JPS63226294A - セロビオ−スの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 〈産業上の利用分野〉 本発明は、不溶性セルレース及びセルロース含有物質に
セルラーゼ含有酵累剤を作用させて糖化させる除に、短
時間反応後、−担、固形物を洗浄した後、固形画分のみ
を反応させることによるセロビオースの製造法に関する
ものである。

近年食生活の向上により肥満入口が増加傾向にあり、こ
のことが様々な疾患を引き起し、その罹病者数も増加し
ている。このために人々の食生活は変化し、健康志向に
伴って、ダイエツト食品の需要が急増し、その素材を安
定供給する技術の開発が進められている。本発明におい
て製造されるセロビオースはぶどう糖のみで構成される
二糖類であり、トウモロコシの茎の中にも存している天
然物であり食品としての安全性には全く問題がなく、シ
かも通常体内では消化されにくい点でダイエツト食品と
しての機能をそなえている。従ってセロビオースは食品
素材として利用可能である。

一方、原料であるセルロースは地球上で最も大量に生産
されるバイオマスであシ、野菜、果物、穀物等植物性食
品には大部公舎まれている。また一方では農産廃棄物及
び林産廃棄物として未利用セルロースもかな）の部分を
占めている。従って本発明はとれらのバイオマスの有効
利用という点においても産業上極めて重要である。

〈従来の技術〉 セロビオースは工業的にはセルロースの化学的分解によ
って製造されている。一方セルロースの酵素的分解によ
るセロビオース生成も一般に知られているが、市販され
ているセルラーゼ製剤、例工ばトリコデルマ属やアスペ
ルギルス属の生産するセルラーゼ、によるセルロースの
分解によっては主としてグルコースが生成され、セロビ
オースの全生成糖に対する割合は約１５％以下である。

〈発明が解決しようとする問題点〉 セルラーゼは複合酵素系になっていてセルロースがセル
ラーゼによってグルコースまでに加水分解されるには少
なくとも３種の酵素すなわちＣ１゜ＣＸ　　及びβ−グ
ルコシダーゼが関与している。こレラの酵素のうち、Ｃ
４とＣｘはセルロースをセロビオースまでに分解する。

もう１つの酵素のβ−グルコシダーゼはセロビオースを
分解シてグルコースに変換する。従ってβ−グルコシダ
ーゼを阻害、失活又は除去することによってセルロース
からセロビオースのみを生成させることができるはずで
ある。しかし、β−グルコシダーゼのみを選択的に阻害
及び失活させる方法はこれまでに知られていない。β−
グルコシダーゼの分離法についてはイオン交換樹脂を用
いる方法が知られているが、操作が煩雑である。すなわ
ち、安価で工業的にβ−グルコシダーゼを除去する方法
は知られていない。またＣ４とＣＩはセルロースに吸着
するがβ−グルコシダーゼは吸着しにくいことも知られ
ているが、この性質を利用してセロビオースの製法は知
られていない。

く問題点を解決するための手段〉 本発明者らはこのような問題点を解決すべく鋭意検討し
た結果、セルラーゼ複合酵素系のＣＩ＋ＣＸとβ−グル
コシダーゼ間のセルロース吸着力の差を利用して、セロ
ビオースを主成分とセルロース分解産物が得られること
を見い出して本発明を完成するに至った。すなわち、本
発明は、不溶性セルロースまたはセルロース含有物質と
セルラーゼを水性媒体中で保温した後、固形画分を分離
し、該固形画分に水溶性溶液を加え、一定時間保温し該
水溶液中にセロビオースを生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とするセロビオースの製造法である。

本発明方法において用いる不溶性セルロース及び不溶性
含有セルｐ−スとしては、例えば針葉樹広葉樹などから
得られるチップ、のこぎり屑、廃木材などすべての木質
、さらに農業副産物である稲ワラ、モミ、やサトウキビ
、トクモロコシなどの廃棄物、またこれらの脱リグニン
され次／ＩＦルグ及びその粉末などが挙げられる。

ま次、本発明方法において用いる酵素すなわちセルラー
ゼとしては例えばスポロトリクム属、トリコデルマ属、
アスペルギルスＭ、（ルＲツクス属などの菌によって生
産されるセルラーゼが挙げられる。また、本発明におい
ては、これらの酵素はそれぞれ起源の異なるものを単独
で用いてもよく、または２種以上同時に用いてもよい。

酵素源としては一般に市販されているセルラーゼ製剤や
上記菌の培養液やその沖過液を直接使用することもでき
る。

本発明方法におけるβ−グルコシダーゼ除去法としては
セルラーゼと過剰量の不溶性セルロースと金…２〜９、
好ましくはｐＨ３〜７の水性媒体中で０〜６０℃、好ま
しくは３０〜５０℃で０．１〜２４時間、好ましくは１
〜４時間保温した後、ｐ過・遠心分離法などの手段で固
形画分と溶液画分とを分離する。この固形画分にはβ−
グルコシダーゼが若干残存するので、これを出来る限り
除去する目的で、この固形画分を−２〜１０、好ましく
は−３〜７の水溶性溶液を用いて洗浄する。この操作に
よってセルラーゼ製剤中の９５％以上のβ−ｇｌｕｃｏ
ａｉｄａｓｅを除去できる。

本発明方法におけるセロビオースの生成方法としては上
記の洗浄後の固形画分をｐＨ２〜１０好ましくは−３〜
７の水溶性溶液に懸濁し、新たにセルラーゼを加えるこ
となく、２０〜６“０℃で加温する。一定時間後に再び
固形画分と溶液’ｆｒ濾過・遠心分離法などで分離し、
固形画分を再び水溶性水溶液中に懸濁して保温する。こ
の操作を繰返し、得られる溶液画分を集めてセロビオー
ス生成溶液を得る。この溶液中の全生成糖類中のセロビ
オースの含有量は８０ｑ６以上である。この操作では糖
化が進むに従って不溶性セルロース濃度が低下する几め
に、セルラーゼの未吸着部分が増加し、セルラーゼは徐
々に糖化液の方へ移行する。この溶液中の酵素は、反応
後固形画分と溶液を分離する前に新たにセルロースを添
加することで回収できる。また脱装着反応槽を用いれば
連続的にセロビオースを製造することができる。

本発明で用いる水性媒体及び水溶性溶液とは、水、　Ｎ
ａＣ１、ＫＣｌ　＊　（ＮＨ４）２８０４．　Ｎａ２Ｃ
Ｏ３等の塩溶液、りん酸、酢酸、クエン酸、グリシン等
を含む緩衝液を挙げることができる。またこれらの濃度
としてはθ〜０．５　Ｍ　、好ましくは０〜０．１Ｍが
よい。

本発明方法におけるセロビオースの回収方法としては、
最も簡単な操作としてモレビオース生成溶液を０℃以下
に冷却又は凍結させ、セロビオースを不溶化させること
によって分離することができる。また不純物が多く存在
する場合はイオン交換樹脂等で脱塩し、限外濾過法によ
って高分子物質を除き、濃縮後アセトン等の有機溶媒を
添加してセロビオースを不溶化させて分離することがで
きる。

本発明に於ける糖類の検出は薄層クロマトグラフィーを
用いた、すなわち糖溶液をシリカグル薄層にスポットに
溶媒（ｎ−ブタノール：酢酸：エーテル：水＝９：６：
３：１）で展開した後、ナフトレゾルシン−リン酸試薬
を用いて発色させることによって行った。またセロビオ
ースの定量は高速液体クロマトグラフィーを用いた。す
なわち、Ｓｈｏｗｄｅｘ　Ｉｏｎｐａｅｋ　Ｓ−８０１
（φ８ｍＸ　５０ｃｍ　）、カラムを用い、４０℃で水
を用いて溶出させ、示差屈折計を用いて行った。またβ
−グルコシダーゼ活性の１１１定ｕｐ−ニトロフェニル
−β−グルコサイトを基質として、生成するｐ−ニトロ
フェノールを４００　ｎｍでの吸光度を測定することに
より行った。

以下実施例にて詳細に説明する。

実施例 下記の組成の液体培地を調製し、５００ｄ容の坂ロフラ
スコに７５１宛分注し１２０℃で１０分間加熱、滅菌し
友。

培地組成（ｐｉ（６，２） セルロースノｆウダー　　　　５０１１／１ペプトン　
　　　　　　　　　１２　　ｔｔＫＨ２ＰＯ４６＃ （ＮＨ４ン、ＳＯ２４，５Ｎ Ｍｇ５０４−７Ｈ２００，９１ ＣａＣｔ２　・Ｈ２Ｏ０，９１ 尿素　　　　　０．３７ Ｔｗｅｅｎ８０　　　　　　　　　　２　　＃ＺｎＳＯ
４”７）Ｉ２０　　　　　　　　１５　ＷＱ／ｌＦｅＳ
Ｏ４・７Ｈ２０５ｇ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０３ｇ ＣｏＣｔ２　　　　　　　　　　　　６　　＃この培地
にスポロトリクム・セロビオースＡＴＣＣ２０４９４を
接種し４８℃にて７２時間振盪培養し、培養液を戸別し
、炉液を限外沖過膜（ＭＷ＝６０００カット）を用いて
約２０倍に濃縮し、凍結乾燥してセルラーゼの粗酵素粉
末を得た。

次にこのセルラーゼ粉末０．４Ｍｌとセルロース粉末（
ワットマｙ　ＣＣ４１）　５１１とを１００ＷＬＩＯ０
，１Ｍ酢酸緩衝液−５，０に懸濁し５０℃で２時間保温
した後、遠心によシ固形画分と溶液を分離し、該固形画
分を同じ緩衝液５０ｄで３回洗浄した後再び１００Ｗｉ
ｌの同緩衝液に懸濁して５０℃、１６時間保温した。対
照実験として固形画分の分離を行わずに直接セルラーゼ
とセルロースを１６時間保温し、得られたそれぞれの糖
化液中のセロビオースとグルコースを定量した。その結
果を下表に示す。

２時間保温・洗浄　　　０．７５　　　０．１１対照実
験　　０．０１　　０．４５ 実施例２ セルロース粉末（ワットマンＣＣ４１）２０　＃と上記
のセルラーゼ２１１を４００ｉｔＩ！の０．１Ｍ酢酸緩
衝液ｐＨ５，０に懸濁し実施例１と同様な方法で２時間
保温し、同形画分の洗浄を行い１６時間保温した。。

この１６時間インキュベート操作を更に２回（合計３回
）繰返して、全容１１６　（ＩＬＡ’の糖化液が得られ
た。この糖化液（セロビオース６、２　Ｆ　、！ニゲル
コース０．７５．９を含む）をアンバーライトＩＲＡ−
４１０とアンバーライトＩＲＡ　１２０Ｂ　　を用いて
脱塩し、限外濾過（分子量５０００カツト）によシ高分
子成分を除き４０ｍまでに濃縮した。これにア七トン３
０−を添加して４〜７℃に放置し析出した結　晶を濾過
により集め真空乾燥し、４．１ｇの白色粉末が得られた
。この標品中にはグルコースは検出されなかった。

実施例３ 市販のトリコデルマ・コニンギ起源のセルラーゼ（メイ
セラーゼＰ−１）０．５．ｌｉ”ｉセルロース粉末（ワ
ットマンＣＣ４１）１１に実施例１と同じ条件で作用さ
せた。その結果を下表に示した。

セロビオース　グルコース ２時間保温・洗浄　　　０．５３　　０．１２対照実験
　　　０．０６　０．４２ 実施例４ 市販の各種セルロース粉末とスポロトリクム・セルロフ
イルムＡＴＣＣ２０４９４のセルラーゼヲ用い実施例１
と同条件で糖化を行った。その結果を下表に示した。

ＫＣフロックＷ−２００山陽国策ｔ４ルプ＠　　　　０
．９０　　　０．２５／４’／Ｉ／７’７０　ｙ　りＷ
−１１１゜１５　　　０．２６１７ビじ１しくＦＤ）　
　　　　ホロイし心τ打）　　　　　　　　　　０．７
７　　　　０．１３匂臣泗＼１＼０ｒノ９”、　　　　
　＊耳シ戸醒天συ　　　　　　　　　０．４８　　　
　　０．１１〈発明の効果〉 以上詳述したように、本発明方法にょシネ溶性セルロー
スよシ効率よく、選択的にセロビオースを製造すること
が可能になっ友。これはセロビオースが新しい食品素材
としての利用の可能性を示唆し、産業上極めて重要であ
る。

以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 不溶性セルロースまたは不溶性セルロース含有物質とセ
   ルラーゼを水性媒体中で保温した後に水性媒体中の固形
   画分を分離し、該固形画分に水溶性溶液を加え、一定時
   間保温し該水溶液中にセロビオースを生成蓄積せしめ、
   セロビオースを採取することを特徴とするセロビオース
   の製造法。