JPS6324155A - 結合測定法に使用される開裂可能な標識 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、免疫測定法あるいはその他の特異的結合法
、特に蛍光に基づく測定法に関する。とりわけ、可溶化
した特異的複合体１特に免疫複合体を用いて測定を行う
方法に関する。この方法により独立した形の標識部分の
測定１特に、溶液の形で独立した蛍光体の蛍光を定量化
することになるこれら標識の測定が可能になる。

（従来の技術） 定量分析において特異性を確実にするための基礎として
、免疫グロブリン／抗原相互作用の使用が２０年以上も
以前からずっと行われている。そのような種々な分析法
を記述している文献は、数が多くて、すべてを包括する
リストを挙げることは不可能である。この発明が目脂し
ている特別な方法は、標識した免疫複合体またはその他
の特異的複合体の形成およびこの複合体の可溶化を含む
。

この特定の方法に関してさえ、プロトコルが非常に多く
の実験記録（それらは共通したいくつかの特徴をもって
いる）が存在する。

もちろん２その測定法に含まれる少なくとも一つの構成
成分は何らかの仕方で検出されるか、検出可能とならな
ければならない。多くの場合に。

これは、免疫反応のような特異的反応の関与物質の一つ
が、何らかの形で標識されなければならないということ
を意味する。種々の標識が使用されており１例えば、放
射性アイソトープ、蛍光体。

着色物質、酵素（検出可能な生成物または反応物との反
応を触媒するために用いられ得る）、そして視覚化が可
能な巨視的物質さえも用いられている。これら分析法の
うち最も感度の良いものは。

酵素、放射性物質、もしくは蛍光体を利用している。

これらすべての方法において、測定した標識の量が、試
料中に存在する分析物の量の関数でなければならない。

このことは、基本的には、２つの方法に整理することが
できる。標識した構成成分を試料中の分析物と直接的あ
るいは間接的に反応させるか、または、サンプル中の分
析物を、該分析物と特異的に反応する物質をめぐって標
識運搬成分と競合させるかのいずれかである。

はとんどの実験記録において、物理的分離が。

特異的反応によって反応した親和性パートナ−と。

そうではないものとの間で行われなければならない。た
いていの場合、形成された免疫またはその他の複合体は
沈澱するかあるいは固体担持体に吸着するかのどちらか
である。もし沈澱すれば、−般に複合体は遠心分離によ
って１采取される。もし。

固体担持体に吸着すれば、吸着物と反応しない溶液で洗
浄することにより、未反応の物質から複合体が分離され
る。はとんどの分析法において、定量化のために用いら
れる標識は、固相中に含まれそして測定される。しかし
、この発明が目指す分析法では、特異的に形成された複
合体を標識測定前に再溶解する。

そのような一つの実施態様は、米国特許第４　、５４８
．９０８号に記述されており、そこでは、蛍光体を含む
沈澱した全免疫複合体がフルオロメーターにより読みと
るために基剤に溶解されている。この基剤はこの全複合
体を溶かしかつこの複合体から蛍光体を分離するのでは
ないので、この蛍光体がお互いに消失し合うのに十分に
接近し得、それによって２より希薄な蛍光体からも検出
できうる総放射能を減少させる（参照ｅ、ｇ、＋　Ｓｍ
１ｔｈ、　ｏ、ｓ、、　　ら、ΔｎｎＣｌ１ｎ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ　（１９８１）　１８　：　２５３−２７４）
　、それゆえに、可溶化したタンパクにおいてさえも、
蛍光体がお互いに近接しているがゆえに、検出可能な放
出光量には限界が存在する。この問題は標識二者択一形
式に関しても生じている。例えば、酸素活性が、結合さ
れるタンパクによって弱められるかもしれないという問
題、また、　（重大さは劣るが）放射能が１放射性アイ
ソトープが結合する複合体によって吸着されるかもしれ
ないという問題である。

蛍光体または他の標識がそれぞれ再び可溶化され、そし
てそれに結合されるタンパクまたはその他の親和性パー
トナ−から分離され得るかどうかということが、その特
異的複合体がそれ自身再溶解されようがされまいが関係
な（、感度と正確さとの増大に貢献するであろう。

もしもこれが成し遂げられるなら、蛍光体分子あるいは
その他の標識は、独立した一部分として行動し、それゆ
え、それらは検知可能性を増大させ、すなわち消失能を
減少させ、さもなければその検知可能性を変化させる。

Ｃａｒｌｓｓｏｎ等の米国特許第４，２３Ｌ９９９号は
、免疫分析の構成成分に標識が結合する際のく測定のた
めに標識を分離しうる）開裂可能な結合の使用を開示し
ている。その標識は、固体担持体から直接的に分離され
、そして固体物質における標識測定の難しさを克服する
目的で遊離される。蛍光複合体が固体担持体に吸着され
ているところで、その放出光を読みとる蛍光標識測定法
にとって２例えば、固体上の蛍光体濃度が高ければ、光
のレベルが高すぎて、正確な測定ができなくなってしま
う　（日中に星を見ようとするようなものである）。こ
の高い放出の問題を解決するために、多くの提案された
開裂可能な結合が開示されており、その中にはジスルフ
ィド結合も含まれている。これもＣａｒｌｓｓｏｎらの
米国特許第４．２３２．１１９号が、還元によって開裂
することのできるジスルフィド結合によって結合された
標識部分を調製するための好ましい方法を明確に略述し
ている。形成された免疫複合体は、標識の測定の前に、
再度、還元により直接的に開裂される。

Ｃａｒｌｓｓｏｎの明細書には１分析の感度が免疫複合
体表面での開裂しうる結合の入手可能性によって制限さ
れるという不利な点が指摘されている。この反応は、単
層として行わなければならず、さもなければ、大きな複
合体の内部にある結合体の結合が開裂しないことから正
確さが失われるだろう。

ここに示した発明は、標識の分離の前に前可溶化段階を
利用することによりこれらの問題を解決している。

（発明の要旨） この発明は、標識、特に蛍光体を利用した免疫測定法の
ような特異結合測定法（これら標識はこれら測定法の感
度を増大させる）の改良を提供すると同時に、その実行
を容易にするものである。

これらの分析法はすべて免疫複合体のような特異複合体
の形成２例えば沈澱または固体担持体への吸着による反
応混合物からの複合体の分離、および複合体の溶解を含
んでいる。標識は、免疫反応または他の特異反応および
溶解が起こった後に荷せられる条件下で容易に開裂可能
な結合によって。

所望の特異的に反応する成分に結合される。再溶解化後
、その結合は開裂する。このような仕方で。

免疫あるいは他の特異反応試薬によって運ばれた標識の
総量（これは分析物の総量に比例して反応した）が、結
合パートナ−から独立して、全免疫または他の特異反応
複合体から完全に回収されうる。

このように、ある観点では、この発明は１分析物が含有
されていると思われる試料中の１分析物の量を測定する
既知の方法における改良に関する。

一つの形式では、従来の方法は、当該試料を、当該分析
物と特異的に反応する少なくとも一つの物質を含有する
試薬とを反応させること、特異複合体を得ること、液層
からこの複合体を分離すること、そしてこの複合体を溶
解させ、それを可溶化された形で得ることを包含し、該
可溶化複合体が検出可能な標識を含有している。これら
の測定法を実施する従来の方法では、標識の量はこの複
合体から直接的に読みとられる。

この発明の改良は、複合体が成分に結合して得られる結
合体として標識を供給することを包含し。

該結合体がこの分析法と両立しうる条件下で開裂しうる
少なくとも一つの結合を含み、かつ当該標識の量を測定
する前に、開裂可能な結合が、溶解化複合体から標識を
放出させる。

この発明は、この測定法を実行するために適したキット
にも関し、そしてこれらの試薬の調製方法にも関する。

これは、また９本発明方法に適したある標識された結合
体に関し、これら結合物は以下の式のものを包含する： Ｆ−（ＮＨＣＳＮＩＩＣＨｚＣＨｚＳ−５ＣＨ□ＣＨ２
Ｃ０）　ｌＩＸここで電は１〜１５である。

ＦＮＩＩＣ３ＮＩＩＣＨｚＣ１ｌｚＳｔｌおよび（ＦＮ
ＩＩＣＳＮＩＩＣＨｚＣＨｚＳ−）　ｚ本発明の分析物
の測定方法は１分析物を含有すると考えられる試料を、
該分析物と特異的に反応する少なくとも一種の物質を含
有する試薬と反応させ、複合体を得、該複合体を液相か
ら分離し。

そして、該複合体を再溶解して可溶化複合体く検出可能
な標識を有する）を得る方法であって；該標識を該複合
体の要素に対する結合体として提供し、該結合体は、該
分析法と適合する条件下で開裂可能な少なくともひとつ
の結合を有し、そして。

該標識量を測定するに先立ち、開裂可能な結合が。

該可溶化複合体から標識を放出するのを許容する；測定
方法である。

本発明のキットは、上記方法を実施するためのキットで
あり、ａ）検出可能な標識に結合した抗原であり、該結
合物が開裂可能な結合を有する抗原；ｂ）検出可能な標
識に結合した分析物と反応性を有し非Ｉｇ関連の特異的
反応関与体であり、該結合物が開裂可能な結合を有する
反応関与体ｔおよびＣ）検出しうる標識に結合した抗体
くまたはその免疫特異的部分）であり、該結合物が開裂
可能な結合を有する抗体；でなる群から選択される標識
化成分が、適切に包装された形態で、包装された量の適
切な他の試薬および分析を行うための指示書とともに包
含されている。

本発明の化合物は、　Ｆ−（ＮＨＣ５ＮｌｉＣＦＩ２Ｃ
Ｈ２Ｓ−５ＣＩＩ□ＣＨ２Ｃ０）　、Ｘで示される。こ
こで、Ｆは蛍光体であり、Ｘは抗体もしくはその免疫特
異的部分、ビオチン３アビジン、フェリチンおよびレク
チンから選択される特異的反応関与体、そしてｍは１〜
１５である。

本発明の化合物は、また、　ＦＮＩＩＣ３ＮＩ（Ｃ）ｌ
ｚｃｌＩ□Ｓｌ＋および（ＦＮＨＣ３ＮＨＣＨｚＣＨｚ
Ｓ−）ｚ　（ここでＦは蛍光体である）で示される群か
ら選択される。

木遣−肌９ｊ○罰肝撲 Ａ、定義 本文中で使用されているとおり、“分析物と特異的に反
応する物質”とは、測定法の条件下で。

分析物を含有するいかなるものとも反応し得るが。

汚染物質とは反応しない試薬のことを言う。この試薬は
、最も一般的には、抗原／抗体反応の構成成分であり得
る：この試薬は、抗原または抗体のいずれかであり得る
。免疫特異的試薬は、完全なグロブリンかまたはその抗
原に特異的な抗体のいずれかであり得る。もしくは、　
　Ｆ（ａｂ”）２断片のような“その免疫特異的部分”
または特定的に抗原を判別する抗体の他の部分であり得
る。免疫グロブリンまたはその断片を含有するいろいろ
な物質のいずれもが抗原となり得る。抗原は、タンパク
。

炭水化物、または抗原決定基を構成するために十分な大
きさをもつ分子であり得る。抗体は、一般にこのような
部位を含む物質が運搬分子への結合により十分に大きく
なり、免疫原性をもつようになる場合、約１０Å以上の
部位に対して生じ得る。

このことは、しばしば実際に２例えば特異的ワクチンに
おけるより小さなペプチド単位または他の小さな分子に
対する抗体が発生ずる。

“分析物と特異的に反応する物質”は、さらに免疫反応
ではなくて、汚染物質の表面において特異性を保持して
いる反応の成分のことを言う。例えば、一定のレクチン
は一定のタンパク上の炭水化物の部分と特異的に反応し
３細胞表面」二に見られる一定の受容体は特異的にその
標的物質と反応する；ビオチンば、アビジンと特異的に
反応する。

従って、“分析物と特異的に反応する物質”は。

分析物質およびそれと特異的に反応する試薬の間の親和
力反応におけるそれぞれパートナ−を示す−Ｊ’ｆＱ的
な術語として使用されており、抗体および抗体に特異的
な抗原決定基を含有する物質を包含するが、これらに限
定はされない。

さらに一般的には３　“特異的反応関与物”とは２分析
物と反応する上記の試薬もしくは分析物それ自体を言う
。それぞれは、測定法の基礎を成す非常に特異的な相互
作用における相互の対応物である。

“分析法に適した条件”とは１本発明の結°合体におけ
る“開裂可能な”結合の反応性に関係しているので１分
析法の実行を妨げないが、この標識をうま＜遊離させる
条件のことを言う。従って。

結合は十分に安定しているので９分析法の特異反応で形
成される複合体の形成および溶解化の間に。

解離することはないが、他の点ではこの複合体を妨げな
い条件を賦課することにより開裂し得る。

従って、“開裂可能な結合”とは、複合化反応に関与し
ている物質が、標識に結合される結合のことを言う。こ
の結合は、以下に述べられている独立した結合種による
ものか、あるいは特異的な複合化反応に包含される成分
および標識化された物質の間の直接的結合であり得る。

“特異的に開裂可能なリンカ−”とは、二つの独立した
部分を結合するために使用され、そして特定のあらかじ
め決められた条件下で結合体を分離するための開裂部位
を与える物質のことを言う。

本発明において使用するためには、特異的に開裂可能な
リンカ−は、貯蔵および分析の条件下および、特に血清
の存在が関係する条件下で安定でなければならない。従
って、この結合は、中性ｐＨ。

生理学的イオン強度に対して、および免疫またはその他
の複合体が形成される条件下において、安定でなければ
ならない。しかしながら、この結合は開裂特異的条件が
与えられる場合、複合体の分離および溶解化が完了した
時点で、速やかに分裂しなければならない。このような
条件は６酸化試薬および還元試薬、　ｐＨ条件、特異酵
素開裂および特異的開裂反応を促進するその他の試薬を
包含している。

“蛍光体”とは、検出可能な範囲内で蛍光を示し得る物
質またはその一部分のことを言う。典型的には、この蛍
光は可視領域であり、これらは。

普通の定量方法である。一般に使用されている蛍光体の
例には、フルオレセイン（通常、フルオレセインイソチ
オシアネートＣＦＩＴＣ）またはフルオレセインアミン
として（共給される）、ローダミン。

ダンシルおよびウンベリフェロンなどである。

Ｂ、二股追立法 本発明の開裂可能な結合は、標識を分析物それ自体もし
くはそれと直接または間接に特異的に反応する物質に結
合させるために用いられ得る。その第１の例では、標識
化分析物は２分析物と特異的に反応する物質について試
料の未標識化分析物と競合する。この物質に結合された
標識量は、このときその試料における分析物の濃度に反
比例する。あるいは、この分析物と特異的に反応する該
物質は、この開裂可能な結合により該標識と結合し得る
かもしくはこの標識はサンドウィッチ型定量法での分析
物と直接反応する物質と反応的な第２の反応物質に結合
し得る。明らかに、このサンドウィンチは所望に応じて
多くの層に展開され得る。しかし、一般に、そのような
実験記録（プロトコル）は、最初の物質に反応的な標識
化物質との反応に先行する１分析物含有試料とこの最初
の特異的に反応する物質との反応を包含している。

ともかく、この反応連鎖の生成物は、標識を含む沈澱ま
たは吸着複合体であり、該標識の濃度は分析される試料
中の分析物の量に依有する。この沈澱物または複合体は
１次いで可溶化される。

種々のこのようなプロトコルは当該分野ではよく理解さ
れている。例えば、この分析物が抗原である場合には、
普通のプロトコルでは、この試料中の抗原とこの抗原に
特異的な抗体について競合する標識化抗原が提供される
。この複合体は、抗原上の別の抗原決定基と反応するか
７　もしくは本来の複合化において用いられる抗体と反
応する第２の抗体の添加により、さらに不溶化され得る
。

得られた沈澱物は１次いで液相から分離され、そして再
溶解される。

分析物との競合における抗原に標識を付着すること以外
の別の代表的方法においては１分析物抗原に対する抗体
は標識を有し、かつ本来の免疫複合体を形成すべく用い
られる。この免疫複合体は。

次いで別の抗体の添加によりさらに不溶化され得る。別
のより一般的な実施態様においては、この標識は、主た
る複合免疫グロブリンではなく、第２の抗体により運ば
れる。

あるいは、もしこの分析物がそれ自体抗体であれば、こ
の免疫複合体はこの抗体に対し特異的な抗原か、もしく
はこれに対して生じる抗体を用いて形成され得る。もし
抗原が選択されれば、再び。

競合性抗体が標識され得るか、もしくはその抗原自体が
その標識を運び得る。さらに別の場合には。

本来の複合体の成員のうちの一つに対して生じる抗体が
その標識を運ぶ。

前記のすべてが１反応酸分の一つを固体担持体に吸着さ
せるか、もしくは共有結合的に付着させ。

そしてこの担持体に付着した特定の複合体を得ることに
より、改変され得る。例えば、抗原分析物に特異的な抗
体が吸着され１分析されるべき試料で処理され１次いで
この抗原に反応する別の抗体で処理され得る。この標識
は分析物に対する競合物によって、または第２の抗体層
によって運ばれ得る。

ともかく、免疫複合体が形成され１例えば沈澱によるか
、または固体担持体への吸着という効力によって１反応
混合物から分離され２次いで再可溶化された後、この複
合体の成分のうちの一つに標識を有する開裂可能な結合
は、この結合を分断することになる条件下にさらされる
。

本発明の寄与部分は、以下の方法で形成される特定の複
合物の成分を標識化する機構を提供することにある。そ
の方法とは、複合化および洗浄過程中安定のままである
が、この複合体もしくはそのいずれの成分から離れた可
溶化標識を得るための必要により分解されるような方法
である。これは特異的に開裂可能な結合により標識に結
合された特定の反応関与体を利用することにより達成さ
れる。

開裂可能な結合は特定の複合化反応関与体と標識との間
に直接形成され得るが、またはリンカ−を用いて行われ
得る。

一般に、そのようなリンカ−は以下の事項を含む部分に
特徴がある： （１１標識に対し“恒久的”結合を行う第１の反応部位
； （２）特異反応関与体に対する結合のための第１の部位
から物理的に独立した別の部位；そして（３）これら部
位間の開裂可能な結合。

他の改変も、もちろん可能であり、そして（１）または
（２）の性質を欠く場合、すなわちこの開裂可能な結合
が、このリンカ−を一方もしくは他方の標識または特異
反応関与体に結合させる。

独立部分を得るために標識を開裂する利点は標識の性質
に依有する。

蛍光体として、得られる遊離分子は、十分に希釈され自
己消失を克服する。

リンカ−および＋、ｉ′ト（二゛の言。＋＋標識に結合
させるために、アミノ基、チオール基および活性エステ
ルを含む種々の官能基が適当である。特異的複合体関与
体に結合させるために変形もまた可能である。特に、こ
の物質は種々の成分のものであるからである。最も普通
の場合にそうであるように、もし複合化における関与体
がタンパクであれば、ジスルフィド、千オニーチルもし
くはアミド結合を生じ得る官能基が好適に用いられ得る
。

特異的に開裂可能な結合それ自体は、ジスルフィド結合
（例えば、ジチオエリスリトールによって開裂可能）、
ジヒドロキシ部分（過ヨウ素酸塩により開裂可能）、も
しくはプロテアーゼ用の特異開裂部位を提供する一連の
アミノ酸残基を含み得る。

ある種の市販のリンカ−も適切であり得る。例エバ、　
Ｂ５０ＣＯＥＳ（パース　ケミカル　ヵンパニイ）は、
二つの異なるアミノ基を含有する物質とアミド結合を形
成し得るホモリンカ−であり、かつ基本開裂可能部位を
有する。ＤＳＴは同様にアミド結合を形成し得るホモリ
ンカ−であり、がっ過ヨウ素酸により開裂可能である。

ＥＧＳは同様の連鎖化官能基を含むが、ヒドロキシルア
ミンにより開裂され得る。ＤＳＴはアミド結合を形成し
得るホモリンカ−であるが、チオールにより開裂可能で
ある。

あるいは、特異的なジスルフィド試薬および中間体が下
記実施例において述べられるように調製される。

以下の実施例は、この発明を説明する意図をもつもので
あって限定することを意図するものではない。

（以下余白） （実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

（（Ｆ−ＮＨＣＳＮＨＣＨｚＣＨｚＳ−）　ｚ）ピリジ
ン、水およびトリエチルアミン（９：１．５：０、Ｌ　
Ｖ／Ｖ／Ｖ）　（７）溶媒混合ｈ　ヲ１０　ｍｌ、　含
ム丸底７　ラスコに、シスタミンジヒドロクロリド９０
■（０，４ミリモル）を添加して溶解した。フルオレセ
インイソチオシアネート　（ＦＩＴＣ，０，８ミリモル
、　　３２５ｍｇ）を、上記溶液に、少しずつ３０分間
にわたって添加した。この反応混合物を室温にて一晩、
攪拌した。

減圧下で溶媒を除去することにより、オレンジ色の固体
を得た。この物質をｌＱｍＲの水および２５ｍ１の０．
２４酢酸アンモニウム中でスラリーとし７次いで１２−
の水で洗浄した。２ｍｌのＩ　Ｎ　ＮａＯＨに溶解し。

そして６Ｎ）ＩＣＩ　で沈澱させることによってさらに
精製した。この沈澱操作をさらに３回繰り返した。

乾燥後（ＰｚＯｓ、　６０°ｃ）、標題化合物の粗生成
物１９０■を得た。分析用試料は、クロロホルム：メタ
ノール：？ａ水酸化７７モニウＬ　（Ｖ／Ｖ／Ｖ、　１
０：１０：３）を用いるシリカの分離用薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）によって得た。プレートを乾燥し９
次いで酢酸エチル：メタノール：５Ｎ水酸化アンモニウ
ム（Ｖ／Ｖ／Ｖ、　６：３：１）で再展開した。

徽且光折潴遇 ＣＨＳ　　　　ＯＳ 実測値（灰分：５．２９）　５６．２８　３．９７　５
．５３　　−　　１２．６６灰分を補正した値　　５９
．２４　　“４．１８　５．８２　　−　　１３．３３
（（Ｐｙ　　Ｓ　　Ｓ　　ＣＨｚＣＨｚＣＯ）　−Ｆ（
ａｂ’）ｚ　）凍結乾燥したウサギＦ（ａｂ’）ｚ　（
３，０ｍｇ、ジャクソン　イムノ−リサーチ　ラボラト
リーズ）を、０．５ｍｌのＯ，ＩＯＭのトリス＋５ｍＦ
Ｉのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ
）　　（ｐＨ８，０）に溶解した。正確なタンパク濃度
は、　１．４８ｇ−’　１　ｃｍ−’のエクスティンク
ション（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）および分子量９２、０
００のＦ（ａｂ’）２を用いて２８０ｎｍで測定した。

Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−
プロピオネート　（ＳＰＤＰ）　　（３，１■、パース
）は。

１００μｌの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解し。

アルゴン雰囲気下で貯蔵した。６μｌの５ＰＤＰ溶液を
０．５μβずつ１５秒間に１回の割合で、高速で攪拌し
ている４℃のＦ（ａｂ’）ｚ溶液に添加した。最後の添
加後１時間、この混合物を攪拌し１次いで０．１Ｍリン
酸塩、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ６，０）の１２５ｍ１
ずつに対して５回、４℃にて２日間にわたって透析した
。

この生成物は、１μｌのシストアミンヒドロクロリド（
１，３Ｘ１０−”Ｍ　、　　シグマ）を、２４μｌの５
ｐｏｐで標識化したＦ（ａｂ’）ｚ、　７６．１７１の
Ｏ，１Ｍリン酸塩−５ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６，
０）および２００μｆｆの０．０５Ｍトリス緩衝’ＩＦ
Ｉ　（ｐＨ８，０）に添加することによって。

そのタンパクへのＰＤＴＰ類の導入について分析された
。該タンパクから遊離した２−チオピリジン類の数は、
稀釈して修正された元のタンパクの濃度を用い、　７，
６００Ｍ−’ｍ−’のエクティンクションを用いて３４
３ｎｍで測定した。この生成物は１モル当たり１２の結
合ＰＤＴＰ類を有する。同じ方法により、第二の結合物
は、　　Ｆ（ａｂ’）ｚを標識化するために２μｌの上
記５ｐｏｐの乾燥ＤＩ’ｌＦ溶液を用いることにより調
製され、１モル当たり６のＰＤＴＰ類を有する生成物を
得た。

同様の方法により、フェリチン、　ＩｇＥ　、ヤギの抗
ＩｇＥおよびトリョードチロニン（Ｔ３）を含む。

他の特異的反応関与体の結合物が調製される。

Ｆ’ｍ（Ｆａｂ’）ｚ Ｃ（Ｆ−ＮｌｌＣ５ＮＨＣＨｚＣｔｌｚ−５−Ｓ−Ｃ１
ｔｚＣｔｌｚＣＯ）ＩＩ−Ｆ（ａｂ’）ｚ）実施例１に
おいて調製された叶ＤＴＩ＋　２．ｋを。

８０μｐのＤＭＦ、　５０μｌの脱イオン水および１０
μｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム（ｐ）！　９．５）に、
　５０″Ｃに暖めながら溶解することによって、スルフ
ヒドリルモノマー、　Ｆ−ＮｌｌＣＳＮＨＣＨｚＣＨｚ
ＳＨに還元した。得られた溶液を、攪拌しながら、　１
８６０μｌのＯ，ドリン酸塩、　　５ｍＭ　ＥＤＴＡの
緩衝液（ｐＨ６，０）に徐々に添加した。この原料１０
０μｌをアルゴン雰囲気下で１００μ２００．５Ｍ　）
リス（ｐＨ８，８）および１０ｍｔ’ｌのジチオエリス
リトールと混合した。クロロホルム：メタノール、濃ア
７モニ７　（１０：１０：３．　Ｖ／Ｖ／Ｖ）　ニヨる
薄層クロマトグラフィーを用いてこの反応を監視した。

還元が５０％完了して、１５分後、この溶液を、実施例
２で調整した５、３Ｘ１０−’Ｈの（ＰＤＴＰ）　ｂ　
　Ｆ　（ａｂ’　）　２結合物の２００μｌに、アルゴ
ン雰囲気下、室温にて高速で攪拌しながら徐々に添加し
た。最後の添加後、この溶液を３０分間攪拌し１次いで
１０×１ｃｍの６−２５セフアデンクス力ラムに注入し
、　０．１ＦＩリン酸塩、　　５ｍＭ　ＥＤＴＡ　緩衝
液（ｐＨ６，０）で溶離した。タンパク生成物は、その
カラムのボイドボリューム（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ）
で溶離したものを収集した。同（美にして、第２の結合
物を、２００μ２の４．８　Ｘ　１０−’Ｈの（ＰＤＴ
Ｐ）　＋ｚ−Ｆ（ａｂ’）ｚから調製した。

生成物のＦ（ａｂ’）２当たりの結合されたフルオレセ
インの数は、　０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１
９．５）中で、　４９２ｎｍおよび２８Ｏｒ＋ｎ＋によ
るＵＶ−ＶＩＳ分光分析法で゛測定した。フルオレセイ
ンのタンパクに対するモル比は、結合フルオレセインの
７６　、８００Ｍ−’　ｃｎ　−’の４９２ｎｍにおけ
るモルエステインクジョン、同じ＜　２０，５００Ｍ−
’ｃｍ−’の２８０ｎｍにおけるモルエステインクジョ
ンおよび１．４８　ｇ−’　１　ｃｍ−’の２８０ｎｍ
におけるＦ（ａｂ’）ｚのエクスティンクションそして
９２，０００の分子量とから計算した。結合物は、それ
ぞれ１モルのＦ（ａｂ’）ｚ当たり　１．９および５．
７のフルオレセインを有することが見出され、それぞれ
ｐ＋　、、　ｑ−Ｆ（ａｂ’）ｚおよび”　５．７−Ｆ
　（ａｂ’　）２　と命名された（Ｆ’はＦ　−（ＮＨ
Ｃ５ＮＨＣＨｚＣＨ□Ｓ−５ＣＨｚＣＨｚＣＯ）バであ
る〕。

同様の方法により、フェリチン、　ＩｇＥおよびＴ３の
（ＰＤＴＰ）　、、結合体を、還元されたＤＦＤＴＨと
反応させて、それぞれ以下のものを得た。

Ｆｌ、−フェリチン； Ｆ’ｌＩ−ＩｇＥ　　ｉ Ｆ′、−ヤギ抗ＩｇＥ　；および Ｆ′□Ｔ３゜ Ｆ’　＋、　Ｊ（ａｂ’）ｚ溶液６０ｔｔｌを、２０μ
６の１．５Ｍ　　トリス（ｐＨ８，８）および０．１１
’　リン酸塩、　　５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ６，０）中
の１０ｍＭ　ＤＴＨの３μ２と混合した。クロロホルム
：メタノール；濃アンモニア（１０：１０：３　。

Ｖ／Ｖ／Ｖ　）による薄層クロマトグラフィーを用いて
この反応を監視した。開裂反応が９０％以上完了し。

室温で３０分間経過後、パスツールビペノ）（１，４＋
＋＋ｋ）中のセファデックスＧ−２５カラムに注入して
０．１１リン酸塩、　　５ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ
６，０）で溶離した。このカラムのボイドボリュームで
？容離したタンパクのフラクションを集めた。残ってい
る結合されたフルオレセインの量をｕｖ−ｖｒｓ分光分
析法（前記）によって測定した。フルオレセインの。

タンパクからの開裂は９４％完了していた。同じ方法に
より、Ｆ’　ｓ、　ｔ−Ｆ（ａｂ’）　Ｚからの開裂の
程度は９８％と測定された。

Ｆ’　ｌ、−Ｆ（ａｂ’）ｚ結合体（１０μｊ２）およ
び１０μｌのヤギ抗ウサギＩｇ　（ウェスターン　ケミ
カル）を６本の分析試験管に入れた。リン酸ナトリウム
０．ＯＩＭ−０，８７％塩化ナトリウム−０，１％アジ
化ナトリウム。

ｐＨ７，２（１０μ（ｌ　ＰＢＳ）および１１０μｆの
ヤギ抗ウサギｔｇを６本の対照試験管に入れた。室温で
１５分間培養後、８００μｌのＰＢＳを各試験管に添加
した。

各試験管を３５０Ｏｒ、ｐ、ｍで３０分間遠心分離した
。上澄液をデカントして除き、３本の分析試験管および
３本の対照試験管とから得たベレットに、　２．４６Ｘ
ＩＯ−５ＭのＤＴＥを含有する０、０３４リン酸塩、　
０．８７％塩化ナトリウム、　０．１０％のアジ化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ１，１，９）の１．０Ｍを加えて溶
解した。

残りの３木の分析試験管および３木の対照試験管のベレ
フｉ〜を、　ＤＴＥを含有しない同じ緩衝液に溶解した
。全試験管を室温で１時間培養し、インパルス・蛍光計
（ＳＣＬＡＶＯ）で測定した。同じ方法を用いてＦ”Ｓ
、　７Ｆ　（ａｂ”）２結合体を分析した。結果は。

相対蛍光強度（ＲＦＩ）の平均値とてしてまとめて次に
示す。

特異的な反応関与体としてフェリチンを用いて実施例３
において合成した。結合された標識試薬を競合的試薬と
して用いる。次いで、既知量を採取した血清のい（つか
を、該試薬を含有する２０ｔｔｔ！の炭酸塩緩衝液０．
ＯＩＭ（ｐｌ＋８．６）とともに３７“Ｃにて４時間培
養することによってフェリチンの分析がなされる。これ
に、ヤギ抗フェリチン血清およびウサギ抗ヤギＩｇ血清
との混合物を含有する。リン酸塩で緩衝された塩水の２
０μｌを添加する。次いで培養を行い免疫複合体を形成
させ、この混合物に。

ポリエチレングリコール（分子ｆｆ１８，０００）の冷
２０％水溶液の１００μｐを添加し、得られた沈澱を遠
心分離により分離した。上澄液を除去した後、この沈澱
をリン酸塩水溶液の緩衝液（ｐＨ１１，９）に溶解した
。

溶解された複合体は、　１．ＯＯ＋ｎＭのジオエリスリ
トールを含有する還元試薬２５μρで処理される。得ら
れた溶液は、解離された２−（５−フルオレセイニルウ
レイド）エチルメチルカプタンを含有し。

蛍光を測定するためフローセルに入れる。

実施例３において鋼製したＦ’、Ｔ３を試薬として用い
る。マクロビーズに付着させたヤギ抗Ｔ３抗体により試
料を処理して免疫複合体を得ることによって、試料に含
有されているＴ３の量を分析する。

３７℃にて１時間培養後、試料をリン酸塩緩衝の塩水で
洗浄する。次いで、ビーズの免疫複合体を塩基に溶解し
、溶解した複合体を上記と同様にジチオエリスリトール
で処理し、蛍光を測定する。

ミクロタイターウェルを、標識化されていないヤギ抗Ｉ
ｇＥ抗体で被覆し、試料で処理してＩｇＥ含有量を分析
する。洗浄後、このウェルを、特異的反応物質としてヤ
ギ抗ＩｇＥを用いて調製された実施例３の試薬で処理す
る。このウェルを再び洗浄し２次いで塩基で処理し、複
合体を溶解する。この複合体を、　　２．５Ｘ１０−５
Ｍのジチオエリスリトールを含有する溶液と反応させて
蛍光体を、２−（５−フルオレセイニルウレイド）エチ
ルメルカプタンとして放出させる。

去隻勇主 Ｔ３Δ皿冗。

実施例３において調製したＦ′ヨーＴ３を試薬として用
いる。試料のＴ３の量を分析する。試料、　Ｆ’、、−
Ｔ。

およびヤギ抗Ｔ、抗体溶液の混合物を、抗ヤギＩｇ抗体
で被覆した反応容器内に導入する。培養後、この容器を
洗浄し、免疫複合体を塩基に溶解し、そして溶解した複
合体を、上記と同様にジチオエリスリトールで処理し、
蛍光を測定する。

（発明の要約） 標識化され、可溶化された特異的結合複合体の検出に基
づく分析方法が１分析法および溶１夜状複合体に適した
条件下で開裂し得る結合によってこの標識を上記複合体
の成分に結合させることによって発展された。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分析物を含有すると考えられる試料を、該分析物と
   特異的に反応する少なくとも一種の物質を含有する試薬
   と反応させ、複合体を得、該複合体を液相から分離し、
   そして、該複合体を再溶解して可溶化複合体（検出可能
   な標識を有する）を得る、分析物の量を測定する方法で
   あって、該標識を該複合体の要素に対する結合体として
   提供し、該結合体は、該分析法と適合する条件下で開裂
   可能な少なくともひとつの結合を有し、そして、該標識
   量を測定するに先立ち、開裂可能な結合が、該可溶化複
   合体から標識を放出するのを許容する、 測定方法。 ２、前記分析物が抗原であり、免疫複合体の形成が、 ａ）試料を、標識に結合（その結合物は開裂可能な結合
   を有する）した抗原の既知量と混合し、そして、該混合
   物と、該抗原に対する抗体（またはその免疫特異的部分
   ）とを反応させること；ｂ）抗原を含有する試料を、標
   識に結合（該結合物は開裂可能な結合を有する）した抗
   −抗原抗体（またはその免疫特異的部分）と混合するこ
   と；および、 ｃ）該試料を、抗−抗原抗体および標識に結合（その結
   合物は開裂可能な結合を有する）した標識化抗−抗原抗
   体（またはその免疫特異的部分）と混合すること； でなる群から選択される方法で行われるか、または； 分析物が抗体（またはその免疫特異的部分）であって、
   免疫複合体の形成が、 ａ）該試料を、標識に結合（その結合物は開裂可能な結
   合を有する）した該抗体（またはその免疫特異的部分）
   の既知量と混合し、そして、該混合物を、該抗体（また
   はその免疫特異的部分）に対する抗原と反応させること
   ； ｂ）抗体（またはその免疫特異的部分）を含有する該試
   料を、該抗体（またはその免疫特異的部分）と免疫反応
   性を有し、標識に結合（その結合物は開裂可能な結合を
   有する）した抗原と混合すること； および ｃ）該試料と、該抗体（またはその免疫特異的部分）と
   免疫反応性を有する抗原、および該抗原と反応性を有し
   、標識に結合（その結合物は開裂可能な結合を有する）
   した異なる抗体（またはその免疫特異的部分）を混合す
   ること； でなる群から選択される方法で行われる、 特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、特異的複合体の該液相からの分離が、沈澱、次いで
   遠心分離もしくは濾過すること；または、該複合体を固
   体担持体に結合させ次いで該担持体を液相との接触から
   除去することにより行われる特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 ４、ａ）検出可能な標識に結合した抗原であり、該結合
   物が開裂可能な結合を有する抗原； ｂ）検出可能な標識に結合した分析物と反応性を有し非
   Ｉｇ関連の特異的反応関与体であり、該結合物が開裂可
   能な結合を有する反応関与体；および ｃ）検出しうる標識に結合した抗体（またはその免疫特
   異的部分）であり、該結合物が開裂可能な結合を有する
   抗体； でなる群から選択される標識化成分が、適切に包装され
   た形態で、包装された量の適切な他の試薬および分析を
   行うための指示書とともに包含される、特許請求の範囲
   第１項に記載の方法を実施するためのキット。 ５、前記開裂可能な結合がジスルフィド結合であり、前
   記標識が蛍光体である特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 ６、Ｆ−（ＮＨＣＳＮＨＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｓ−ＳＣＨ＿
   ２ＣＨ＿２ＣＯ）＿ｍＸここで、Ｆは蛍光体であり、Ｘ
   は抗体もし くはその免疫特異的部分、ビオチン、アビ ジン、フェリチンおよびレクチンから選択 される特異的反応関与体、そしてｍは１〜 １５である で示される化合物。 ７、Ｆがフルオレセイニルである特許請求の範囲第６項
   に記載の化合物。 ８、ＸがウサギＦ（ａｂ’）＿２フェリチン、ＩｇＥ、
   ヤギ抗−ＩｇＥおよびＴ＿３から選択される特許請求の
   範囲第６項に記載の化合物。 ９、ＦＮＨＣＳＮＨＣＨ＿２ＣＨ＿２ＳＨおよび（ＦＮ
   ＨＣＳＮＨＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｓ−）＿２ここでＦは蛍光
   体である で示される群から選択される化合物。 １０、Ｆがフルオレセイニルである特許請求の範囲第９
   項に記載の化合物。