〜７０ＫＤの不純
たん白質を含んでいるため、更にＤＥ−５２カラムで精
製した。添付図面、第６図に示した如くコラゲナーゼイ
ンヒビターは（ＥＩ５ｏｍｎ塩化ナトリウム含有１０ｍ
Ｍ１−リス−塩酸緩衝液（ＰＨ８，０）で大部分溶出さ
れ、不純たん白質も除去された。又、２Ｍ塩化ナトリウ
ム含有１０ｍＭＩＪスー塩酸緩衝液（−８，０）でもコ
ラゲナーゼインヒビターは溶出されたが、同時に不純た
ん白質も大部分溶出された。なお、抗体結合アフイニテ
イカラムより得られた不純たん白質含有コラゲナーゼイ
ンヒビターはクルトロダルＡｃＡ３４カラムによるｒル
ｐ適法によっても単一バンドに精製することができた。

実施例　４ ヒトコラゲナーゼインヒビターのアフイニテイ精製 実施例１θ）項（１）に記載したヒト歯肉線維芽細胞（
Ｇｌｎ−１）培養外液７５０ｄを東洋ウルトラフィルタ
ー、ＵＫ−１０を用いて加圧濾過し’１５ｍ１に濃縮し
、０．１Ｍ塩化ナトリウム及び５　ｍＭ塩化カルシウム
含有３０ＩｎＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に対
して透析した。それを上記緩衝液で平衡化したクローン
７−２１　Ｂ１２からの抗体結合カラム（５ｄ）に供し
、上記緩衝液１０ＩＩＩｔで洗浄しく非吸着画分）、次
にカラムを実施例３（８項記載の■２Ｍ塩化ナトリウム
含有３０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ＰＨ７，５）及び■
０．５Ｍ塩化ナトリウム含有０．２Ｍグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１，０）各１０ｔｊで順次洗
浄しく洗浄画分）、最後に０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝
液（ｐ［４２，０）　１０−でコラゲナーゼインヒビタ
ーをカラムから溶出した（溶出画分）。後掲の第７表に
示した如く溶出画分に４２μｉのたん白質が溶出された
。なお、両画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいてウシフラｒ
ナーゼインヒビターと同じ分子１ｔ３２にのバンドと６
０〜７０ＫＤおよび２万以下の不純たん白質が認められ
九〇次にこれら２ｓ類の試料の各画分を５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに供した後、細胞工学１＆２，１０６１〜１０６８（
１９８３）に記載の円部の方法に従ってＦａｂ’（７−
２１Ｂ１２）−人洋ワサビペルオキシダーゼ複合体を用
イてウェスタンブロッティングを行った。なお、上記複
合体はＪ　、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　４　、２０９
〜３２７（１９８３）に記載の石川らの方法に従ってク
ローン７−２１８１２からの抗体ＩｇＧ１及び西洋ワサ
ビペルオキシダーゼを用いて調製した。添付図面、第４
図に示したウェスタンブロッティングの／母ターンで明
らかな如くヒト歯肉線維芽細胞培養外液中にウシ歯髄コ
ラゲナーゼインヒビターに対するモノクロ−チル抗体と
反応するヒトコラゲナーゼインヒビターが存在し、その
分子量はウシ歯髄コラゲナーゼインヒビターの３２ＫＤ
と同一であった。

なお、明細書中の参考資料１について以下に補足的に説
明する。

参考資料１Ａはウシ歯髄の、１Ｂは、ウシ大動脈平滑筋
細胞中のコラゲナーゼインヒビターの免疫組織化学的な
染色図を示すものである。

第１表 ７−３Ｆ１　　　１ｇＣｋ１７Ｘ ７−４Ｆ２　　　　ＩｇＧ１／に ７−５Ａ１　　　　ＩｇＧ１／に ７−６ＣＩ　　　　ＩｇＣ）１／＆ ７−７Ｆ１１　　　　ＩｇＧ１／に ７−８Ｂ２　　　　Ｉｇ（）２ａ／に ７−９Ｂ４　　　　ＩｇＧ１／に ７−１０Ｅ１１　　　　ＩｇＣ）１／に７−１１Ａ５　
　　　Ｉｇ（）１／に ７−１２Ｂ６　　　　ＩｇＧ１／に ７−１４Ｅ９　　　　Ｉｇ（）１／に ７−１５Ｅ８　　　１ｇＧ１／に ７−１８Ｆ３　　　　ＩｇＧ２ｂ／に ７−１９Ｆ６　　　　ＩｇＧ１／に ７−２０Ｃ２１ｇＧ１／ｇ ７−２１　Ｂ　１２　　　　　　　　１ｇＧ１／に７−
２３Ｇ９　　　　　　　　　１ｇＧ１／に７−３Ｆ１　
　　　　　　　　　　　　０．０２８７−４Ｆ２　　　
　　　　　　　　　　０．０６８７−５ＡＩ　　　　　
　　　　　　　　　０．０９８７−６ＣＩ　　　　　　
　　　　　　　　ｌ１１２７８７−７Ｆ１１　　　　　
　　　　　　　０．０５８７−８Ｂ２　　　　　　　　
　　　　　０．００８７−９Ｂ４　　　　　　　　　　
　　　０．０５８７−１０ｇ１１　　　　　　　　　　
０．０５８７−１１Ａ５　　　　　　　　　　　０．０
２５７−１２Ｂ６　　　　　　　　　　　　０．００３
７−１４Ｅ９　　　　　　　　　　　　　０７−１５Ｅ
８　　　　　　　　　　　　０．０２３７−１８Ｆ！ｌ
　　　　　　　　　　　　　α０１８７−１９Ｆ６　　
　　　　　　　　　　α１０８７−２０Ｃ２０，０２！
１ ７−２１Ｂ１２　　　　　　　　　　　０．１７３７−
２！１（）９　　　　　　　　　　　　０．０５！１ク
エルあたジ１５μｙヒトコラゲナーゼインヒビターをコ
ートし１．０μＩの各精製マウス抗クシコラゲナーゼイ
ンヒビター抗体を加えインキュベーションした。

第７表

【図面の簡単な説明】

第１図はウシコラゲナーゼインヒビターの各種溶出剤溶
液中での安定性を示すグラフであシ、第２図はモノクロ
ーナル抗体結合アフイニテイカ２ムより各種溶出剤でウ
シコラゲナーゼインヒビターを溶出した時の８ＤＢ−Ｐ
ＡＧＥパターンを・示す図でＴｏυ、第３図は、ウシコ
ラゲナーゼインヒビターを抗体（クローン７−２１　Ｂ
ｌ　２）結合アフイニテイカラムで精製後、ＤＥ−５２
カラムクロマドグ２フイーを行った時の各画分の５ＤＢ
−ＰＡＧＥパターンを示す図でｉ、ｂ、囚抗体結合アフ
ィニテイカラムからの溶出画分、（Ｂ）ＤＥ−５２力ラ
ム非吸着画分、（Ｃ）０〜５０ｍＭ塩化す）　ＩＪウム
溶液溶出画分、（ｒｊＪ５０〜１００ｍＭ塩化す）　Ｉ
Ｊウム溶液溶出画分、（Ｅ）　１００〜２０００　ｍＭ
塩化ナトリウム溶液溶出画分を示しておシ、第４図は囚
ヒト歯肉線維芽細胞培養外液、（Ｂ）ウシ歯髄培養外液
のそれぞれ抗体（クローン７−２１Ｂ１２）結合アフイ
ニテイカラムからの溶出画分のウェスタンブロッティン
グ図を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ウシコラゲナーゼインヒビターに存在する抗原決定
   基のうちいずれか一つの抗原決定基のみに免疫交差反応
   性を有する各モノクローナル抗体。 ２）ウシコラゲナーゼインヒビターに存在する抗原決定
   基のうちいずれか一つの抗原決定基のみに免疫交差反応
   性を有するモノクローナル抗体を使用することを特徴と
   するコラゲナーゼインヒビターのアフイニテイー精製法
   。